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6/marzo/2015 P1. Actividad enzimtica fosfatasa alcalina Apellidos: Plaza Jarque Nombre: Paula Grupo: A3 Profesor/a: M Angeles Ull Solis 1.- Indica las condiciones del ensayo de actividad enzimtica referidas a la concentracin de los componentes del mezcla de reaccin: Para realizar este ensayo, donde se realizan anlisis cinticos en ausencia y presencia de inhibidor, se empieza preparando directamente en las cubetas las mezclas de reaccin. Esta cintica se realiza a diferentes concentraciones de sustrato sin que vare la cantidad de enzima. Pero la cantidad que se pone de sustrato en los dos ensayos es la misma en las series homlogas, es decir, se pone la misma cantidad de sustrato en la serie 1 de ambos ensayos, en la serie 2, Entonces con los siguientes datos:

1 2 3 4 5 Sustrato 1mM 0,07 ml 0,11 ml 0,15 ml 0,30 ml 0,60 ml

Y como se sabe que a cada una de las mezclas de reaccin se le aade 0,15ml de la disolucin de la enzima, con la siguiente ecuacin se obtendr la concentracin de sustrato para cada una de las series: Serie 1: 0,07 10!!L 1 10!! M = 1,5 10!!L [S]! [S]! = 4,6666 10!!M Serie 2: 0,11 10!!L 1 10!! M = 1,5 10!!L [S]! [S]! = 7,3333 10!!M Serie 3: 0,15 10!!L 1 10!! M = 1,5 10!!L [S]! [S]! = 1 10!!M Serie 4: 0,30 10!!L 1 10!! M = 1,5 10!!L [S]! [S]! = 2 10!!M Serie 5: 0,60 10!!L 1 10!! M = 1,5 10!!L [S]! [S]! = 4 10!!M Estas son las concentraciones que presentar el sustrato en cada serie. Y como se ha dicho anteriormente la concentracin en el ensayo con inhibidor y sin inhibidor es la misma, ya que se pone el mismo volumen en los dos ensayos.

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2.- Cintica de la fosfatasa alcalina en ausencia (Tabla 1) o en presencia (Tabla 2) de fosfato inorgnico. Completa las Tablas teniendo en cuenta el valor del coeficiente de extincin molar del producto de la reaccin. = 1,7 10! M!!cm!! Determinar los valores de Km y vmax empleando la representacin de Lineweaver-Burk. Para poder obtener la pendiente, se ha tenido que realizar una representacin de la absorbancia que presenta cada cubeta frente al tiempo en el que se mide. En cada cubeta se introduce lo que indica en el guin: Tabla 1.1. Absorbancia en un determinado tiempo a =400nm.

20s 40s 60s 80s 1 0,073 0,127 0,178 0,225 2 0,075 0,149 0,222 0,285 3 0,095 0,182 0,27 0,35 4 0,113 0,219 0,326 0,429 5 0,12 0,242 0,363 0,48

Representacin 1. Absorbancia frente al tiempo. Con la pendiente de cada una de las siguientes series se podrn determinar los siguientes parmetros:

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Tabla 1. Ausencia de inhibidor.

Cubeta A400/s v0 (M s-1) v0-1 (M s-1)-1 [S] (M) [S]-1 (M)-1

1 0,0025 1,47059E-07 6800000 4,66667E-05 21428,571 2 0,0035 2,05882E-07 4857142,857 7,33333E-05 13636,363 3 0,0043 2,52941E-07 3953488,372 0,0001 10000 4 0,0053 3,11765E-07 3207547,17 0,0002 5000 5 0,006 3,52941E-07 2833333,333 0,0004 2500 Ahora se tendr que realizar el mismo procedimiento pero con presencia de inhibidor, donde se ver que la velocidad es menor. Entonces se mide tambin la absorbancia de las diferentes series a los distintos tiempos, para poder obtener la pendiente de la recta que hace referencia a A400/s. Tabla 2.1 Absorbancia con inhibidor en un determinado tiempo a =400nm.

20s 40s 60s 80s 1 0,023 0,044 0,066 0,088 2 0,03 0,061 0,09 0,12 3 0,039 0,08 0,118 0,157 4 0,057 0,105 0,153 0,2 5 0,085 0,162 0,241 0,32

Representacin 2. Absorbancia con inhibidor frente al tiempo Con esta representacin se podrn obtener los siguientes datos:

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Tabla 2. Presencia de inhibidor Cubeta A400/s v0 (M s-1) v0-1 (M s-1)-1 [S] (M) [S]-1 (M)-1

1 0,0011 6,47059E-08 15454545,45 4,66667E-05 21428,571 2 0,0015 8,82353E-08 11333333,33 7,33333E-05 13636,363 3 0,002 1,17647E-07 8500000 0,0001 10000 4 0,0024 1,41176E-07 7083333,333 0,0002 5000 5 0,0039 2,29412E-07 4358974,359 0,0004 2500 Una vez que se tienen todos estos datos, se puede realizar la representacin de dobles inversos para as poder calcular Km y Vmax, donde se representar el inverso de la velocidad inicial frente a la inversa de la concentracin tanto del ensayo con inhibidor como sin inhibidor. El punto donde se nos cortan las dos rectas (que tericamente, se deben cortar en el eje de ordenadas) se tendr el inverso de la velocidad mxima, y cuando se corte en el eje de abscisas, se tendr el inverso de Km. Dicha informacin se obtiene del diagrama de Lineweaver-Burk. Su utilidad consiste en el recproco de la cintica de Michaelis-Mentel: ! = !"# ! + 1! = 1!"# + !!"# 1[] Realizando la representacin: Representacin 3. Inverso de la velocidad frente al inverso de la concentracin. 3.1 Sin inhibidor 3.2 Con inhibidor

v0-1 (M s-1)-1 [S]-1 (M)-1 6800000 21428,57143

4857142,857 13636,36364 3953488,372 10000 3207547,17 5000

2833333,333 2500

v0-1 (M s-1)-1 [S]-1 (M)-1 15454545,45 21428,57143 11333333,33 13636,36364

8500000 10000 7083333,333 5000 4358974,359 2500

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Pero en dicha representacin no se ve donde cortan las rectas en el eje de ordenadas ni en el eje de abscisas, por lo tanto se tiene que realizar una extrapolacin. Para hacer dicha extrapolacin, se tiene que hacer ms pequea la escala, ya que el programa Excel no permite realizar extrapolaciones en escalas tan grandes. Entonces se han multiplicado todos los factores por 10-4. A parte, para mejorar el coeficiente de regresin se quita de la recta el punto 4 del ensayo con inhibidor, ya que al quitarlo el coeficiente de regresin aumenta, pero no ocurre lo mismo en la recta sin inhibidor, porque cuando se quita dicho punto, la recta de regresin apenas cambia. Teniendo en cuenta todos estos factores la grfica que se obtiene es la siguiente: Representacin 4. Dobles inversos extrapolado. Se observa como las rectas no cortan en el eje de ordenadas, como debera de ser tericamente. Se podra hacer una igualdad entre las dos ecuaciones de la recta, pero segn la ecuacin de Michaelis-Mentel no se podra hacer ese sistema de ecuaciones,Por lo tanto, el valor que se obtiene de vmax, en la reaccin sin inhibidor es la siguiente:

209,96x+212,3=y y=209,960+212,3

y=212,3104 1!"# = 212,05 10! ; !"# = 4,71031 10!! !!

Y respecto a la vmax de la reaccin con inhibidor, se obtiene que:

592,97x+286,05=y

y=592,97(-0,192553)+286,05 y=286,05104

1!"# = 286,05 10! ; !"# = 3,496014 10!! !!

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Se ve como difieren unas unidades. El valor que se debera de obtener sera obtener, es para ambas, la misma vmax y cortar en el eje de ordenadas. Y el valor de Km ser, y=0 respecto a la de sin inhibidor;

209,96x+212,3=y

x=-1,0111 1! = 1,011 10! ; ! = 9,8897 10!!

Y el de Km ser, y=0 respecto a la de con inhibidor;

592,97x+286,05=y x=-0,4824

1k! = 0,4824 10! ; k! = 2,0729 10!!

Por ltimo, se calcula el valor de Ki: K!! = K!(1+ IK!) Donde se tiene que el valor de la concentracin del inhibidor [I]=10-4M Por lo tanto, sustituyendo se obtiene dicho valor: 2,0729 10!! = 9,8897 10!! 1+ 10!!K! K! = 9,123928 10!!