CULTIVO CONTINUO

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS

CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO

I.- RESUMEN

Se desarrollo el Cultivo Celular Continuo Aireado de la Levadura Kluyveromyces

marxianus ATCC-16045, la cual se inicio desde la resiembra del medio de mantención

usando Extracto de Levadura 10 gr, Extracto de malta20 gr, Peptona 20 gr, Agar 20 gr

la cepa utilizada estaba refrigerada.

Se uso como sustrato limitante la sacarosa, siendo la concentración celular máxima final

esperada de 3g/l el pH es de 5.98. Se empezó con la preparación de los medios de

activación sacarosa 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l y la solución de sales (K2HPO4 =

5g/l (NH4)2SO4 =5 g/l ; MgSO4.7H2O= 0.5 ;g/l )y HCl =0.57 g/l se llevo al shaker para

la fermentación obtener el cultivo por lote. Del cual se obtuvo la grafica de la cinética

de crecimiento microbiano, curva de calibrado de biomasa y azucares reductores

(sacarosa) por medio del método de DNS. La grafica de la cinética de crecimiento nos

sirvió para poder observar en que momento la levadura alcanzo los 2/3 de su

crecimiento exponencial, para este fin se prepararon dos medios de fermentación uno

que sirvió como control para el incremento de la biomasa y el otro para la experiencia

en el Quimiostato.

Luego se prosiguió con la puesta en marcha del Quimiostato, el cual se inicio con el

montaje e instalación de este sistema y su respectiva esterilización, luego se prosiguió

ala inoculación del medio liquido del Quimiostato y se controlo el lote hasta que este

alcanzara los 2/3 de crecimiento logarítmico el cual fue al cabo de 3 horas, dato que se

igual al obtenido en el cultivo celular por lote. Paralelo a esto se prepararon los medios

de alimentación para los estados estaciones a volumen ya calculado.

De aquí en adelante se prosiguió con el muestreo y análisis de X y S para los cinco

estados estacionarios, siendo estos tomados según los tiempos calculados 43h

(F=0,8ml/min), 29h (F=1,2ml/min), 19h (F=1,80ml/min) ,14h(F=2,5ml/min),

12h(F=3,0ml/min) para cada estado. Con estos datos se obtuvo la curva característica

del cultivo continuo con cinco estados estacionarios. Paralelo a la toma de muestras del

cuarto y quinto estado estacionario se prepararon los medios de fermentación bajo

limitación de nitrógeno reduciéndolo a la mitad (( NH4)2SO2 =1g/l) y perturbación del

1


estado estacionario por aumento de la concentración de sacarosa(15 g/l) en volúmenes

ya calculados.

La toma de la muestra bajo limitación de nitrógeno con un flujo de 2.5ml/min. Nos

sirvió para comprar este punto con el obtenido en la curva característica de la grafica de

los e. e. siendo el resultado que el hecho de limitar al microorganismo de la fuente de

nitrógeno no afecta considerablemente su crecimiento. La perturbación nos indica que a

niveles altos de la fuente de carbono el microorganismo mantiene un equilibrio en su

crecimiento.

Se preparo el medio para el método de lavado en volumen necesario dado por la

velocidad de dilución y el flujo requerido (F=12ml/min ) estos datos son un tiempo de

4 h. El método de lavado nos permitió determinar la velocidad específica de

crecimiento máximo, Finalmente se prosiguió con el desmontaje y lavado cuidadoso

del sistema continuo montado en el laboratorio de Bioprocesos.

II.- INTRODUCCIÓN

La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de

crecimiento entre 24 y 48ºC. Solo unas pocas (2%) son psicrófilas con una temperatura

máxima de crecimiento por debajo de 24ºC, pero mayor es el número de las levaduras

que tienen la temperatura óptima de crecimiento por debajo de 20ºC. No hay levaduras

que puedan crecer a 50ºC y solamente unas pocas pueden desarrollar cerca de 0ºC, entre

las que se encuentran Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii y Pichia

membranaefaciens. Por otra parte, Kluyveromyces marxianus crece a 48ºC. En

general, la presencia de etanol o bicarbonato aumenta la temperatura mínima de

crecimiento (Déak & Beuchat 1996).

La mayoría de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una actividad de

agua mínima de 0,90-0,95. Sin embargo Zygosaccharomyces rouxii puede crecer sobre

substratos azucarados a una actividad de agua igual a 0,62, pero son pocas las levaduras

que desarrollan en presencia de altas concentraciones de azúcar o sal. En general las

2


levaduras toleran mejor altas concentraciones de azúcar que de sal.(Déak & Beuchat

1996).

La mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren un

medio

ligeramente ácido con un pH de 4,5 a 6,5. las células son inactivadas a presiones entre 7

y 20 MPa, a 25-35°C (Déak & Beuchat 1996).

Las levaduras son organismos aerobios y aunque unas especies son fermentadoras otras

no lo son, como por ejemplo los géneros Cryptococcus y Rhodotorula. Saccharomyces

y unos pocos géneros más, son fermentadores enérgicos de los azúcares pero pronto

detienen su crecimiento y multiplicación por falta de oxígeno.

Solo unos pocos glúcidos, principalmente hexosas y oligosacáridos, pueden ser

fermentados por las levaduras, pero el rango de compuestos que pueden asimilar es

mucho más amplio incluyendo además, pentosas, alcoholes, ácidos orgánicos,

aminoácidos y glicósidos.

La utilización de nitratos está confinada a ciertas especies de levaduras, mientras que las

fuentes comunes de nitrógeno son amonio, urea y aminoácidos. Muchas especies

sintetizan todas las vitaminas necesarias pero otras requieren biotina y otros

compuestos.

Los aceites esenciales de ajedrea, ajo, canela, cebolla, clavo de olor, orégano, pimienta

de Jamaica y tomillo son inhibidores de varios géneros de levaduras. El aceite esencial

de ajo inhibe a una concentración de 25 mg/L y los de cebolla, orégano y tomillo a 100

mg/L. La cafeína presente en cacao, café, nuez de cola, yerba mate y té, inhibe el

crecimiento de las levaduras. Sin embargo, las levaduras casi no son afectadas por 20

mg de taninos/mL (Davidson 1997). El agua desionizada con 0,188 mg ozono/L causa

la reducción instantánea en 5 unidades logarítmicas del número de células vivas por mL,

de la levadura Z. bailii (Restaino et al. 1995)

3


III.- OBJETIVOS:

3.1 Objetivos generales:

Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular continuo en quimiostato

empleando una cepa de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045

3.2 Objetivos específicos:

Diseñar medio de cultivo.

Activar células y desarrollar el inóculo.

Obtener la curva característica del cultivo continuo considerando al menos

cinco estados estacionarios.

Obtener y caracterizar un estado estacionario bajo limitación por nitrógeno.

Perturbar un estado estacionario mediante aumento de la concentración del

nutriente limitante en la alimentación y su seguimiento hasta el nuevo estado

estacionario.

Determinar la velocidad específica máxima de crecimiento mediante

operación de lavado.

IV.- FUNDAMENTO TEÓRICO

4.1 Las levaduras : Son los microorganismos más antiguamente conocidos,

mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los consumidores. Las

levaduras son raramente tóxicas o patogénicas y pueden ser utilizadas en la

alimentación humana. A pesar de que su contenido de proteínas no excede el 60%,

su concentración de aminoácidos esenciales tales como la lisina, el triptofano y la

treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de metionina y cisteina.

4


Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su contenido en ácidos

nucleicos es bajo ya que está en el rango de 4 a 10%.

En cuanto a su tamaño las levaduras son más grandes que las bacterias, lo que

facilita la separación.

CUADRO DE CLASIFICACION

Género

Especies mas frecuentes

Características

LEVADURAS

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyce unisporus

Levaduras no fermentadoras de la

lactosa, que producen alcohol y

CO2 a partir de glucosa.

Candida kefir

Kluyveromyces marxianus var.

marxianus.

Levaduras fermentadoras de la

lactosa.

Responsables de formación de

CO2 y contribuyendo al

característico sabor y aroma.

Fuente : SCHENEIDER, A; MERKLE, R.; CARVALHO, M.; JONAS, R.;

BURLAN, S. Oxygen tranfer on b galactosidase production by Kluyveromyces

marxianus using Sugar Cane molasses as Carbon Source. Biotechnol. Letters. 23

(7):547-550. 2001

4.1.1 Levaduras (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045)

Estas levaduras pertenecen a la división Ascomycotina. Las levaduras de este

género se reproducen por gemación multilateral, es una de las levaduras que más

abunda en los productos lácteos, son los microorganismos más antiguamente

conocidos, mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los

consumidores. Las levaduras son raramente tóxicas o patogénicas y pueden ser

utilizadas en la alimentación humana. A pesar de que su contenido de proteínas no

excede el 60%, su concentración de aminoácidos esenciales tales como la lisina, el

triptofano y la treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de

metionina y cisteina. Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su

contenido en ácidos nucleicos es bajo ya que está en el rango de 4 a 10%. En

5


cuanto a su tamaño las levaduras son más grandes que las bacterias, lo que facilita

la separación.

Las levaduras son hongos unicelulares, con una morfología característica esférica

u ovalada.

Figura 4.1.A : células de levadura Kluyveromyces marxianus s de agar placas petri

usado para la inoculación de glucosa media

Figura 4.1.B: células de lavadura Kluyveromyces marxianus en medio de glucosa media

bajo condiciones aerobicas - shaker

Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST

STRAIN Erika Guimarães Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May

2004

6


Las levaduras se hallan ampliamente distribuidas en la naturaleza y se encuentran

frecuentemente en forma de polvillo blanco que cubre los frutos y las hojas.

4.1.2 Composición típica de las levaduras

Algunos de estos usos están basados en la composición de las levaduras.

Los componentes principales de la biomasa de levadura están presentados en la

siguiente tabla:

Componentes % Componentes %

Proteínas 45,0-55,0 Calcio 0,6-1,3

Hidratos de carbono 25,0-35,0 Fósforo 1,4-1,7

grasas 2,0-5,0 Potasio 1,2-1,9

Cenizas 6,0-8,0 Magnesio 0,1-0,2

Hierro 9,3-35,0 mg/% Cobre 2,0-13,4 mg/%

Molibdeno 1,3-12,3 mg/% Cinc 3,3-16,3 mg/%

Fuente: Departamento de Investigación Agosto 2005

Alrededor del 70% del nitrógeno total de las levaduras esta en forma de proteínas, el 8 -

10% como purina y el 4% como pirimidina. El resto esta en forma de aminoácidos y

nucleótidos. Por ejemplo, analizando el extracto de la levadura Saccharomyces

cerevisiae, que se usa en la industria alimentaria, se puede observar el alto contenido de

aminoácidos esenciales. Esta característica de la levadura S. cerevisiae se utiliza para la

producción del complemento dietario.

Aminoácidos % Aminoácidos %

Lisina 8.2 Valina 5.5

Histidina 4.0 Isoleusina 5.5

Arginina 5.0 tirosina 5.0

7


Leucina 7.9

Fuente: Departamento de Investigación Agosto 2005

4.1.3 Importancia de la levadura Kluyveromyces marxianus:

a) Obtención de la inulinasa , se sabe que la inulinasa es una enzima que es utilizada

para la hidrolisis de la inulina en una única etapa, obteniéndose productos con 95% de

frutosa esta puede ser obtenida de plantas o através de microrganismos como bactérias,

hongos o levaduras. Las levaduras Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 e NRRL Y-

7571 es de gran interes industrial debido las características fisiológicas de accecibidad.

b) Obtención de la lactasa o b-galactosidasa es una enzima exclusivamente intracelular

en Kluyveromyces marxianus ATCC 8554, es una enzima que ha despertado gran interés

biotecnológico por razones básicamente nutricionales e industriales. La enzima causa la

hidrólisis del enlace b-1,4 de la lactosa hasta sus monómeros glucosa y galactosa,

originando un producto con mayor poder edulcorante. Los jarabes obtenidos de esta

hidrólisis sirven como sustituto del jarabe de maíz o sacarosa en las industrias de

heladerías, reposterías y panaderías; además su adición a productos lácteos como leche,

yogurt, crema agria y mantequilla mejora el sabor sin que ocurra un incremento calórico,

beneficiando el consumo en individuos con intolerancia a la lactosa. La hidrólisis

enzimática de la lactosa del suero permite el aprovechamiento de este subproducto de la

industria láctea, el cual se ha convertido en un grave problema de contaminación

ambiental, debido a que generalmente se descarga en cuerpos de aguas, esto ha

conllevado a que actualmente existe una amplia información sobre la b-galactosidasa

obtenida de diferentes fuentes y donde se han considerado aspectos como selección de

géneros, condiciones de cultivo, procedimientos de extracción, purificación, estabilidad,

obtención de plásmidos y mutantes, entre otras . Su aplicabilidad involucra

mayoritariamente sistemas alimenticios, por lo que resulta idóneo trabajar con enzimas

generalmente reconocidas como seguras (GRAS) y aceptadas por agencias de control de

alimentos y drogas como la Food and Drug Administration (FDA). Actualmente el estatus

GRAS es validado sólo para las lactasas de Aspergillus níger, Aspergillus orizae,

Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces marxianus [9]. La lactasa más conveniente para

8


utilizar en leche, productos lácteos y sueros dulces es la proveniente del género

Kluyveromyces, donde representa un producto estrictamente intracelular .

Varios métodos han sido usados para solubilizar este tipo de enzimas, dependiendo de su

localización dentro de la célula, intenciones de uso y estabilidad; los métodos mecánicos

son predilectos en aplicaciones a gran escala, pero requieren alta inversión, costos

operacionales y además el extracto obtenido resulta cargado de fragmentos celulares,

sumando así mayor grado de dificultad al momento de purificar la enzima. La autólisis no

es un método apropiado, porque requiere de temperaturas que comprometen la estabilidad

de la enzima y los detergentes. son difíciles de remover de las preparaciones enzimáticas.

Uno de los métodos más utilizados para la extracción de la b-D-galactosidasa a partir de

levaduras es el uso de solventes orgánicos como el tolueno, cloroformo y alcohol

isoamílico. El análisis por MET de las células de K. marxianus reveló que el tolueno

ejerce un efecto permeabilizante, ya que ninguna célula mostró rompimiento de la pared

celular. En la FIG. 1 se observa el efecto plasmolizante producto del tratamiento con el

solvente, manifestado por la formación de pliegues de la membrana (_), vesícula en el

espacio intra y extracelular (➯), lo cual puede explicarse por la salida de compuestos

marcadores del espacio intracelular y corroborado por la valoración de la actividad de la

enzima. También se observa una desorganización de los organelos citoplasmáticos con

ausencia de núcleo y mitocondrias y la presencia de fragmentos de membrana (➤) que

podrían ser considerados como restos de organelos dentro de un citoplasma que se

observa muy denso.

Fig : Muestra de células de Kluyveromyces marxianus ATTC 8554 tratada con tolueno en la extracción

de enzimas

c) Obtención de concentrados proteicos: Se puede obtener un concentrado proteico a

partir de biomasa microbiana Kluyveromyces marxianus var. marxianus cultivada en suero

9


lácteo desproteinizado. El suero lacteo que se ha propuesto su empleo como sustrato de

fermentación para microorganismos capaces de asimilar la lactosa, tales como la levadura

Kluyveromyces marxianus var. marxianus, con el propósito de obtener biomasa

microbiana, también conocida como “proteína unicelular” . Esta tiene un contenido

proteico que oscila entre 40 y 80% en base seca y su calidad la asemeja más a la proteína

animal que a la vegetal . Sin embargo, el uso de proteína unicelular para consumo humano

presenta importantes limitaciones: la presencia de las paredes celulares, pues éstas reducen

la biodisponibilidad de las proteínas, además contienen factores antigénicos y alergénicos;

el alto contenido de ácidos nucleicos (básicamente ARN) los cuales pueden ocasionar

trastornos renales y gota, y por último las reducidas propiedades funcionales que exhibe la

biomasa celular deshidratada . Estas limitaciones pueden superarse mediante la elaboración

de concentrados proteicos, tal y como ha sido descrito para Candida tropicalis y para

Kluyveromyces marxianus var. marxianus utilizando la extracción alcalina y precipitación

isoeléctrica; sin embargo, esto no es suficiente, dado que los niveles de ácidos nucleicos

deben ser reducidos, bien sea por métodos químicos o métodos enzimáticos. Entre los

métodos químicos, uno de los más aceptados es la fosforilación con oxicloruro de fósforo

o alternativamente con trimetafostato de sodio, donde se han obtenido concentrados

proteicos a partir de Saccharomyces cerevisiae, los cuales han sido luego deshidratados a

través de métodos sofisticados, como la liofilización o el secado por aspersión,

respectivamente. La suplementación de productos cárnicos y de panadería con

concentrados proteicos bajos en ácidos nucleicos, mejora las propiedades funcionales de

dichos alimentos. Se ha ensayado la incorporación de harinas y autolizados obtenidos de

Candida utilis y Saccharomyces cerevisiae en la elaboración de los mencionados

productos con excelentes resultados .

d) Obtención de etanol :

10


Tabla: Resumen de artículos de trabajo para parámetros de crecimiento cinético con

especies de Kluyveromyces en la obtención de etanol:

11


Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika

Guimarães Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May

4.2 Sacarosa.

La sacarosa (azúcar de mesa) es un disacárido de glucosa y fructosa. Se sintetiza

en plantas pero no en animales superiores. No contiene ningún átomo de

carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus

dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí

12

http://www.monografias.com/trabajos14/ciclos-quimicos/ciclos-quimicos.shtml#car

http://www.monografias.com/trabajos/atomo/atomo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/cani/cani.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/plantas/plantas.shtml

http://www.monografias.com/trabajos15/cana-azucar/cana-azucar.shtml


covalentemente mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa no

es un azúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor.

4.3 Quimiostato:

El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce

medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez

que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato

contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos

parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación:

Donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por

consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de

volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor

por unidad de tiempo. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo

que una unidad de substrato está dentro del reactor.

Tanto la tasa de crecimiento μ como el nivel de población microbiana están

relacionados con el valor de D.

13

http://www.monografias.com/trabajos15/cana-azucar/cana-azucar.shtml


Fuente: Microbiología General, Cultivo de microorganismos.

A velocidades de D muy bajas, pequeños incrementos de la velocidad de dilución

producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan

más nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento

(μ) según lo indicado en la ecuación de Monod.

La velocidad de crecimiento aumenta (μ aumenta y τ disminuye) cuando la

energía aportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento

de los microorganismos del cultivo.

A valores bajos de D la concentración de nutriente limitante (S) en el efluente es

baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del

cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (μ)

baja porque se encuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S<Ks). A

valores más altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos

del cultivo por lo que S en el efluente aumenta.

En una situación de equilibrio, velocidad de dilución D se iguala a la tasa de

crecimiento μ, de forma que el control de la tasa de dilución (control del flujo f)

permite regular la tasa de crecimiento y, de esa forma, la situación fisiológica del

organismo. A valores de D> μmax, el microorganismo no es capaz de crecer lo

suficiente como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por

consiguiente S alcanza un valor máximo (el nutriente limitante no es consumido

en el cultivo y la concentración del substrato en el efluente es igual a la del

substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (μ)

dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece).

La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente:

14


Microbiología General, Cultivo de microorganismos.

4.4.- Metabolismo:

4.5 Factores Fisicoquímicos que Afectan la Rapidez de Crecimiento.

Dentro de los factores ambientales que afectan el crecimiento de las levaduras

tenemos:

La temperatura puede, en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el

grado total de desarrollo de los microorganismos, además las variaciones de

temperatura también pueden influir en los procesos metabólicos y en la

morfología celular. Pelczar et al. (1977) reportó, cada especie de levadura

crece a la temperatura que esta dentro de cierto límite de 28 a 48 °C ejemplo el

Kluyveromyces marxianus crece a 48 ° C. (www.unsa.edu.ar)

El pH es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos

sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren

rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea

las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica

depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a

ambos lados de la membrana citoplásmica.

15

http://www.unsa.edu.ar/


Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio

de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del pH se

puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos

orgánicos de cadena corta .Por consiguiente, es necesario controlar el pH de

los cultivos para evitar que un descenso excesivo pueda producir la auto

esterilización del cultivo. Por ejemplo el pH óptimo de crecimiento de las

levaduras esta en el rango de 3 a10. (www.unsa.edu.ar)

El potencial redox y el oxígeno son factores determinantes del crecimiento y del

metabolismo del cultivo. El potencial redox del medio de cultivo nos indica su

capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes

o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque

no el único, es la concentración de oxígeno, O2. Hay microorganismos que

requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan

ambientes reductores. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras

no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para

que se produzca el crecimiento.

Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es

anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos) o anaerobios

aerotolerantes como las bacterias lácticas o cuando muere en presencia de

oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). El rendimiento Yx/s de los

procesos fermentativos es menor que el de los respiratorios: las levaduras

producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen

respirando.

Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión

de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del

agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la

humedad relativa (HR).

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua

disponible metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde

todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones

químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl)

donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la

16


solvatación de los iones de la sal disuelta. En este último caso, la actividad de

agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de

solutos en el medio, disminuye su actividad de agua.

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de

agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detención del

crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que

éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos

largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada

prácticamente ilimitada.

La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de

agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad

para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los

siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw

>0.80.

La concentración de los compuestos que se necesitan para el crecimiento es

importante porque puede provocar una disminución de la tasa de crecimiento a

causa de la alta presión osmótica del medio.

4.6 Extracto de Levadura

Los extractos de levadura son excelentes para muchos microorganismos. Son

producidos a partir de la levadura de panadería mediante autólisis a 50 – 55 ºC o

mediante plasmólisis en presencia de altas concentraciones de NaCl. El extracto

de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y

carbohidratos. Muestra algunos análisis típicos, la composición del extracto varía

parcialmente debido a que los substratos utilizados para el cultivo de las levaduras

afectan la calidad del extracto de levadura.

17


Tabla N° xxxx. Composición del Extracto de Levadura.

Extracto de Levadura producido mediante

Autólisis Plasmólisis con NaCl

Composición (%)

Materia seca

Nitrógeno total

Proteína (N*6.25)

NaCl

70

8.8

55

< 1

80

7.4

46

18

Aminoácidos (%)

Alanina

Ácido aminobutírico

Arginina

Asparagina

Cistina

Ácido glutámico

Glicina

Histidina

Isoleucina

Leucina

Lisina

Metionina

Ornitina

Fenilalanina

Prolina

Serina

Treonina

Tirosina

Valina

3.4

0.1

2.1

3.8

0.3

7.2

1.6

0.9

2.0

2.9

3.2

0.5

0.3

1.6

1.6

1.9

1.9

0.8

2.3

2.3

0.1

1.1

3.1

0.2

5.1

1.6

0.8

1.6

2.3

2.9

0.5

0.9

1.6

1.5

1.5

1.4

0.5

1.9

Contenido en vitaminas (ppm)

Tiamina

Riboflavina

Piridoxina

Niacinamida

Ac. Pantoténico

20-30

50-70

25-35

600

200

10-15

50-70

20-30

100

350Fuente: Ohly Gmbh y Hamburg, citado en Wulf C., 1989.

18


4.7 Antiespumantes:

4.7.1 Silicona liquida: El Dimetilpolisiloxano (Simeticona), es una silicona inerte

derivada del silicio desprovista de acción sistémica que desarrolla un efecto

espumolítico-antiflatulento. Químicamente es un polímero linear de siloxanos

metilados, con un número de unidades entre 200 y 350 dependiendo de su viscosidad.

4.8 Crecimiento microbiano en medio líquido

Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que

se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose

una suspensión de células libres.

En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar

cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento

microbiano:

19


Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su

metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y

condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.

Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima

y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen

a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de

células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que

describiremos a continuación.

Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u

otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un

metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una

acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener

importancia industrial.

Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún

nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han

liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el

crecimiento microbiano.

20


La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente

con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los

ambientes naturales.

Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del

cultivo.

4.9 Cultivo por Lotes

La fermentación por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde

todos los materiales requeridos están cargados en el fermentador, previamente

desinfectados antes del proceso de fermentación y los residuos removidos al final.

Los únicos materiales extraídos y agregados durante el curso de una fermentación

por lotes son el intercambio de gases y las soluciones de control de pH,

respectivamente. En este modo de funcionamiento, las condiciones están

cambiando continuamente con el tiempo, y el fermentador es un sistema de estado

inestable.

La ventaja principal es el menor riesgo de contaminación con respecto a otros

procesos de fermentación (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado)

La desventaja principal del cultivo por lotes es el alto tiempo improductivo entre

lotes, comprendiendo la carga y descarga del fermentador, la limpieza,

esterilización y procesos de salida. Otra desventaja es la inhibición del

crecimiento por metabolitos primarios, secundarios y por la ausencia de

nutrientes.

4.10 Cultivo por Lote Alimentado

En el cultivo por lote alimentado, el inicio es una fermentación por lotes y

posteriormente se alimenta con un nutriente limitante o un precursor

continuamente o intermitentemente, durante el curso de la fermentación, a modo

de controlar la cantidad disponible del mismo en el medio. Al final del ciclo el

fermentador puede vaciarse parcialmente y repetir un nuevo ciclo.

Básicamente, el crecimiento de las células se da bajo un cultivo por lotes durante

algún tiempo, normalmente hasta cerca del extremo de la fase de crecimiento

exponencial. A estas alturas, el biorreactor se alimenta con una solución de

21


nutrientes. Este alimento debe ser bastante equilibrado para persistir el crecimiento

de los microorganismos en una proporción de crecimiento específica deseada y

reduciendo la producción de derivados simultáneamente (ése puede ser

crecimiento o producción del producto inhibitorio). Es el proceso más usado en la

producción de metabolitos complejos.

La ventaja de esta técnica es la producción de densidades celulares altas debido a

la extensión de tiempo (particularmente importante en la producción de productos

crecimiento-asociados) por lo que existe un mayor rendimiento y productividad.

Otra ventaja es reducir la formación de productos secundarios formados cuando

hay exceso de nutrientes (sobrealimentación).

La desventaja es que requiere instrumentación adicional para el control, operarios

entrenados para operar el biorreactor y la toma de decisiones, especialmente

cuando no se dispone de elementos de control automático. Otra desventaja es que

existen riesgos de contaminación del medio de cultivo.

V.- MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES:

5.1 Diseño del medio de cultivo y preparación de los medios.

5.1.1 Medio de mantención y resiembra del microorganismo.

5.1.1.1 Materiales y equipos

Balanza analítica

Olla a presión

Mechero Bunsen

Pipetas de 10 ml.

Aza bacteriológica

Tubos de ensayo con tapas (8 tubos)

Varilla de vidrio

Matraz erlenmeyer (250ml)

Guantes.

Espátula

Probeta graduada

Capachos de papel

22


5.1.1.2 Reactivos

Muestra: Kluyveromyces marxianus ATCC-16045

Sustrato: sacarosa

Agua destilada.

Extracto de levadura.

Peptona.

Agar.

5.1.1.3Procedimiento

Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de

composición de medios de cultivo de mantención para

Kluyveromyces marxianus ATCC-16045. (Tabla Nº 1 de anexos)

Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 de anexos se pesan las

cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.

Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada.

Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer

adicionando el agua destilada.

Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el

matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de

vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se

controla de 1 a 2 minutos.

Preparar 8 tubos de ensayo con tapa, y en caliente

adicionar 6ml de la mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.

Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a

la olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el

intercambio de gases.

Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a

partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la

esterilización.

23


Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de

la olla, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a

temperatura ambiente.

Luego preparamos nuestra área de trabajo, desinfectando

con alcohol. para tener una área estéril prendemos el mechero cinco

minutos antes de realizar el resiembro con el Kluyveromyces

marxianus

Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen ,

flameando para evitar la contaminación , teni8endo el aza

bacteriológica calentado al rojo vivo esperamos un momento que se

enfríe .

Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar ,

flameamos y cerramos el tuvo y así en los 8 tubos con agar

5.1.2 Medio de activación


Matraz de 250ml.

Matraz de 125 ml

tubos de ensayo con tapa

Algodón

Gasa

Varilla de vidrio

Balanza analítica

Espátula

Agua destilada

Pinzas

Guantes

Shaker

Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

Olla a presión

Pipetas

Capachos de papel

24


PHmetro

5.1.2.2 Reactivos

Componentes según Tabla Nº 2

Alcohol

HCl cc.

5.1.2.3 Procedimiento

Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 2 de anexos.

Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un

tubo de ensayo (enrazar hasta 14 ml con agua destilada), la

sacarosa en un matraz de 125 ml (14 ml con agua destilada).

Previamente a la esterilización utilizar NaOH y acido

ortofosforico para ajustar el pH a 5.0 de la solución que contiene

sacarosa.

Mezclar estos componentes para el medio de activación “bajo

mechero” para evitar la contaminación.

Tener el resiembro activado en una estufa por un promedio de 1.5

a 2 horas.

Sacamos tres azadas y colocamos en el medio de activación.

Colocar en el shaker hasta que la concentración sea de 3gr/l para

un tiempo de 12h.

Luego se inocula en un matraz de 250 ml con un medio liquido

de 136 ml que contiene sacarosa, sales y extracto de levadura.

5.1.3 Medio de fermentación y proliferación


25


Matraz de 1 L

Matraces de 125 ml

Varilla de vidrio

Capachos de papel

Balanza analítica

pHmetro

5.1.3.2 Reactivos

Según la tabla Nº 3 de anexos

Agua destilada

Alcohol

5.1.3.3 Procedimiento

Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 3 de anexos.

Se diluye completamente cada compuesto con agua destilada de

la siguiente manera:

Sacarosa en un matraz de 1 L con 400 ml de agua

destilada

Extracto de levadura y el sulfato de amonio en un matraz

con 212 ml. de agua destilada

Las sales, K2HPO4, MgSO4. 7H2O

Regular el þH de la solución de sales con acido ortofosforico e

hidróxido de sodio hasta un pH de 5.0

Esterilizar las diluciones por separado.

Dejar enfriar

Mezclar el extracto con el azúcar (sacarosa) y adicionar el

inoculo.

Colocar en Baño Maria con el agitador magnético e iniciar el

cultivo continuo con adición de nutrientes

26


5.1.4 Medio para el quimiostato V= 680 (viernes 29/02/08 8:00m.)

Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 4 de anexos):

sacarosa, 220 ml de agua destilada en el quimiostato

Solución de sales MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un matraz de

250 ml con 100 ml de agua destilada

Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con

100 ml de agua destilada

Se taparon, esterilizaron 121 °C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar

hasta su posterior uso.

5.1.5 Medios para el flujo de alimentación de los estados estacionarios

V=2.4 L (viernes 31/02/08 9:00 am)


Sacarosa,220 ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.5 L

Solución de sales 11.5 ml, 100 ml de tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 c

en un matraz de 125 ml


100 ml de agua destilada.

Se taparon, esterilizaron 121 °C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar

hasta su posterior uso.

5.2 Medio bajo limitación por nitrógeno:

Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla de anexos 7):

sacarosa, y agua destilada en un botellón ámbar de 2.4 L

27


Solución de sales, tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un

matraz de 125 ml

Sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada

Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.

5.3 Medio para perturbación con alta concentración de sacarosa:


sacarosa, 220ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.4 L

Solución de sales ml, tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un

matraz de 125 ml




5.4 Medio para el lavado


sacarosa, tampón y ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.4L

Solución de sales ml, ml de tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2

en un matraz de 125 ml




5.5 Puesta en marcha del quimiostato

De la cinética seguida en los matraces se determino el tiempo para las 2/3 partes

del crecimiento logarítmico para dar inicio al cultivo continuo

5.6 Obtención de la curva característica de crecimiento de una levadura

28


Se trabajo con 5 e.e. para la obtención de esta curva, es haciendo variar la

velocidad de dilución de acuerdo al tiempo calculado en el Anexo Nº...

Estados estacionarios:

; ;

Considerando que en estado estacionario se cumple que:

µ=D

5.7 Obtención y caracterización de un estado estacionario bajo limitación por

nitrógeno.

Nutriente limitante: nitrógeno

Concentración celular final de 3g/l

Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos: con la

experiencia 4

= 0.2206 h-1

F = 2.5 ml/min

t = 14 h

*V = 2.4 L

*Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentación.

5.8 Perturbación de un estado estacionario mediante aumento de la

concentración del nutriente limitante en la alimentación.

Habiéndose obtenido los 5 estados estacionarios en el crecimiento de la

levadura, se perturba este estado aumentando la concentración de sacarosa

(Nutriente limitante) en la alimentación.

29


Este nuevo flujo trabajo una concentración de sacarosa = 15 g/l. Para este estado

estacionario consideraremos los siguientes datos:

= 0.2650 h-1

F = 3.00 ml/min

t = 12 h

*V = 2.4 L


Se tomaron 11 muestras cada hora

5.9 método de lavado

Se aumento el flujo para determinar el max

D = 1.0588 h-1

F = 12 ml/min

t = 3 h

VL = 680 ml

Donde VL = Volumen del Quimiostato

*V = 2.4 L


Se tomaron 11 muestras cada hora

VI.- RESULTADOS Y DISCUSION:

30


La Inoculación Kluyveromyces Marxianus Del Fue De La Siguiente Manera

31

Muestreo para seguimiento de la

cinética del cultivo por lote

22

Muestreo para obtención de la Curva

de calibrado de biomasa y sustrato

3

11

CULTIVO POR LOTE CULTIVO CONTINUO

SHAKER SHAKER

SHAKER

SHAKER

SHAKER


1.- EL CULTIVO POR LOTE

Del matraz N° 3 se extrajo las muestras para realizar la curva de calibrado o curva

patrón para biomasa que nos fue proporcionado por el profesor del curso y azucares

reductores por método rápido DNS presentamos los datos en el cuadro Nº 2 ,

obteniéndose así los resultados :

Se tomaron 20 ml, cada muestra de 5 ml, se midió absorbancia 540 nm y para la

biomasa de 640 nm se centrifugo para hallar peso seco.

METODO D.O (Datos para la curva de calibrado para la concentracion celular

Biomasa):

CUADRO Nº 1: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

N°

Capacho Dilución

ml

Caldo

ml de

H2O

Absorbancia

(640nm)

Capachos

(gr)

Capachos

+ Celulas

Celulas

secas (g)

X

(g/L)

1 01:01 5 0 1.23 0.2156 0.2244 0.0088 1.76

2 01:02 2.5 2.5 0.9 0.2126 0.2191 0.0065 1.3

3 01:05 1 4 0.487 0.2046 0.2072 0.0026 0.52

4 01:10 0.5 4.5 0.272 0.2082 0.2094 0.0012 0.24

GRAFICA Nº1: CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

32


Curva de Calibrado de Biomasa (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045)

y = 0.6094x + 0.1403

R2 = 0.9955

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

CC de Biomasa (G/L)

Ab

sorb

anci

a (6

40n

m)

Obteniéndose un

m =0.452 h-

y = 0.6094x + 0.1403 R2 = 0.9955

El tiempo de muestreo para la fermentación del cultivo por lotes fue de 10 hr y se ha

considerado los 2/3 del crecimiento logarítmico, porque a este tiempo las células son

más viables y están en pleno crecimiento exponencial, pues es en ese momento en la

que se puede dar inicio al cultivo continuo. La inoculación al quimiostato es la primera

etapa para dar inicio a este cultivo, a esta etapa se le llama puesta en marcha y con ella

empezara el conteo hasta luego de las 4h Como se muestra a continuación para un m

=0.452h-1 obtenido por el profesor.

C1V1 = C2V2

2 (g/l)*20(ml)= X0*680(ml)

0.0588 g/l= X0

Ln(X / X0) = m t

33

m =0.452 h-


Ln((3g/l)/(0.0588g/l)) = 0.452h-1 t

3.777=t

T=4h

En las que las células se encuentren en pleno crecimiento. En la experiencia las células

inoculadas tuvieron una absorbancia de 0.206 y luego en el quimiostato tardaron 4

horas hasta alcanzar los dos tercios de su crecimiento logarítmico pues durante este

lapso de tiempo las células se adaptan al nuevo medio siendo este el momento ideal

para iniciar el cultivo continuo

La determinación experimental de este momento se logro gracias a la medición de la

absorbancia, cuyo valor al cabo de las 4 horas fue de 0.830 , que al comprobarla con la

absorbancia del cultivo por lote existe una semejanza significativa con lo obtenido en la

cinética de crecimiento en el cultivo por lotes.

Fuente : instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente.

A. METODO DNS (Datos para la curva de calibrado de sacarosa (6 g/L) )

34

2/3 T


CUADRO Nº 2: DATOS PARA LA CURVA PATRON DE SACAROSA

N°

TUBOS

ml de caldo

V1 ml de H2O

C2 de Sacarosa

(g/L) ABSORBANCIA

1 2 0 6 0.951

2 1.6 0.4 4.8 0.646

3 1.2 0.8 3.6 0.597

4 1 1 3 0.488

5 0.8 1.2 2.4 0.317

6 0.4 1.6 1.2 0.21

7 0.2 1.8 0.6 0.07

8 0 2 0 0

GRAFICA Nº2: CURVA PATRON DE LA SACAROSA

Curva de Calibrado de Sacarosa

y = 0.1528x - 0.0028

R2 = 0.9785

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5

CC de Sacarosa (g/L)

Ab

sorb

anci

a (5

40 n

m)

2.- CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO:

2.1PUESTA EN MARCHA DEL QUIMIOSTATO

La puesta en marcha se realiza luego de montaje del quimiostato. Tal como se muestra

en la figura

35


Siendo las 8: 00 am del día viernes se inoculo el matraz N° 3 en el quimiostato se saco

una muestra y se leyó la absorbancia dando ABS = 0.206, lo cual indica que el inicio del

cultivo continuo aun no debe empezar.

36


Toma de muestra para la lectura de la absorbancia.

Por lo que luego de aproximadamente 4 horas se toma una muestra mas dando la ABS.=

0.830 esto indica que se debe dar inicio al cultivo continuo.

2.1 parámetros para cultivo continuo.

Las variables que comúnmente se controlan en un cultivo continuo son: el pH, la

temperatura, la cantidad de espuma formada, la velocidad de agitación, etc( Instituto

Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A)

pH.- En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con un pH inicial de 5.88 y se

termino con un pH de 5.5 contrastando de acuerdo a la teoría las levaduras como

Kluyveromyces marxianus toleran mejor altas concentraciones de azúcar que de sal,

pero toleran un rango de entre 3 y 10, pero prefieren un medio ligeramente ácido con

un pH de 4,5 a 6,5.Kluyveromyces marxianus (1)

La temperatura. En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con una temperatura

de baño Maria de 30 ºC; La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, pero en el

caso de Kluyveromyces marxianus es aerobia porque es una especie fermentadora así

mismo la mayoría de las levaduras tienen una temperatura máxima de crecimiento entre

24 y 48ºC. La temperatura optima se encuentra por lo general entre 30 – 45 ° C,

(Elsevier, 1990).

37


La filtración.- En la practica de laboratorio se utilizo el sulfato de cobre como un

filtrador que permite eliminar las partículas en suspensión en el aire y así eliminar a los

microbios que son, generalmente, adsorbidos .La gran mayoría de partículas tienen un

diámetro comprendido entre un décimo y algunos micrones .En el aire seco, están

animadas de un movimiento browniano que les da una talla aparente diez veces superior

a su tamaño real .Es posible eliminar las gracias a dos formas diferentes de filtración.

(Scriban, R. (1984).

La agitación.- en la práctica realizada se utilizo un agitador magnético para que acelere

el contacto entre dos o varias fases. En la fermentación, la fase soporte es con

frecuencia el medio cultivo .La agitación tiene por objeto mezclar con esta base soporte

varias fases que se adicionan .Una fase sólida (especial) constituida por las células

microbianas, la operación mezcla consiste en llevar a cabo una suspensión que debe ser

lo mas homogénea posible, pero conservando la integridad de las células , en la practica

se utilizo para tener en suspensión a las células y tener una mejor distribución de los

nutrientes agregados al medio.

Una segunda fase gaseosa constituida por el gas de oxigenación para los procedimientos

aerobios .La operación en este caso es una emulsión. (Scriban, R. (1984).

Una fase liquida constituida por los reactivos que se adicionan en el curso de la

fermentación: silicona liquida, nutrimentos, soluciones para corregir el pH. La

operación que se realiza es una mezcla.

La agitación mecánica, además de realizar las operaciones de mezcla y de suspensión,

mejora la emulsión dividiéndolo las burbujas de gas introducidas haciéndolas circular

en el líquido (Scriban, R. (1984).

La producción de espumas: la formación espuma puede ser un problema serio en la

fermentación. Si se permite su formación puede bloquear los filtros de salida, estimular

la contaminación o reducir el rendimiento. Lamentablemente la mayor parte de los

medios de fermentación facilitan la formación de espuma y su reducción puede

conseguirse mecánica o químicamente.

Existen un conjunto de antiespumantes en el mercado que incluyen aceites naturales ,

alcoholes superiores,, siliconas , n- parafinas. Algunos antiespumantes son

metabolisados por los microorganismos y es necesaria la dicción regular al

fermentador ; en efecto , por diseño cuidadoso del medio el antiespumante puede ser

38


utilizado como una fuente adicional de carbono, frecuentemente mas eficientemente que

la principal fuente de carbono. (J BULOCK; B.KRISTIANSEN. 1991)

Durante el proceso de fermentación, puede ser tolerable en cierta cantidad, pero este

llega a un punto que es necesario reducirlas para evitar que se desborden dado los

inconvenientes y los riesgos que esto entraña.

La espuma aparece cuando la dispersión de gas en la fase liquida se estabiliza a causa de

películas liquidas resistentes que envuelven las burbujas de gas .Aparece tanto mas

fácilmente y con mayor abundancia cuando mas débil es la tensión superficial. La

temperatura, el pH y la viscosidad del fluido de fermentación juegan también un papel

importante en la formación y persistencia de espumas.

Las sustancias antiespumas como los productos a base de silicones , recurre a la acción

global sobre la tensión superficial , además su elección de producto para contrarrestar en

el problema de las espumas , es debido a que este producto presenta un poder inhibidor

mínimo o nulo sobre el microorganismo que se cultiva, a comparación de medio

químicos ( sustancias iónicas) .Las espumas pueden disminuir la capacidad de

transferencia de oxigeno de la instalación .Así mismo pueden provocar una especie de

envenenamiento de las interfases de intercambio gas liquido .Asimismo pueden

perturbar los intercambios celulares por envenenamiento , en este caso , de las

envolturas de la célula .Se les puede imputar un aumento del tamaño medio de las

burbujas de gas en el seno del liquido , de donde resulta un aumento de la velocidad

media ascensional del gas y por consecuencia una disminución de la retención gaseosa y

del aire interfacial especifico que puede llegar hasta el 25%.La transferencia de oxigeno

es globalmente disminuida hasta el 60% , con la consecuente e inevitable baja de

productividad (Scriban, R. (1984).

Otro de los motivos de la formación de espuma es a causa de las proteínas que contiene

el extracto de levadura y los metabolitos que se van formando durante la fermentación.

39


Formación de espumas en el bioreactor

La transferencia de oxigeno.- De las burbujas gaseosas hacia los sitios de su

utilización en las células se hace en varias etapas, representa una transferencia

unidireccional. Esta transferencia se efectúa a través de varias películas, cada una de

ellas ejerce cierta resistencia .Se considera que en la interfase gas-liquido del lado

gaseoso esta recubierta de una película gaseosa ( etapa 1) y del lado liquido , de una

película liquida (etapa 2), esta ultima ejerciendo una gran influencia sobre la

transferencia. El oxigeno disuelto difunde entonces hacia las células (etapa 3 ) , al

contacto de las cuales se encuentra de nuevo a una película liquida (etapa 4 ).Finalmente

el oxigeno debe penetrar a la célula ( etapa 5)se puede considerar lo que paso dentro de

la célula en donde el oxigeno debe difundir hacia el sitio donde es efectivamente

utilizado para el metabolismo .En las levaduras las enzimas respiratorias están

localizadas dentro del mitocondrias. El oxigeno debe entonces difundir en el citoplasma

y atravesar la pared mitocondrial. A esto se le agrega , el fenómeno ya considerado de la

formación del micelio en pelota que hace mas difícil aun la transferencia del oxigeno al

seno del amontonamiento microbiano. El oxigeno juega un papel fundamental en el

metabolismo aerobio productor de energía, como receptor final de los electrones y de

los protones producidos en las reacciones de oxidación. El oxigeno interviene en ciertos

mecanismos de regulación del metabolismo en forma directa, como inductor o como

represor de la síntesis de enzimas respiratorias, pero también en forma indirecta en su

papel en el metabolismo energético

La instalación debe concebirse en su conjunto en forma que permita: La esterilización y

el mantenimiento de asepsia, la distribución de aire, en procesos aerobios, la reducción

o eliminación de espumas, la transferencia de fluidos y de suspensión de una cuba a

otra. . (Scriban, R. (1984).

Para que un microorganismo se multiplique, es necesario que se desarrolle en un medio

donde haya oxígeno, ya que este le sirve para producir energía e incrementar la

40


oxidación (que es una de las causas por las cuales crece). Los requerimientos de

oxígeno pueden ser expresados en términos de qo2, esta es la cantidad de oxígeno

consumido por unidad de tiempo y por unidad de biomasa, esta varia de acuerdo al

microorganismo y del estado fisiológico de las células, substratos de carbono y los

parámetros fisicoquímicos. (Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de

Occidente, A)

Medidor de oxigeno.

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS.

CUADRO Nº 3: DATOS EXPERIMENTALES DE LOS 5 ESTADOS

ESTACIONARIOS OBTENIDOS EN LA PRACTICA

Fecha Hora Absorbancia pH Responsable Observaciones

d/m/a (h) 640 nm N° Experiencia Cambio

41


29/02/200

8 07:30 a.m. 0.206 (Xi) 5.88 Grupo D1,2 OK

29/02/200

8 11:30 a.m. 0.83 (X2/3) 4.492 Grupo D1,2 OK

01/03/200

8 07:00 a.m. 0.928 5 Grupo A1

Experiencia N°3 (19

h) Cambio de F=3 ml/min

01/03/200

8 08:00 a.m. 0.817 F= 1.8 ml/min Hora: 8:15 am

01/03/200

8 07:00 p.m. 0.922 5.5

Cesar

Moreno


h)

Cambio de F=0.8

ml/min

01/03/200

8 08:00 p.m. 0.785 F= 3 ml/min Hora: 8:15 pm

03/03/200

8 01:00 p.m. Augusto


h) 1:00 pm se observa

03/03/200

8 02:00 p.m. 0.975 B1 no se F= 0.8 ml/min en el frasco de alim.

03/03/200

8 03:00 p.m. 0.896 presento solidos en suspension.

04/03/200

8 07:00 p.m. 0.866 5.5


h) Cambio de F=3 ml/min

04/03/200

8 08:00 p.m. 0.848 F= 1.20 ml/min

Hora 8:00 pm (Exp.

N°5)

05/03/200

8 07:00 a.m. 0.937

05/03/200

8 08:00 a.m.

42


1. CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO: ESTADOS ESTACIONARIOS

Para alcanzar los estados estacionarios se tiene en cuenta que deben pasar 3 tiempos de

residencia (siendo 3: tiempo de residencia y = D-1, donde se ha alcanzado

aproximadamente el 90% de equilibrio celular, por este motivo la toma de la

absorbancia de realiza una hora antes y una hora después para verificar que la célula

esta llegando o se encuentra en su estado estacionario. En la experiencia se tomaron tres

muestras siendo la segunda muestra la que corresponde a la hora central; para afirmar

que se ha alcanzado el estado estacionario se comprobaron con las lecturas del

espectrofotómetro no habiendo mucha diferencia, +/- 5% entre cada dato. En general

los cálculos para los tiempos de fermentación son casi exactos, pues luego de este

tiempo la células se encontraban en su estado estacionario.

Cerca de las 12:00 pm. se da inicio al cultivo continuo la toma de muestras se realizo de

acuerdo a los cálculos realizados; los muestreos obtenidos se presentan en la siguiente

tabla. Sabiendo que en los estados estacionarios D = μ se opta por dar las velocidades de

dilución que se presentan; con sus respectivos flujos. Los sobrenadantes guardados en

los viales, sirvieron para la evaluación del consumo de sustrato según el método DNS y

utilizando la curva de calibrado para azucares reductores hallamos la variación de

concentración del sustrato, lo obtenido se presenta en la siguientes tabla.

En este tipo de cultivo continuo hay una aportación continua de los substratos para la

alimentación de los microorganismos, el propósito de el estado estacionario es mantener

constante la producción de biomasa. Esto se logra alimentando al quimiostato a un ritmo

estable, el volumen es mantenido constante quitando la misma cantidad que se (3).

La adición de nutrientes al medio como, como sales de amonio y extracto de lavadura

puede tener un efecto beneficioso

43


CUADRO Nº 4: DATOS OBTENIDOS DE LOS 5 ESTADOS ESTACIONARIOS

F

(ml/min) Absorbancia X (g/L) Absorbancia S (g/L)

0.80.975 1.3697 0.007 0.1099

0.896 1.2401 0.009 0.1361

1.20.866 1.1908 0.01 0.1492

0.848 1.1613 0.005 0.0838

*1.80.928 1.2926 0.04 0.5419

0.817 1.1104 0.011 0.1623

2.50.778 1.0464 0.006 0.0969

0.723 0.9562 0.009 0.1361

3

0.922 1.2827 0.09 1.1963

0.785 1.0579 0.01 0.1492

0.686 0.8955 0.01 0.1492

* Para el flujo de 1.8 ml/min tuvimos que hacer un promedio de los dos valores de

absorbancia y tomar este promedio para hallar el X (g/L) (1.2015) como valor para

nuestro grafico Nº 3 y Nº 4.

* Los valores que se encuentran de color rojo, son los valores que se han tomado en

cuenta para el grafico Nº 3 y Nº 4.

CUADRO Nº 5: VALORES TOMADOS DE X y S PARA LAS GRAFICAS Nº 3 y

Nº4.

µ=D (h-1) X (g/L) S (g/L)

0.0706 1.2401 0.1361

0.1059 1.1908 0.1492

0.1588 1.2015 0.5419

0.2206 1.0464 0.1361

0.2647 1.0579 1.1963

0.4520 0 5.93

44


GRAFICA Nº3: CULTIVO CONTINUO AIREADO

CULTIVO CONTINUO AIREADO

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452

D (h-1)

Bio

mas

a X

(g

/L)

0.0000

1.0000

2.0000

3.0000

4.0000

5.0000

6.0000

Su

stra

to S

(g

/L)

X (g/L)

S (g/L)

GRAFICA Nº 4: CULTIVO CONTINUO AIREADO CON LINEA DE

TENDENCIA

Cultivo Continuo Aireado

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452

D (h-1)

Bio

mas

a X

(g

/L)

0.0000

1.0000

2.0000

3.0000

4.0000

5.0000

6.0000

Su

stra

to S

(g

/L)

X (g/L)

Linea Tendencia

S (g/L)

Linea Tendencia

45


Los valores tomados en el laboratorio se supone que sebe ser el mismo para cada estado

estacionario por tener una alimentación constante de sustrato; se tomaron para el grafico

Nº3 y Nº4 se encuentran en el cuadro Nº 4, y el criterio que tuvo el grupo para escoger

estos valores fue por lo siguiente; inicialmente tomamos el promedio de estos valores

pero al ver que no nos proporcionaba una grafica adecuada ni dada por referencias

bibliografícas; decidimos en el caso de sustrato que tenia que ir aumentado la

concentración y en el caso de biomasa disminuir tomando valores que se ajusten a la

curva dada por referencias bibliograficas.

Si observamos el grafico anterior Nº 3 y Nº 4 podemos comprobar que en los resultados

si hay un aumento de la velocidad de dilución (D), entonces menor será la

concentración de biomasa, por consiguiente tendremos una mayor concentración de

sacarosa cuando aumentemos la velocidad de dilución ya que al formase menos biomasa

consumirán menos sacarosa. Esto se puede contrastar con las siguientes bibliografías:

“La productividad de biomasa de 1,61 g / L • h en estado puro

hidrolizado a pH 4 y 38 ° C, a una tasa de dilución de 0,1 h -1, fue

mayor que el valor de 1,13 g / L • h obtenido en el 50% diluido en el

hidrolizado El mismo pH y la temperatura, pero a una tasa de dilución

de 0,15 h-1. No substrato de carbono residual fue detectado en

ninguna de las anteriores condiciones de cultivo”. (Cultivo en

Quimiostato de Candida blankii en Bagazo de la caña de azúcar

hemicelulosa hidrolizado P.S. Meyer, J.C. du Preez, * y S.G. Filian).

Otro autor nos menciona:

46


“En la Figura se aprecia la disminución en la concentración de

biomasa conforme aumenta el valor de la tasa de dilución, pasando

de un valor inicial de 3,3 g/L para una tasa de dilución de cero, que

corresponde a una operación del sistema en forma “batch”, hasta una

concentración de 0,2 g/L para una tasa de dilución igual a 0,5 h-1.

Para la última tasa de dilución (0,5 h-1), la concentración de azúcares

totales en el medio de cultivo se mantuvo aproximadamente igual a

la concentración del medio de cultivo fresco con que se alimenta el

proceso, indicando que la operación del sistema continuo tuvo lugar

con una tasa de dilución lo suficientemente alta que provocó el

lavado de células o producto, lo cual se debe evitar.

La tasa máxima de dilución, Dmax, con un valor de 0,19 h–1, se obtuvo gráficamente

donde las curvas de concentración de biomasa y sustrato en la Figura 5, se interceptan.

De igual forma, la tasa de dilución crítica, Dcri, corresponde al valor aproximado de

0,30 h-1, este valor tiene lugar donde la concentración de azúcares totales en el medio

de cultivo comienza a mantener un valor constante y similar a la concentración de

azúcares totales del medio de cultivo fresco, además, se da inicio al lavado de células.

Ambos parámetros son posibles de conocer a partir de los resultados cinéticos

obtenidos previamente”. (Evaluación de parámetros cinéticos para la

Sacharomyces cerevisiae utilizando agua de coco como sustrato. Oscar

Ramírez Sánchez).

DETERMINACION DE μmax Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS:

CUADRO 6: DATOS PARA LA DETERMINACION DE μmax Y Ks

S (g/L) 1/S D(h-1) 1/D

0.1361 7.3475 0.0706 14.1643

47


0.1492 6.7024 0.1059 9.4429

0.5419 1.8454 0.1588 6.2972

1.1963 0.5895 0.2647 3.7779

GRAFICO Nº 5: CURVA DE μmax Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS

Para determinar m y Ks se deben obtener datos de varios estados estacionarios, lo que

permite construir experimentalmente un grafico tipo Monod. En principio, de este

grafico se podría calcular Ks como el valore de S al cual = m/2 ya que:

m/2 = m*(S/(Ks+S) y

S = Ks

Por otra parte m se podría calcular del grafico como el mayor valor de , lo que

equivale a su valor asintótico. Sin embargo el valor así estimado resulta muy impreciso,

lo cual repercute en el calculo de Ks, que es un numero sensible a pequeñas variaciones,

por lo que esta forma de calculo no es recomendable.

Una mejor forma de determinar m y Ks es graficando los valores recíprocos de = D y

S, obteniendo un m del intercepto de la recta con el eje de 1/ y Ks del intercepto con

el eje de 1/S o de la pendiente Ks/m. este método es formalmente inobjetable, pero aun

asi los valores obtenidos pueden presentar variaciones apreciables. Ello es debido a que

48

DETERMINACIÓN DE µm Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS

y = 1.221x + 3.3885

0.0000

2.0000

4.0000

6.0000

8.0000

10.0000

12.0000

14.0000

16.0000

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1/S

1/D Datos dispersos

Lineal (Datosdispersos)


los datos experimentales se ubican relativamente alejados de los ejes, por ser ellos

valores recíprocos. Por lo tanto pequeñas diferencias en la pendiente de la recta trazada

se amplifica notoriamente en la intersección y afecta de m. también es importante el

hecho que obtener 5 o 6 estados estacionarios requiere de una semana o más de trabajo.

(copias de ingeniería de fermentación y enzimas – Ing Augusto Castillo)

Ecuación para determinar el m y el Ks:

y = 1.221x + 3.3885

El m se calcula intersectando la recta con el eje Y(1/D):

1/m = 3.3885

Entonces:

m = 0.295 h-1

El Ks se calcula de la pendiente de la recta:

Pendiente = Ks/m

Entonces:

Ks = m * 1.221

Ks = 0.36h-1

La velocidad de crecimiento en los microorganismos es función del nutriente limitante,

la velocidad de adición de medio determina la velocidad de crecimiento del

microorganismo y el sistema está autorregulado.

De acuerdo al trabajo de investigación de otro autor. “el crecimiento de Kluyveromyces

marxianus en lactosuero, dicho medio estuvo caracterizado por una fase exponencial

con una duración de 6 a 7 horas aproximadamente .El valor de la velocidad máxima de

crecimiento específico (μmax) fue de 0,42 h–1 (promedio de 5 procesos fermentativos

independientes) lo que corresponde a un tiempo de generación de 1,65 h ”. (5)

“La concentración de biomasa alcanzada al final del crecimiento osciló entre 3,67 y

4,65 g/L, consumiéndose casi la totalidad de la lactosa, con un valor promedio de

93,21%, correspondiente a 14,6 g/L. Estos datos permitieron calcular el rendimiento en

biomasa referido a lactosa consumida, el cual osciló entre 0,28 y 0,33 g/g. Es

importante destacar que los valores de los distintos parámetros de cultivo determinados

en el presente estudio guardan cierta similitud con los reportados por otros autores a

49


pesar de que en algunos casos las condiciones de operación fueron marcadamente

diferentes. Así, Vananuvat y Kinsella [36], utilizando tanques agitados reportan valores

de μmax en el rango de 0,35 h–1 y 0,44 h–1 para velocidades de agitación de 300 rpm y

700 rpm respectivamente; Castillo y Sánchez [3], empleando fiolas agitadas obtienen

valores de μmax de 0,41 h–1 a 35°C, y Chinappi y Sánchez [5] hicieron

determinaciones de μmax entre 0,34 y 0,62 h–1, al emplear diversos tipos de

biorreactores operados a altas tasas de aireación y agitación.” (5)

En nuestra investigación obtuvimos un m = 0.295 h-1 a una agitación de 200rpm.

DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE MANTENCIÓN REAL:

CUADRO 7:

D(h-1) y(x/y) qs

0.0706 0.2098 0.3365

0.1059 0.2057 0.5149

0.1588 0.2112 0.7520

0.2206 0.1910 1.1552

0.2647 0.2335 1.1334

GRAFICO 6: CURVA DEL COEFICIENTE DE MANTENCION REAL

50


DETERMINACION DEL COEFICIENTE DE MANTENCIÓN REAL

y = 4.4681x + 0.0451

R2 = 0.9531

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

D(h-1)

qs(

g/g

*h)

qs

Lineal (qs)

Ecuación para determinar el coeficiente de mantencion:

y = 4.4681x + 0.0451

El coeficiente de mantencion se calcula del intercepto de la recta con el eje qs.

m = 0.0451

m = coeficiente de mantencion.

DETERMINACION DE µm POR LAVADO (F = 12 g/L)

CUADRO Nº 8: DATOS PARA EL µm POR LAVADO

Fecha Hora Absorbancia X LNX Tiempo

d/m/a (h) (640 nm) (g/L)

07/03/2008 08:00 a.m. 0.723 0.9562 -0.044802392 0

07/03/2008 08:30 a.m. 0.643 0.8249 -0.192481296 0.5

07/03/2008 09:00 a.m. 0.553 0.6772 -0.38975393 1

07/03/2008 09:30 a.m. 0.407 0.4376 -0.826350435 1.5

07/03/2008 10:00 a.m. 0.301 0.2637 -1.332935594 2

07/03/2008 10:30 a.m. 0.236 0.1570 -1.851256568 2.5

07/03/2008 11:00 a.m. 0.181 0.0668 -2.706246774 3

GRAFICA Nº7: CURVA DE µm POR LAVADO X(g/L) vs T (h)

51


DETERMINACION DE µm POR LAVADO

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

TIEMPO (h)

[ ]

BIO

MA

SA

(g

/L)

GRAFICA Nº 8: CURVA DE µm POR LAVADO LnX vs T (h)

DETERMINACION DE µm POR LAVADO (F = 12 g/L)

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Tiempo (h)

Ln

X

GRAFICA Nº 9: DETERMINACION DE µm POR LAVADO; POR LA

PENDIENTE

52


DETERMINACION DE µm POR LAVADO

y = -0.8521x + 0.3597

R2 = 0.9776

-2

-1.8

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

TIEMPO (h)

Ln

(X)

Serie1

Lineal (Serie1)

Así como se calcula el m por el método de los estados estacionarios, otra alternativa es

el denominado método del lavado, que consiste en aumentar el valor de D de un cultivo

en estado estacionario sobre el Dc, de forma de producir intencionalmente l lavado y

graficar los datos obtenidos en la forma de LnX vs tiempo.

En la situación de lavado rige la ecuación diferencial:

m = D + ((1/X)*(dX/dt)) = D + (dLnX/dt)

Y dado que D es mayor al Dc las células crecerán a su máxima velocidad m.

Por lo tanto m se calcula determinando la pendiente de un grafico LnX vs tiempo,

restándola (la pendiente es negativa) del valor de D escogido para producir el lavado. El

experimento debe prolongarse lo suficiente para obtener una buena recta dejando de

lado los primeros puntos que corresponden a un periodo transitorio de ajuste a las

nuevas condiciones. El valor de m obtenido del lavado es tan bueno como lo es su

determinación a partir de la fase de crecimiento exponencial de un cultivo por lotes. En

ambos casos se trata solo de una aproximación, ya que m es un límite teórico ( a

infinita concentración de sustrato) y no se la puede medir directamente, sino que

aproximar u obtener por extrapolación, como en el método de los recíprocos. El valor

obtenido por el método e lavado más bien es Dc que m.

53


Ecuación para determinar el μmax por el lavado:

y = -0.8521x + 0.3597

μmax = D – pendiente

μmax = 1.0588 + (-0.8521)

μmax = 0.2067 h-1

Teóricamente, el kluyveromyces marxianus presenta un µ =0.48 h-1 pero como se puede

notar el µ calculado prácticamente, es mucho menor que el teórico, esto debido a que la

excesiva fase de latencia por las condiciones que no fueron las favorables, ya que el

volumen del matraz empleado ha sido muy pequeño, el cual no permitió una aireación

correcta por el área de contacto de la muestra con el aire, todos estos propiciaron que el

tiempo de fermentación se incrementara de forma notable, y con estos resultados el µ

=0.55 h-1 . Una consecuencia de las ecuaciones que describen el quimiostato simple es

que la velocidad máxima de dilución esta limitada a un valor ligeramente menor que la

velocidad máxima de crecimiento especifico um .Esta se denomina velocidad de dilución

critica para el lavado ,Dc. El lavado tiene lugar cuando las celulas estan siendo sacadas del

fermentador a una velocidad Dc.xvo que es igual a la velocidad maxima uxvo-dc xvo a la que

pueden crecer en el fermentador, de forma que el unico valor estable para la

concentración de celulas es cero. En el lavado el estado de equilibrio es aquel en el que no

existen celulas o crecimiento y el substrato pasa sin cambio por el fermentador.

Para poder determinar el F =12 ml/min tomamos como referencia la grafica:

54


Determinando el Dc= µm = 0.452 y con este valor podemos calcular el F de lavado

F = V*Dc

F = 680ml*0.452h-1*1/60

F = 5.12 ml/min, este seria el flujo de lavado a utilizar porque si observamos en el

grafico a un Dc la concentración de biomasa se hace cero con lo cual realizamos el

lavado, pero para poder garantizar el verdadero lavado en la practica tomamos un F

mucho mayor que el teórico y este F = 12 ml/min

Comparando los m del cultivo por lote, m de los estados estacionarios y el m del

lavado podemos ver que este ultimo es mucho menor que los otros esto debido

justamente que en el lavado el crecimiento es mas lento porque se esta sometiendo a una

velocidad de dilución mas grande en comparación a los otros.

El μma en los estados estacionarios es menor que en el por lote debido a la existencia del

Ks, y mientras sea mayor el valor de μ será menor.

PERTURBACION DE E.E (Incremento) [Sacarosa] = 15g/L

CUADRO Nº 9 perturbación por sacarosa en el experimento nº 5.

F (ml/min)

Tiempo

(h) Absorbancia X (g/L) X (g/L) Absorbancia S (g/L)

Experiencia 0 0.686 0.8955 0.8955 0.18 1.19634

N° 5 2 0.806 1.0924 1.0924 0.102 0.68586

F = 3 4 0.93 1.2959 1.2959 0.013 0.10340

6 0.961 1.3467 1.3467 0.015 0.11649

8 0.71 0.9349 1.8697 0.005 0.05105

10 0.641 0.8216 1.6433 0.006 0.05759

12 0.721 0.9529 1.9058 0.009 0.07723

............. Dilución: 1:2

CUADRO Nº 10

Tiempo (h) X (g/L) S (g/L)

0 1.2827 0.6073

55


2 0.8955 1.1963

4 1.0924 0.6859

6 1.2959 0.1034

8 1.3467 0.1165

10 1.8697 0.051

12 1.6433 0.0576

14 1.9058 0.0772

GRAFICA Nº10 perturbación por sacarosa

PERTURBACIÓN POR [ ] SACAROSA [ ] BIOMASA VS [ ] SACAROSA

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 2 4 6 8 10 12 14

TIEMPO (h)

[ ]

SA

CA

RO

SA

(g

/L)

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

[ ]

BIO

MA

SA

(g

/L)

S (g/L)

X (g/L)

De acuerdo al gráfico Nº 10 observamos que la sacarosa es el nutriente limitante. Donde

en las dos primeras horas la sacarosa actúa inhibiendo ala producción de biomasa

(inhibición por sustrato), demorando un tiempo de 2 horas para adecuarse al medio con

alta concentración de sustrato, después de 4 horas la biomasa empezó a aumentar

56


consumiendo el sustrato agregado, siendo el sustrato a partir de la 4 y 5 hora inverso

ala producción de biomasa.

PERTURBACION DE E.E (Disminución) [(NH4)2SO4] = 1g/L

CUADRO Nº 11

F (ml/min) Absorbancia X (g/L) Absorbancia S (g/L)

Experiencia 0.856 1.1744 0.02 0.149215

N° 4 0.882 1.2171 0.04 0.280105

F = 2.5 0.852 1.1679 0 0.018325

Ecuación para determinar la biomasa:

Y= 0.6094X + 0.1403

Ecuación para determinar la [ ] de sacarosa:

Y= 0.1528X - 0.0028

GRÁFICO Nº 11

57


PERTURBACION DE E.E POR NITROGENO

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452

D (h-1)

X (

g/L

)

0.0000

1.0000

2.0000

3.0000

4.0000

5.0000

6.0000

7.0000

S (

g/L

)

X (g/L)

Linea tendencia

S (g/L)

Linea tendencia

En el grafico Nº 11 se observa que el nitrogeno no es sustrato limitante, cuando se

disminuyo el nitrógeno en el medio, la concentración de biomasa no se vio afectada

porque aumento de 1.0497g/l a 1.2171 g/l, pero según las bibliografías es importante

la agregación de nitrógeno al medio, esto no se vio afectado porque en el extracto de

levadura contiene nitrógeno con 7 aminoácidos esenciales. (6). Ya vez el extracto de

levadura es precursor en el crecimiento de levaduras.

Hablar del ph

CUADRO Nº 12

F

(ml/min) Absorbancia X (g/L) Absorbancia S (g/L)

2.50.778 1.0464 0.006 0.0576

0.723 0.9562 0.009 0.0772

58


CONCLUSIÓN

Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, es una levadura fermentativa que

necesitan los azúcares para su catabolismo, es decir para obtener la energía

necesaria para sus procesos vitales, pero además necesitan otros substratos para

su anabolismo como son nitrógeno, fósforo, carbono, azufre, potasio y

magnesio ; además de las vitaminas, proteínas y aminoácidos ( proporcionadas

por el extracto de levadura ), además de sales .Por ello es de vital importancia

que el medio disponga de una base nutricional adecuada.

Para el crecimiento celular aireado en quimiostato para una cepa de

Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, la sacarosa es un nutriente limitante.

Para el crecimiento celular aireado en quimiostato para una cepa de

Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, el nitrógeno no es un nutriente

limitante.

Los parámetros obtenidos experimentalmente para nuestra cinética de

crecimiento son : μmax = 0.2067 h-1(Operación en condición de lavado),

m = 0.295 h-1 y Ks = 0.36h-1(Operación en los 5 estados estacionarios), qs =

0.0451

Los parámetros óptimos para la fermentación de la sacarosa en quimiostato con

Kluyveromyces marxianus ATCC-16045 son a una a una temperatura de 30ºC

en baño María, además de un pH entre 5.5 y 6, y utilizando un VVM de 200

ml/min para un volumen de 680 ml del fermentador, Además el rango de la

velocidad de dilución debe encontrarse entre 0.0452 h-1 < D < 0.3616 h-1 (Para

un μmax=Dc=0.452 h-1).

59


El tiempo de muestreo para la fermentación del cultivo por lotes fue de 10 hr y

se ha considerado los 2/3 del crecimiento logarítmico igual a 4h

RECOMENDACIÓN

Es necesario controlar las variables más importantes del medio de cultivo, por

medio de controladores que permitan que las condiciones del medio de cultivo

se mantengan estables. Al igual que el control, la instrumentación es importante

para conocer los valores de las variables que se requieren controla.

El birreactor debe tener los siguientes controladores como ,Controladores PID

lazos simples de realimentación, Control de Producto, Control de Sustrato,

Control de Biomasa:

Bibliografia

http://www.monografias.com/trabajos11/sara/sara.shtml

http://www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/09htextolevaduras.pdf

(1)OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE LA

LACTASA DE Kluyveromyces marxianus ATTC 8554, PARA SU

APLICABILIDAD EN LA INDUSTRIA LÁCTEA Departamento

de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del

Zulia, Apartado 526. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. E-mail:

[email protected]; [email protected].

(2)OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DOS

CONCENTRADORES PROTEICOS A PARTIR DE BIOMASA

DE KLUYVEROMYCES MARXIANUS VAR. MARXIANUS

CULTIVADA EN SUERO LÁCTEO DESPROTEINIZADO

Marta Elena Cori de Mendoza1, Nilo Rivas2, Blas Dorta3,

60

mailto:[email protected]

http://www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/09htextolevaduras.pdf

http://www.monografias.com/trabajos11/sara/sara.shtml


Emperatriz Pacheco de Delahaye4 y Antonio Bertsch51,2,4,5Instituto

de Química y Tecnología, Facultad de Agronomía, Universidad

Central de Venezuela, Apdo. 4579. Maracay, 2101, Venezuela. E-

mail: [email protected] . Telf: (0243)-2465360,5507304. 3Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, UCV.

Scriban, R. (1984). Biotecnología. Segunda edición. Editorial El

Manual Moderno, S.A. México.

(3)Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A

J BULOCK; B.KRISTIANSEN. biotecnologia básica.

1991.primera edición .editorial acriba S.A, zaragoza españa.

(4) Paper Agronomía sudamericana universidad de costa rica,

selección de una levadura para la producción de

biomasa ,crecimiento en suero de leche. 2006

(5) Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XVI, Nº 3, 315 - 324, 2006

OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DOS

CONCENTRADOSPROTEICOS A PARTIR DE BIOMASA

DE Kluyveromyces marxianus var. marxianus CULTIVADA EN

SUERO LÁCTEO DESPROTEINIZADO.

P.S. Meyer, J.C. du Preez, * y S.G. KilianCultivo en Quimiostato

de Candida blankii en Bagazo de la caña de azúcar hemicelulosa

hidrolizado

(6) Las tesinas Belgrano UNIVERSIDAD DE BELGRA ,Facultad

de Ciencias Exactas y Naturales, Carrera de Licenciatura en Farmacia

61

mailto:[email protected]


Estudio de algunas características de las cepas de levaduras y de su

rendimiento celular utilizando un medio de cultivo a base de suero lácteo

62


Diseño del medio de cultivo

63


Tabla Nº 1: Composición de medio sólido de mantención (para 50 ml de solución)

NutrientesSo

(g/l)

So

(g/50ml)

Extracto de Levadura 10 0.50

Extracto de malta 20 1.00

Peptona 20 1.00

Agar 20 1.00

Tabla Nº 2: Composición de medio de Activación (para 20 ml de solución)

Elemento Nutriente %Célula %Nutriente Yx/s So(g/L) So(g/20ml)

C Sacarosa

C12H22O11

52 42.10 0.505 5.94 0.1188

N Extracto de

Levadura------ ------ ------ 2.50 0.0500

Mg Sulfato de

magnesio

heptahidratado

MgSO4.7H2O

0.4 9.756 24.39 0.1845 0.0037

N Sulfato de amonio

(NH4)2SO4

9.0 21.212 2.3567 1.9095 0.0382

P Fosfato diacido de

potasio

KH2PO4

0.8 22.794 28.4925 0.1579 0.0032

K Fosfato diacido de

potasio

KH2PO4

2.52 28.676 11.38 0.3954 0.0079

Tabla Nº 3: composición del medio de fermentación y proliferación (para 68 ml de

solución)

64


Elemento Nutriente %Célula %Nutrient

e

Yx/s So(g/L) So(g/68ml)

C

Sacarosa

C12H22O1152 42.10 0.505 5.94 0.404

N

Extracto de Levadura------ ------ ------ 2.50 0.17

Mg

Sulfato de magnesio

heptahidratado

MgSO4.7H2O

0.4 9.756 24.39 0.1845 0.0125

N

Sulfato de amonio

(NH4)2SO49.0 21.212 2.3567 1.9095 0.1298

P

Fosfato diacido de potasio

KH2PO40.8 22.794 28.4925 0.1579 0.0107

K

Fosfato diacido de potasio

KH2PO42.52 28.676 11.38 0.3954 0.0269

Tabla N° 4: composición del medio de fermentación en el Quimiostato (para 680 ml de

solución)

Elemento Nutriente %Célula %Nutrient

e

Yx/s So(g/L) So(g/680ml)

C Sacarosa

C12H22O1152 42.10 0.505 5.94 4.0392

N Extracto de Levadura------ ------ ------ 2.50 1.70

Mg Sulfato de magnesio

heptahidratado

MgSO4.7H2O

0.4 9.756 24.39 0.1845 0.1255

N Sulfato de amonio

(NH4)2SO49.0 21.212 2.3567 1.9095 1.2985

P Fosfato diacido de potasio

KH2PO40.8 22.794 28.4925 0.1579 0.1074

K Fosfato diacido de potasio

KH2PO42.52 28.676 11.38 0.3954 0.2689

65


Tabla N° 5: composición del medio de alimentación en el Quimiostato (para 2.4 L

de solución)

Elemento Nutriente %Célula %Nutriente Yx/s So(g/L) So(g/2.4L)

C Sacarosa

C12H22O11

52 42.10 0.505 5.94 14.256

N Extracto de

Levadura------ ------ ------ 2.50

6

Mg Sulfato de

magnesio

heptahidratado

MgSO4.7H2O

0.4 9.756 24.39 0.1845

0.4428

N Sulfato de amonio

(NH4)2SO4

9.0 21.212 2.3567 1.9095 4.5828


potasio

KH2PO4

0.8 22.794 28.4925 0.15790.37896


potasio

KH2PO4

2.52 28.676 11.38 0.39540.94896

Aireación: Estando el cultivo ya en el quimiostato, se tienen que tomar en

cuenta consideraciones tales como la velocidad del flujo de aire que ingresa. El

flujo de aire para una concentración de 3 g/ L. se tiene que:

Yo2 = Rendimiento de oxígeno en célula (0.5 – 2.0 g cel/ g O2)

Consideramos: Yo2 = 1.14 g cel/g O2 , ε = 0.25 (Eficiencia de

absorción)

y m = 0.452 h-1

66


Entonces reemplazamos datos:

NA = 1.192 g/ L. h

Por lo tanto la demanda de oxígeno para un crecimiento de X = 3 g/ l

; T = 30 ºC = 303 º K

VVM = 0.294 L/L.min.

Como el caudal del aire es: Qaire = VVM*Vmedio

Qaire = (0.3344L/Lmin)(0.680L)

Qaire = 0.2 L/min = 200 ml/min

Este último valor es la velocidad de aireación específica con la que se trabajara

para alcanzar la concentración deseada.

Obtención de la curva característica de crecimiento de una levadura

Para la obtención de esta curva, es necesario considerar 5 estados estacionaros.

Estados estacionarios:

Considerando que en estado estacionario se cumple que: µ=D

Calculo de parámetros de fermentación

67


Consideramos que para valores de D en un proceso de cultivo continuo

tenemos:

0.1Dcritico < D < 0.8 Dcritico

El valor de Dcritico = m obtenido en el cultivo por lote, entonces el intervalo

de D para el trabajo en el laboratorio es:

0.0452 h-1 < D < 0.3616 h-1

Por lo tanto los valores de F, para los siguientes estados estacionarios se

presenta en la siguiente tabla. Además tenemos un VL=680 ml.

Calculo del los tiempos de residencias mediante la siguiente formula:

= 1 / D , µ = D

Tiempo en que se logra el estado estacionario: t = 3 x

Para la estimación del gasto en alimentación hacia el quimiostato se

considera la siguiente formula, para los 5 e.e.:

Gi = Fi x Ti

Donde:

Gi: gasto

Fi: flujo

Ti: tiempo de fermentación.

Tabla Nº 6: Flujos para los 5 estados estacionarios

68


Nº e.e D (h-1) 3τ(h)F ( ml/

min)

Gasto

medio (ml)

1 0.0706 43 0.80 2064

2 0.1060 29 1.20 2088

3 0.1588 19 1.80 2052

4 0.2206 14 2.50 2100

5 0.2650 12 3.00 2160

Total 117 10464

Alcanzando un gasto total de alimentación para los 5 e.e. de 10.464 litros

que es equivalente a 10.5 litros.

Este último valor es la velocidad de aireación específica con la que se

trabajara para alcanzar la concentración deseada.

Obtención y caracterización de un estado estacionario bajo limitación por

nitrógeno.

Nutriente limitante: nitrógeno

Concentración celular final de 3 g/l

Control de pH a 6.

Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos:

D = 0.2206

Tabla Nº 7: Composición de alimentación para obtención de estado estacionario

por limitación de nitrógeno.

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Element

oNutriente

%

célul

a

%

nutrient

e

Y x/s

(g/g)

So

(g/l)

So

(g/2.4l)

C Sacarosa

C12H22O11

52 42.10 0.505 8.91 21.38

N Extracto de Levadura------ ------ ------ 2.50 6

Mg Sulfato de magnesio

heptahidratado

MgSO4.7H2O

0.4 9.756 24.39 0.184

5

0.4428

N Sulfato de amonio

(NH4)2SO4

9.0 21.212 2.3567 1.0 2.4


potasio

KH2PO4

0.8 22.794 28.4925 0.157

9

0.3789

6


potasio

KH2PO4

2.52 28.676 11.38 0.395

4

0.9489

6

Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121ºC por 15 min.

51.1 Perturbación de un estado estacionario mediante aumento de la

concentración del nutriente limitante en la alimentación.

Habiéndose obtenido los cinco estados estacionarios en el crecimiento de la

levadura, se perturbara este estado aumentando la concentración de sacarosa

(Nutriente limitante) en la alimentación, con el cual el estado estacionario en

el que se encontraba terminará, dando lugar a un comportamiento logarítmico.

70


Tabla Nº 8: Composición de alimentación para la perturbación del medio por

sacarosa.

Este nuevo flujo tendrá una concentración de Sacarosa = 15.0 g/l. Para este

estado estacionario consideraremos los siguientes datos:

Elemento Nutriente %Célula %Nutriente Yx/s So(g/L) So(g/2.4l)

C Sacarosa

C12H22O11

52 42.10 0.505 15 36

N Extracto de

Levadura------ ------ ------ 2.50

6

Mg Sulfato de

magnesio

heptahidratado

MgSO47H2O

0.4 9.756 24.39 0.1845 0.4428

N Sulfato de amonio

(NH4)2SO4

9.0 21.212 2.3567 1.9095 4.5828


potasio

KH2PO4

0.8 22.794 28.4925 0.15790.37896


potasio

KH2PO4

2.52 28.676 11.38 0.39540.94896

Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121ºC por 15 min.

1. Determinación del contenido de azúcares reductores mediante el método del DNS.

La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) 200 mL / L de NaOH 2N 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

71


Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 ó 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.

Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a

analizar. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5

minutos para luego dejar enfriar. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

2. Determinación de la concentración celular por densidad óptica.

El método se basa en el aumentó de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismo s, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que previamente' se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm durante 20 minutos.

2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada. 3.- Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación.

3. Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se seca en la estufa a 80°C hasta peso constante.

Hidrólisis de la sacarosa

La hidrólisis se realiza con la finalidad de liberar los extremos carbonilos del azúcar, para que estos puedan reducir al DNS y así cambiar su color y este cambio pueda ser medido con el espectrofotómetro:

1. Agregar 0.5mL de HCl concentrado a la muestra y agitar.2. Mantener la solución restante en baño maria a 60º por 10min.3. Enfriar la solución con hielo por 3 min.4. Neutralizar el acido agregando 3.5mL de NaOH 1.70N y agitar.5. Tomar 1 mL de la solución resultante y trabajar con DNS.

72


52.1 Determinación de la velocidad específica máxima de crecimiento mediante

lavado

Para poner en marcha esta actividad, comenzamos realizando los siguientes

pasos:

Cortar el flujo de alimentación, después de haber transcurrido el tiempo de

fermentación; en donde se alcanza una reducción de X y µ = µmax.= 0.452h-1

Utilizando la ecuación de balance general de células:

Obtenemos la gráfica Ln X vs. t.

Utilizando la siguiente fórmula: Ln(X/Xo) = (µ-D)t,

Luego trazamos una recta tangente a la curva, considerando un D >> µmax,

entonces D = 1, y obtenemos el µmax a través de la función tangente.

73

CULTIVO CONTINUO

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