ASPECTOS GENERALES DE LA INMUNOHEMATOLOGIA

DIPLOMADO EN HEMATOLOGA Y BANCO DE SANGREMDULO IV (13 de Setiembre de 2015)CLASE 1

ASPECTOS GENERALES DE LA INMUNOHEMATOLOGIA

Dr. Carlos Esquerre Aguirre

FUNDAMENTOS DE LA INMUNOGENETICALa inmunogentica es la rama de la gentica que estudia factores genticos que controlan la respuesta inmunitaria, as como la expresin de otras caractersticas hereditarias de naturaleza antignica, incluyendo los antgenos de los grupos sanguneos, FORMA LA BASE DE LA GENETICA.

ALELOS

Son los responsables de la especificidad de los antgenos.

Por ejemplo: los antgenos principales del sistema ABO son: A, B y O y sus alelos son: A1 B1 O1.

CROMOSOMAS

Son estructuras organizadas compuestas de ADN

En ellos se encuentra el cdigo gentico para la produccin de sustancias particulares de grupos sanguneos y otras caractersticas.

La parte del cromosoma que posee el cdigo para la sucesin de cidos aminados se llaman ALELOS.

Durante la reproduccin cada gameto cede al nuevo organismo un conjunto de cromosomas (23 pares cromosomas).

ABO9q34.1 q34.2ABORh1p36.2 p34RHD/RHCE

LA INMUNOHEMATOLOGA

Es la parte de la hematologa que estudia procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relacin con los elementos sanguneos. Uno de los aspectos ms importantes de la inmunohematologa es el estudio y cuantificacin de los grupos sanguneos eritrocitarios que son componentes antignicos presentes en la superficie de los hemates, ya que se relaciona directamente con la teraputica transfusional y la prevencin de accidentes hemolticos graves.

ANTGENOanticuerpoLos antgenos de los grupos sanguneos pueden ser protenas o glicoprotenas estructurales de membrana del eritrocito.

Llamadas tambin inmunoglobulinas, son protenas plasmticas que se ubican en la fraccin gammaglobulinas, producidas por el sistema inmunolgico para reconocer y unirse al antgeno para su destruccin.

Estn formados por cadenas de Aminocidos unidas por puentes peptdicos.

Son Sintetizados por los linfocito B maduros

Inmunoglobulinas: Ig E, Ig A, Ig D, Ig G e Ig M.

Constituyen alrededor del 73% de las inmunoglobulinas totales.Por su tamao, atraviesan con facilidad la placenta, pudiendo causar LA ENFERMEDAD HEMOLITICA DEL RECIEN NACIDO.No producen aglutinacin de los glbulos rojos antignicos; solo los recubre y sensibiliza.Constituyen alrededor un 8% de las inmunoglobulinas totales.Aglutinan con facilidad a los glbulos rojos. Debido a su alta valencia.Durante las reacciones antgeno - anticuerpo , activan el complemento, causando hemolisis de los eritrocitos

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PRINCIPIOS DE LA REACCIN ANTGENO - ANTICUERPO

En las reacciones antgeno-anticuerpo se distinguen 2 fases: La primera consiste en la unin del antgeno con el anticuerpo .La segunda en las manifestaciones que resultan de dicha unin. La clave de la unin est en la complementariedad entre Ag y Ac: si sta es buena, se produce la exclusin de agua, lo que permite un acercamiento estrecho entre epitopo y paratopo, lo que determina altas fuerzas de unin.

Caractersticas de la reaccin antgeno anticuerpoREVERSIBILIDAD: Dado que la reaccin se debe a fuerzas no covalentes es reversible y por lo tanto se ve afectada por factores como la temperatura, la proporcin ag-ac, el pH y la fuerza inica.ESPONTANIEDAD: La reaccin ag-ac no requiere energa adicional para poder efectuarse.RAPIDEZ: Es la velocidad con la que ocurre la primera etapa de la reaccin. La segunda etapa, incluyen todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interaccin: precipitacin, aglutinacin, floculacin, hemolisis, etc.

ESPECIFICIDAD: Es la capacidad de un anticuerpo de combinarse con un solo determinante antignico, o la capacidad de una poblacin de anticuerpos para reaccionar con un solo antgeno

La mayora de las tcnicas empleadas en banco de sangre para detectar las reacciones antgeno anticuerpo se basan en :

HemolisisAglutinacin TIPOS DE REACCION

HEMOLISISLa hemolisis de los eritrocitos mediada por inmunidad, depende de:La clase de InmunoglobulinaLa capacidad del anticuerpo de unirse al complementoLa interaccin con el sistema reticuloendotelial (sistema mononuclear fagocitico)El mecanismo de La hemolisis inmune determina el lugar de la hemolisis: H. intravascular: caracterstico de Ac IgM, mediada por complemento.H. extravascular: caracterstico de Ac IgG, mediada por sistema mononuclear fagocitico.

AGLUTINACIN

Anticuerpo

Los antgenos situados en la membrana de los hemates reaccionan con los anticuerpos y el resultado de la reaccin produce aglutinacin.Antgeno

Se definen en dos fases: Sensibilizacin: Unin de anticuerpos con antgeno, es reversible y la fuerza de unin depende de la exactitud de encaje entre el antgeno y el anticuerpo. Se ve influenciado por los siguientes factores:

Temperatura: IgM a 4C e IgG a 37CpH: 6 8Fuerza Inica del medio: Baja fuerza inica incrementa la tasa de unin de Ac. Esta es la base de la pruebas para deteccin de Ac que emplean LISS.

2. Aglutinacin:Se debe al entrecruzamiento que los Ac facilitan entre las clulas.La aglutinacin de GR cubiertos tanto por IgM e IgG aumenta por centrifugacin.

La aglutinacin de glbulos rojos en suspensiones fisiolgicas puede ocurrir por dos mecanismos bsicos:

Aglutinacin especificaPartiendo del concepto que una suspensin de glbulos rojos en soluc. Salina fisiolgica constituye un sistema estable; entonces diremos que:

Cuando la estabilidad es cambiada por la introduccin de anticuerpos especficos que se fijan con antgenos de membrana eritrocitaria, produciendo la aglutinacin de estas clulas.

Aglutinacin inespecficaLlamado fenmeno de panaglutinacinLos glbulos rojos (no sensibilizados por los anticuerpos) son aglutinados por sustancias presentes en el medio de la suspensin. Como: - Detergentes - Iones metlicos: Cr, Al,Fe - Macromolculas: albumina, polibreno, dextran, etc.

Proceso fsico - qumico de la aglutinacinEl factor mas importante en este proceso es:La distancia media que separa los glbulos rojos en suspensinEsta distancia puede ser disminuida por la adicin de anticuerpos u otras sustancias al medio, hasta un punto critico en que ocurre la AGLUTINACION.

POTENCIAL ZETALa diferencia del potencial elctrico creado entre la doble capa de iones positivos cerca del glbulo y el medio con iones de sodio y cloruro se denomina potencial Z.

La fuerza de repulsin entre glbulo rojo, en un medio salino depende del valor del Potencial Z

D: constante dielctrica del medioU: fuerzo ionica del medio de suspensionY : carga elctrica del G.R.

Por ello, al considerar la aglutinacin especifica de los hemates hay que tener en cuenta, como mnimo tres variables:

La carga elctrica de la superficie del hemate (y)La constante dielctrica del medio (que constituye una determinacin relativa del estado de ionizacin) (D)Fuerza inica del medio de suspensin ( u)

En la ausencia de agentes aglutinantes, la fuerza de repulsin predomina y mantienen la suspensin globular estable en medio salino.

Desde el punto de vista fsico - qumico la aglutinacin ocurre por la agregacin de los glbulos rojos, cuando la distancia entre ellos se reduce hasta un valor mnimo.

Esta distancia depende de los valores de dos fuerzas antagnicas:

Fuerza de cohesin: Es la tensin interfacial que tiende agregar a los glbulos rojosFuerza de repulsin: debida a los escudos de cargas positiva (capa doble) creados alrededor de los glbulos rojos.

El potencial zeta de un sistema puede ser cambiado de dos maneras:Por la reduccin de la carga elctrica de la membrana del hemate (debidos al tto de GR con enzimas proteolticas - tripsina, bromelina, ficina, papana - y efecto de fijacin de Ac)2. Cambios en la composicin del medio (cambios de la fuerza inica y de constante dielctrica del sistema -macromoleculas)Los parmetros utilizados para comprender las reacciones de aglutinacin son:

Si la carga elctrica del glbulo rojo disminuyeSi la constante dielctrica del sistema aumentaSi la fuerza inica del medio aumenta

El potencial zeta puede bajar o aumentar la aglutinabilidad del sistema, o hasta puede promover la aglutinacin de los GR en suspensin.

Factores que intervienen en la reaccin antgeno - anticuerpoDisminucin del potencial Z.Tipo de inmunoglobulina. Numero de antgenosUbicacin de los antgenosTemperaturaProporcin de Ag/AcpHCambios en la fuerza Inica del medioSENSIBILIZACIONAGLUTINACION

PHLa mejor sensibilizacin se logra a un pH entre 6 8Fuera de estos limites se puede observar hemolisis de los G.R. para valores extremos del ph o una inhibicin de la aglutinacin.

TEMPERATURA

La temperatura ideal para promover la reaccin antgeno anticuerpo depende de la naturaleza del anticuerpo.

Los anticuerpos fros: Ig M, reaccionan a 4C

Los anticuerpos calientes: Ig G, reaccionan a 37 C. Factores que afectan la sensibilizacin

PROPORCIN Ag/Ac

La sensibilidad del test se incrementa cuando la concentracin del anticuerpo es ms alta que la del antgeno.

CAMBIOS EN LA FUERZA IONICA DEL MEDIO

Es determinado por la cantidad de iones Na+ y Cl-. El plasma tiene alta concentracin en cloruro de sodio.La presencia de estos iones en el medio bloquea las cargas superficiales de los glbulos rojos y los anticuerpos. Una capa de Na+ es formada alrededor de ellos es por ello que su unin es ms difcil.Pero si la concentracin de los cationes alrededor de los glbulos rojos disminuye, este permite a las molculas de anticuerpos tener ms fcil acceso a los lugares antignicos de la membrana eritrocitaria aumentando as la sensibilizacin. De acuerdo a la ecuacin del potencial Z: donde hay un aumento de la fuerza inica (u) lleva a una disminucin del potencial zeta de la suspensin de glbulos rojo lo que favorece la aparicin de aglutinacin.

Factores que interviene en la aglutinacin Puede ser alterado por la variacin de la carga de los hemates o por la variacin en la concentracin de cationes libres en el medio de suspensin.Cuando la unin de antgeno-anticuerpo sobre la superficie de la clula, rompe el potencial Z hace ms fcil la unin de un eritrocito con otro.

TCNICAS SEROLGICAS Esenciales para la deteccin e identificacin de aloanticuerpos, antianticuerpos, fenotipaje de GR, diagnostico de anemias hemolticas (AHAI) y diagnostico de enfermedades hemolticas del RN (EHRN).

Tcnicas de produccin artificial de la aglutinacin de. G.RLos principales elementos para producir aglutinacin son:

LISS: Refuerza la interaccin Ag Ac durante la incubacin, aumentando la velocidad de asociacin y permitiendo acortar el tiempo de incubacin de 60 minutos a 10 15 minutos sin sacrificar la sensibilidad

SUSTANCIAS MACROMOLECULARES: Albumina al 20 30%, y el polietilenoglicol (PEG), aumenta su constante dielctrica de la suspensin, disminuyendo el escudo de cargas positivas, debido a esto, baja el valor del potencial y disminuye la fuerza de repulsin interglobular; favoreciendo la aglutinacin.Posee una extremidad positiva(amnica) y otra negativa(carboxilica) y se polarizan en el campo elctrico de los G.R.

Enzimas proteolticas: La tripsina, la papana, la bromelina y ficina son las principales enzimas proteolticas, capaces de sacar de la membrana eritrocitaria fragmentos peptdicos de glucoprotenas de membrana conteniendo molculas de acido sialico, disminuyendo la carga negativa de los GR.

Potencial z es directamente proporcional a la electronegatividad del glbulo rojoTcnicas de produccin artificial de la aglutinacin de G.R.

TRATAMIENTO DE HEMATIES POR ENZIMAS PROTEOLITICASHematiesPotencial Zeta(mv)Reduccion del potencial Z(%)No tratados - 19.60.0Tripsina- 15.624.4Bromelina- 14.128.1Papaina- 10.148.0Ficina- 9.053.9

PRUEBAS SEROLOGICAS PARA ESTUDIOS INMUNOHEMATOLOGICOS

SEROLOGIA EN TUBO

TECNICA DE GEL - CENTRIFUGACIN