Simulacon de La Produccion de Acido Lactico

7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico

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EVALUACIN Y SIMULACIN DE LA PRODUCCIN DE CIDO

LCTICO CON Lactobacillus caseiATCC 7469

DIEGO ANDRS SUREZ ZULUAGA

DEPARTAMENTO DE INGENIERA DE PROCESOS

ESCUELA DE INGENIERA

UNIVERSIDAD EAFIT

MEDELLN

2007


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EVALUACIN Y SIMULACIN DE LA PRODUCCIN DE CIDO

LCTICO CON Lactobacillus caseiATCC 7469

DIEGO ANDRS SUREZ ZULUAGA

Proyecto de grado para optar al ttulo de

Ingeniero de Procesos

ASESOR

MRes. VALESKA VILLEGAS ESCOBAR

DEPARTAMENTO DE INGENIERA DE PROCESOS

ESCUELA DE INGENIERA

UNIVERSIDAD EAFIT

MEDELLN2007


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Nota de aceptacin

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Jurado

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Jurado

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Jurado


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A mis padres


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AGRADECIMIENTOS

Se le expresa agradecimiento por su colaboracin a:

MRes. Valeska Villegas E. por su asesora.

MSc. Catalina Giraldo. Por su colaboracin en varios temas.

MSc. Luz Deisy Marn. Por su ayuda con las cromatografas.

Personal del laboratorio de Ingeniera de Procesos: Edgar Arbelaez y

Sigifredo Crdenas

Maria Adelaida Chica. Al trabajar conmigo en la simulacin en HYSYS.

Esteban Jaramillo F. por sus consejos para las otras simulaciones.


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VI

TABLA DE CONTENIDO

LISTA DE TABLAS .IX

LISTA DE FIGURAS X

LISTA DE ECUACIONES.XII

RESUMEN.........XIII

INTRODUCCIN15

OBJETIVOS.17

Objetivo general. ......................................................................................17

Objetivos especficos. ..............................................................................17

1 MARCO TEORICO.18

1.1 EL CIDO LCTICO..................................................................18

1.2 USOS DEL CIDO LCTICO....................................................21

1.3 LOS MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ACIDO

LCTICO..................................................................................................24

1.4 FERMENTACIONES. ................................................................28

1.4.1 Parmetros de relevancia en la produccin de cido

lctico....29

1.4.2 Consideraciones del proceso33

1.5 LOS PROCESOS DE SEPARACIN. .......................................33

1.5.1 Extraccin reactiva.35

1.5.2 Adsorcin.35

1.5.3 Electrodilisis..35

1.5.4 Esterificacin y destilacin reactiva.36

1.5.5 Proceso de separacin del cido lctico36

1.6 EL MERCADO DEL CIDO LCTICO ......................................37

1.6.1 Precios y costos..37

1.6.2 Produccin y cuantificacin de la oferta existente38

1.6.3 Crecimiento esperado y factores que inciden38

1.6.4 Proyeccin de la demanda39


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VII

1.7 SIMULACIN DE PROCESOS BIOTECNOLOGICOS .............40

1.7.1 Modelo de simulacin.41

2 MATERIALES Y MTODOS.44

2.1 LOCALIZACIN.........................................................................44

2.2 MEDIO DE CULTIVO.................................................................44

2.3 MICROORGANISMO UTILIZADO.............................................44

2.4 MTODOS ANALTICOS .......................................................... 47

2.4.1 MEDICIN DE BIOMASA.47

2.4.2 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA..48

2.4.3 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE CIDO LCTICO

...48

2.5 FERMENTACIONES .................................................................49

2.5.1 Evaluacin de la concentracin de carbonato de calcio..49

2.5.2 Sistema batch en biorreactor50

2.5.3 Sistema Fed-batch..51

2.6 SIMULACIN.............................................................................53

2.7 ANLISIS ESTADSTICO.......................................................... 54

3 RESULTADOS Y DISCUSIN.55

3.1 VARIACIN DE LA CONCENTRACIN DE CARBONATO DE

CALCIO ...55

3.2 PROCESO FERMENTATIVO EN MODO BATCH EN

BIORREACTOR.......................................................................................59

3.3 FERMENTACIONES FED-BATCH............................................63

3.3.1 Fed-batch 1..63

3.3.2 Fed-batch 2..65

3.3.3 Fed-batch 3..67

3.4 SIMULACIN.............................................................................72

3.4.1 Simulacin del biorreactor en modo batch.72

3.4.2 Simulacin en Superpro Designer76

3.4.3 Simulacin en HYSYS79

4 CONCLUSIONES...87


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VIII

5 RECOMENDACIONES..90

6 BIBLIOGRAFIA91

ANEXO 1. ...98

ANEXO 2101

ANEXO 4105

ANEXO 5110


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IX

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Propiedades del cido lctico ..18

Tabla 2. Estadsticas de las Importaciones de Colombia por Pases para el

cido lctico.40

Tabla 3. Composicin del medio de cultivo MRS..45

Tabla 4. Parmetros productivos bajo diferentes concentraciones de

carbonato de calcio58

Tabla 5. Parmetros productivos de cido lctico en un biorreactor en

modo batch..60

Tabla 6. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 1..65

Tabla 7. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 2..66

Tabla 8. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 3.68

Tabla 9. Resultados obtenidos con las diferentes configuraciones

evaluadas.69

Tabla 10. Parmetros cinticos obtenidos en Polymath

6.0..73

Tabla 11. Tabla de corrientes.. 78

Tabla 12. Tabla de corrientes.. 82

Tabla 13. Tabla de Equipos y Utilities 83

Tabla 14. Grados de libertad utilizados en los equipos.. 85

Tabla 15. Matriz de indicadores de proceso. 86


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X

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estreoformas del cido lctico. ...............................................19

Figura 2. Mtodos de produccin de cido lctico. .................................. 20

Figura 3. Diagrama de los usos comerciales y aplicaciones del cido

lctico. ......................................................................................................21

Figura 4. lbum filogentico de bacterias cido lcticas (LAB) y bacterias

relacionadas.............................................................................................25

Figura 5. Rutas metablicas en LAB para obtener cido lctico..............27

Figura 6. Proceso de separacin del cido lctico...................................37

Figura 7. Lactobacillus casei ATCC 7469 ............................................... 45

Figura 8. Lifilo.........................................................................................46

Figura 9. Sistema de perlas Cryobank. ....................................................47

Figura 10.Agitador lineal con control de temperatura...............................50

Figura 11. Biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 ...............................51

Figura 12. Cintica de las fermentaciones variando la concentracin de

carbonato de calcio 56

Figura 13. Cintica de Fermentacin en biorreactor en modo batch........60

Figura 14. Cintica de la fermentacin fed-batch 1..................................64



Figura 17. Resultados obtenidos con las diferentes configuraciones

evaluadas.................................................................................................71

Figura 18. Comparacin de los valores experimentales y simulados para

la cintica de la biomasa..........................................................................75


la cintica de sustrato...............................................................................75


la cintica de produccin de cido lctico. ............................................... 76

Figura 21. Velocidad Especifica de Crecimiento vs. Concentracin de


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XI

Sustrato.................................................................................................... 77

Figura 22. Diagrama de flujo de la fermentacin......................................78


la cintica de produccin de cido lctico ................................................ 79

Figura 24. Diagrama de flujo del proceso.................................................84


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XII

LISTA DE ECUACIONES

Ecuacin 1.Modo diferencial del modelo de crecimiento logstico... 40

Ecuacin 2. Forma integrada de la ecuacin de crecimiento logstico. 41

Ecuacin 1. Modo diferencial de la ecuacin de Luedeking-Piret..41

Ecuacin 4. Ecuacin de consumo de glucosa.... 41

Ecuacin 5.Concentracin (g/L) de biomasa 48

Ecuacin 6. Rendimiento observado de sustrato en producto (g/g). 52

Ecuacin 7. Productividad volumtrica (g/L.h).. 53

Ecuacin 8. Rendimiento observado de sustrato en biomasa (g/g)...53

Ecuacin 9. Ecuacin de Monod..77


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XIII

RESUMEN

El cido lctico y sus derivados han sido ampliamente usados en el rea

alimenticia, farmacutica y en aplicaciones industriales. Este puede sufrir

una gran cantidad de conversiones qumicas hacia compuestos

potencialmente tiles como el xido de propileno, el propilenglicol, el

cido acrlico, 2,3 pentanodionas, los steres de lactato y el cido

polilctico (polmero biodegradable que podra ser un buen sustituto para

plsticos sintticos derivados del petrleo). Debido a la gran cantidad de

oportunidades que existen en el mercado para este compuesto, la

produccin del cido lctico se evalu por medio de procesos de

biotransformacin con Lactobacillus casei ATCC 7469 bajo diferentes

concentraciones de carbonato de calcio como agente regulador del pH,

as como el modo de operacin batch y fed-batch por pulsos en un

biorreactor de 3 L. Adicionalmente, se ajust la cintica de crecimiento de

biomasa a la ecuacin logstica, la cintica de produccin de cido lctico

a la ecuacin de LuedekingPiret, y la cintica de consumo de sustrato a

la propuesta por Islam et al. (2003). Se encontr que la concentracin de

carbonato de calcio no tuvo efecto significativo sobre la produccin de

cido lctico (P>0.05), y que no haban diferencias significativas entre el

modo batch y fed-batch. Contrario a lo reportado por Guoqiang et al.

(1991) no hubo mejora de los parmetros productivos (productividad de

acido lctico, rendimiento observado de sustrato en producto, y

concentracin de acido lctico) con el cambio en el modo de operacin de

batch a fed-batch, pero la cantidad en gramos producidos en el proceso

fed-batch fue significativamente superior (P


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XIV

Adicionalmente, se realiz una simulacin de la fermentacin en modo

batch, con los modelos que se ajustaron al proceso.

Palabras clave:Fermentacin cido lctica, Lactobacillus casei,modelos

cinticos, fed-batch, simulacin.


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15

INTRODUCCIN

El mercado del cido lctico parece estar en crecimiento, con precios

estables y a la espera de una demanda en aumento. Aunque el mercado

de cido lctico en alimentos y bebidas se est expandiendo, se espera

que otras aplicaciones industriales crezcan rpidamente, por ejemplo que

la demanda de polmeros y solventes ambientalmente amigables a partir

de cido lctico se incremente sustancialmente en los prximos aos

(Jarvis, 2001).

Actualmente, a nivel mundial, algunos observadores aseguran que la

produccin de esta compuesto tiene un incremento de 12-15% anual

(Joglekar et al., 2006), y se tiene proyectado un aumento de la demanda

de un 45.5% anual para el uso en polmeros biodegradables (Jarvis,

2001).

Ante la demanda en aumento y ya que en Colombia no existen hasta

ahora empresas que lo produzca, con este trabajo se pretende iniciar

una investigacin alrededor del tema que genere conocimiento para el

sector productivo. Para esto se comenz a estudiar la produccin de

cido lctico por medio de la fermentacin bacteriana, aunque tambin

puede serlo a travs de la hidrlisis del lactonitrilo (Hagerdal yHofvendahl, 2000).

Debido a las razones anteriormente mencionadas, se estudiaron algunas

de las variables del proceso de produccin del cido lctico. Inicialmente

se evalu la concentracin de carbonato de calcio, el cual reacciona con

el acido lctico producido por la bacteria para evitar una cada del pH y

por consiguiente evitar la inhibicin del lactobacilo. Posteriormente, se


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16

estudi el modo de fermentacin, realizando una comparacin entre el

modo batch y el modo fed-batch con alimentacin de sustrato por pulsos.

Para la realizacin de esta investigacin se utiliz una cepa certificada, el

Lactobacillus casei ATCC 7469, el cual ha tenido un buen

comportamiento en la fermentacin para produccin de cido lctico en

estudios anteriores (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).


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17

OBJETIVOS.

Objetivo general.

Evaluar y simular la produccin de cido lctico con Lactobacillus casei

ATCC 7469, en sistemas de cultivo batch y fed-batch a nivel de

laboratorio por medio de la cuantificacin de los parmetros cinticos y de

la utilizacin de un software de simulacin.

Objetivos especficos.

Evaluar la cintica de crecimiento, consumo de sustrato y

formacin de cido lctico con Lactobacillus casei ATCC 7469 por

mtodos gravimtricos en un sistema de fermentacin batch

variando las concentraciones de carbonato de calcio, para

determinar las mejores condiciones de fermentacin.

Evaluar la cintica de formacin de biomasa, de consumo de

sustrato y formacin de cido lctico con Lactobacillus casei ATCC

746 por mtodos gravimtricos en un sistema de alimentacin fed-

batch por pulsos variando el flujo de alimentacin, para determinar

las mejores condiciones de fermentacin.

Simular la fermentacin de cido lctico en modo batch por medio

de la utilizacin de un software comercial.


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18

1 MARCO TERICO

1.1 EL CIDO LCTICO

El cido lctico se ha usado como preservativo natural en productos

alimenticios desde hace mucho tiempo. Actualmente, es usado en una

amplia variedad de aplicaciones industriales especializadas (Reddy et al.,

2007).

La Tabla 1 muestra algunas de las propiedades del cido lctico.

Tabla 1.Propiedades del cido lctico (Merck S.A., 2006).

PROPIEDAD CONCENTRACINTEMPERATURA

/ PRESINVALOR /

CUALIDAD UNIDADESEstado fsico aceitosoColor incoloroOlor inodoroValor pH a 10 g/L H2O (20C) 2.8ViscosidadDinmica (20C) 20-40 mPa*sPunto de Fusin 18 CPunto de ebullicin (20 hPa) 122 CTemperatura deignicin no combustiblePunto de

inflamacin no inflamablePresin de vapor (25C) 0.1 hPaDensidad (20C) 1.21 g/cm3Solubilidad enagua (20C)

Fcilmentesoluble


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El cido lctico (cido 2-hidroxipropanoico), es un compuesto incoloro de

frmula CH3CHOHCOOH. Es una de las molculas pticamente activas

ms pequeas de la naturaleza y se encuentra bajo dos formas: la

dextrgira D(-) y levgira L(+), frecuentemente denominadas cido D-

lctico y cido L-lctico (Figura 1). Es producido por animales, plantas y

microorganismos en la naturaleza. Tambin puede ser derivado a partir de

intermedios con un origen en materiales renovables (por ejemplo

acetaldehdo, etanol) o a partir de qumicos derivados del carbn

(acetileno) o aceites (etileno) (Sodergard y Stolt, 2002).

Figura 1.Estreoformas del cido lctico (Sodergard y Stolt, 2002).

Ya que niveles elevados del ismero D (-) son peligrosos para los

humanos, el ismero L(+) es preferido (Akerberg et al., 1998).

Aproximadamente el 90% del total del cido lctico es producido a travs

de fermentacin bacteriana y el resto sintticamente por la hidrlisis de

lactonitrilo (Gokhale et al., 2006) (Figura 2). Esta ltima siempre resulta en

su mezcla racmica, lo cual es su mayor desventaja; mientras que la

produccin fermentativa puede originar ya sea uno de los ismeros, o la

mezcla racmica, dependiendo en el microorganismo, sustrato y

condiciones de cultivo usadas. La produccin fermentativa ofrece las

ventajas de utilizacin de carbohidratos renovables y de la produccin del

cido L o D pticamente puro. Las propiedades fsicas de uno de los

principales derivados del cido lctico, el cido polilctico, dependen de

la composicin isomrica del monmero (Akerberg et al., 1998).


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Figura 2.Mtodos de produccin de cido lctico. (a) Sntesis qumica,

(b) fermentacin microbiana. (SSF) Sacarificacin y fermentacin

simultnea. (Wee et al., 2006.)

Solo MezclaRacmica

RecursosPetroqumicos

Acetaldehdo(CH3CHO)

Lactnitrilo

A) SntesisQumica

B) Fermentacincon

microorganismos

Adicin de HCN ycatalizador

Hidrlisis con H2SO4 Recuperacin ypurificacin

CaldoFermentado

Fermentacin conmicroorganismos

Carbohidratosfermentables

FuentesRenovables

Deseable debido

a:

1) Asuntosambientales

recientes

2) Cantidad limitada derecursos petroqumicos

cido Lctico L(+) D(-) pticamente

Puro


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Para que el cido lctico sea usado en nuevas aplicaciones y mercados

emergentes, es esencial un proceso de manufactura econmico, eficiente

y ambientalmente seguro, capaz de optimizar los altos costos de

separacin y purificacin (Bolaos et al., 2000).

1.2 USOS DEL CIDO LCTICO.

En la figura 3 se muestra una visin general de sus posibles usos:

Figura 3. Diagrama de los usos comerciales y aplicaciones del cido

lctico (Wee et al., 2006).

El cido lctico ha recibido bastante atencin como qumico debido a su


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22

gran cantidad de usos potenciales. Existen cuatro grandes reas en las

que es usado actualmente: alimenticia, cosmtica, farmacutica y en

aplicaciones qumicas. Las aplicaciones potenciales estn ilustradas en la

Figura 3. Es clasificado como GRAS (Generalmente Reconocido Como

Seguro) para su uso como aditivo alimenticio, por lo cual es ampliamente

usado en casi todos los segmentos de la industria alimenticia, debido a su

gran cantidad de funciones, como saborizante, regulador del pH,

mejorador de la calidad microbiana y fortificante mineral.

Este es un compuesto que tambin es usado comercialmente en las

industrias de las aves de corral y de las carnes, ya que aumenta sutiempo de almacenamiento y sabor y controla patgenos. Debido a su

sabor cido, tambin es usado como acidulante en ensaladas, productos

de panadera, bebidas, en confitera no solo como saborizante sino

tambin como controlador del pH durante el proceso. Las ventajas de usar

este compuesto en la industria incluyen su bajo costo, fcil manejo y la

capacidad de producir dulces incoloros (Wee et al.,2006).

Este es un cido que agrega ingredientes naturales para aplicaciones

cosmticas. Aunque inicialmente fue usado como humectante y regulador

del pH, posee mltiples propiedades, entre ellas la actividad

antimicrobiana y rejuvenecedor e hidratante de la piel. El efecto

humectante est directamente relacionado con la capacidad de retencin

de agua del lactato y el rejuvenecimiento de la piel es producido por la

supresin de la formacin de tironasa. Ya que son ingredientes naturalesdel cuerpo humano, tanto el cido como sus sales tienen perfecta acogida

en las nuevas tendencias hacia formulaciones naturales y seguras y con

efectos que los hacen muy atractivos como ingredientes activos en los

cosmticos (Wee et al., 2006)

Tambin es usado en la industria farmacutica como electrolito en

soluciones intravenosas que sirven para aumentar los fluidos del cuerpo.


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23

Adems, se emplea en una amplia variedad de productos minerales,

como tabletas, prtesis, suturas quirrgicas y sistemas controlados de

entrega de droga (Wee et al., 2006).

El cido lctico y sus sales son usados en varios tipos de productos y

procesos qumicos, por ejemplo: como agente de desincrustacin,

regulador del pH, neutralizador, intermedio quiral, solvente, agente de

limpieza, agente de liberacin de acidez, agente antimicrobiano y agente

humectante. Tambin tiene un uso emergente como solvente seguro, el

cual es una alternativa en muchas aplicaciones de limpieza fina en la

industria metalmecnica. Debido a la alta capacidad de solvencia y a lasolubilidad de cido lctico, es un excelente removedor de polmeros y

resinas. Est disponible con una pureza isomrica mayor al 98%, y sirve

como materia prima en la produccin de herbicidas o productos

farmacuticos. Debido a que presenta mejores propiedades de

desincrustacin que los productos orgnicos tradicionales, es usado en

muchos productos de este tipo, tales como, limpiadores de baos,

cafeteras y sanitarios. El etil lactato es usado en preparaciones antiacn,ya que combina excelente solvencia contra aceites y manchas

polimricas, con el hecho de no tener impactos ambientales ni efectos

toxicolgicos (Wee et al., 2006).

Actualmente, es considerado la materia prima monomrica con mayor

potencial para conversiones qumicas, pues tiene dos grupos funcionales

reactivos, uno carboxlico y otro hidroxilo. Adicionalmente, este puedetener conversiones hacia qumicos potencialmente tiles, como el xido

de propileno (va hidrogenacin), cido propanoico (va reduccin), cido

acrlico (va deshidratacin), acetaldehdo (va descarboxilacin), 3-

pentanodiona (va condensacin), y dilctido (va auto esterificacin).

Tambin ha recibido mucha atencin como monmero para la produccin

de cido polilctico, el cual es un polmero biodegradable. El cido lctico

pticamente puro puede ser polimerizado en cido polilctico de alto peso


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molecular a travs de una serie de conversiones de policondensacin,

despolimerizacin y polimerizacin de apertura de anillo. El polmero

resultante, tiene numerosos usos en una gran cantidad de aplicaciones,

como ropa protectora, empaque de alimentos, bolsas de basura,

contenedores rgidos, empaques flexibles y bandejas de vida corta (Wee

et al., 2006).

Diferentes reportes en los que se evalan las propiedades de los

polmeros del cido lctico han demostrado sin duda alguna que tienen

potencial para muchas aplicaciones diferentes, debido a la posibilidad de

modificar las propiedades dentro de un rango amplio. Estos, en adicin asu probada degradabilidad en sistemas biolgicos y su verificada

biocompatibilidad, hacen de estos polmeros muy promisorios

especialmente en aplicaciones mdicas (Sodergard y Stolt, 2002).

Se ha reportado que la estructura de estos polmeros tiene elevada

estabilidad en sus propiedades mecnicas y termo fsicas, lo que los hace

aptos para ser usados en aplicaciones mdicas en donde estaspropiedades son muy importantes (Sodergard et al., 2002).

1.3 LOS MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ACIDO

LCTICO.

Las bacterias cido lcticas (LAB) son ampliamente usadas enfermentaciones industriales de alimentos y estn recibiendo gran atencin

por su uso como fbricas celulares para la produccin de compuestos

industriales y farmacuticos. La conversin glicoltica de azcares a cido

lctico es la ruta metablica ms importante en estas bacterias.

Las LAB son microorganismos de crecimiento rpido con pequeos

genomas, metabolismo simple y relevancia industrial. Estas son un grupo


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de bacterias Gram-positivas relacionadas filogenticamente, que incluye

Lactococcus y Lactobacillus sp. (Figura 4). Adems, son consideradas

fbricas celulares programadas que producen cido lctico a partir de

azcares y son usadas en varias aplicaciones industriales (Vos y

Hugenholtz, 2004).

Figura 4. lbum filogentico de bacterias cido lcticas (LAB) y bacterias

relacionadas (Vos y Hugenholtz 2004).

Las LAB consisten en los gneros: Carnobacterium, Enterococcus(Ent),

Lactobacillus (Lb), Lactococcus (Lc), Leuconostoc (Leu), Oenococcus,

Pediococcus (Ped), Streptococcus(Str), Tetragenococcus, Vagococcus, y

Weissella.(Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

Son microorganismos de tipo coc, con la excepcin de los Lactobacillus

y Carnobacteriaque son bastones (rods), incapaces de sintetizar ATP por

respiracin, y que tienen el cido lctico como el mayor producto final a

partir de la conservacin de energa en la fermentacin de azcares. La

mayor parte de LAB son anaerobios facultativos, catalasa negativos, y no

formadores de esporas. Tienen alta tolerancia a los cidos y sobreviven a


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pH de 5 y menores. Su tolerancia cida les da ventaja sobre otras

bacterias. Su temperatura de crecimiento ptima vara entre 20 y 45 C.

La mayor parte de ellas son consideradas GRAS, pero algunas de las

cepas como Streptococci son patognicas. Todos los gneros LAB

pertenecen a la subdivisin Clostridium (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

Estos microorganismos tienen requerimientos nutricionales complejos,

debido a su limitada habilidad para sintetizar vitaminas B y aminocidos.

Por lo que existen ambientes naturales ricos en nutrientes como plantas,

leche y dentro de cuerpos de humanos y animales. Los LAB han sido

usadas por los humanos para la fermentacin de comidas y productosalimenticios desde la antigedad y su mayor aplicacin actual es todava

en la industria de alimentos, por ejemplo en la produccin de productos

lcteos, carne y vinos. Las aplicaciones tcnicas actuales de las LAB

incluyen la produccin de dextrano a partir de sucrosa por Leuconostoc

mesenteroides, la produccin de lisina a partir de Lactococcus lactis ssp.

lactis y la produccin de cido lctico para diferentes aplicaciones.

Tambin se ha sugerido que las LAB podran ser usadas como vectorespara medicina oral.

Las LAB fermentan azcares a travs de diferentes rutas metablicas

resultando en fermentaciones homo, hetero y cida mezclada (Figura 5)

(Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

En la homofermentacin se obtiene cido lctico como el producto finaldel metabolismo de la glucosa, usando la ruta metablica Embed-

Meyerhof-Parnas (Figura 5A). En la fermentacin se forman cantidades

equimolares de cido lctico, dixido de carbono y etanol o acetato, a

partir de la glucosa a travs de la ruta metablica de la fosfoquetolasa

(Figura 5B). La relacin de etanol y acetato depende en el potencial redox

del sistema. Esta ruta es usada por heterofermentadores facultativos

como Lactobacillus casei, para la fermentacin de pentosas, y la


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27

fermentacin de hexosas y pentosas por homofermentadores obligados

como Leuconostoc. Todas las LAB excepto Lactobacillitipo I (por ejemplo

Lactobacillus delbrueckii) son capaces de fermentar pentosas, por lo que

son heterofermentadores facultativos. (Hagerdal y Hofvendahl, 2000)

Figura 5.Rutas metablicas en LAB para obtener cido lctico (Hagerdal

y Hofvendahl, 2000).

Homofermentacin (A), heterofermentacin (B), y fermentacin cida

mezclada (C), P = fosfato, BP = bifosfato, LDH = lactato deshidrogenasa,

PFL = liasa piruvato formato, y PDH = piruvato deshidrogenasa

Los cidos mezclados son formados por homofermentadores como

Lactococcidurante la limitacin de la glucosa y durante el crecimiento en

otros azcares, por ejemplo el Lactococcus lactis cuando crece en

maltosa o lactosa o a pH elevados y bajas temperaturas produce, adems

del cido lctico, etanol, acetato y formato. Durante estas condiciones la

ruta metablica homofermentativa es usada, pero la diferencia est en el


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metabolismo del piruvato, que en adicin al cido lctico tambin es

metabolizado en acetil-CoA por la piruvato formato liasa (PFL) (Figura

5C). En la presencia de oxgeno la PFL es inactivada y se activa una ruta

alternativa del metabolismo del piruvato va piruvato deshidrogenasa

(PDH), resultando en la produccin de dixido de carbono, acetil-CoA y

NADH (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

El grupo de los lactobacilos homofermentativos est integrado por

Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus lactis y

Lactobacillus acidophilus (Snchez y Ramrez, 2004).

1.4 FERMENTACIONES.

Se han patentado numerosos procesos de produccin fermentativa de

cido lctico. Ellos incluyen la fermentacin de desecho de almidn

industrial, por ejemplo de papa, con una mezcla de cinco cepas de

Lactobacillus. Tambin se ha reportado el uso de permeado de suero enun proceso continuo con recirculacin celular y electrodilisis (Bailey et

al., 1998)de material lignocelulcico y una cepa de Lactobacillus capaz

de fermentar xilosa. Varias patentes describen la produccin de cido

lctico pticamente puro, ya sea L(+) (Veringa, 1994), o D(-) (Severson y

Barrett, 1995). En una patente se describe el desarrollo de una cepa de

Lactobacillus delbrueckii tolerante al cido lctico (Robison, 1988),

tambin han sido patentados mtodos de purificacin a partir del caldo defermentacin con electrodilisis (Miura y Kumagai, 1995), separacin por

membranas (Russo y Kim, 1996) y esterificacin (Kumagai et al., 1994).

Muchos parmetros influencian la eficiencia de los procesos de

fermentacin. Debido a la tolerancia al oxgeno de las LAB la mayor parte

de las fermentaciones son llevadas a cabo sin control de oxgeno. En todo

caso se prefiere condiciones anaerobias a condiciones aerobias o


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29

microaeroflicas (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

La efectividad de un proceso puede ser medida como la concentracin del

cido lctico producida, como el rendimiento de cido lctico basado en el

sustrato y como la productividad.

1.4.1 Parmetros de relevancia en la producc in de cido lctico.

1.4.1.1 pH: El pH de la fermentacin puede fijarse al comienzo y

permitirse disminuir debido a la produccin del cido, o puede sercontrolado por titulacin, extraccin, absorcin o electrodilisis del cido

lctico. Su efecto ha sido estudiado bajo diferentes valores. En todos los

casos, la titulacin a un pH constante ha resultado en concentraciones

iguales o mayores, en comparacin con los casos donde no hay control

de este (Hagerdal y Hofvendahl, 2000). La remocin del cido por

electrodilisis y extraccin, incluyendo sistemas de dos fases acuosos, ha

sido usado satisfactoriamente en varios sistemas, mientras en otros latitulacin ha dado los mismos o mejores resultados (Ye et al., 1996). El pH

ptimo para la produccin de cido lctico vara entre 5.0 y 7.0. Un pH

menor a 5.7 ha sido ptimo para las cepas de Lactobacillus, las cuales

son conocidas por tolerar menores valores de pH que las Lactococci

(Kashket, 1987).

1.4.1.2 Fuente de carbono: Diferentes sustratos han sido usados

para la produccin fermentativa de cido lctico con LAB. El producto

ms puro ha sido obtenido cuando un azcar puro es fermentado,

resultando en menores costos de purificacin; pero esto es

econmicamente desfavorable, porque los azcares puros son costosos y

el cido lctico es un producto econmico. En vez de ellos los productos

de desechos de la agricultura y la silvicultura son utilizados. Comparando


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diferentes fuentes de carbono se observa que la glucosa arroja mayores

concentraciones de cido lctico y rendimientos que con otros azcares.

La xilosa, galactosa, arabinosa, lactosa, fructosa y celulosa hidrolizada

han sido menos efectivos (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

1.4.1.3 Fuente de Nitrgeno: La composicin del medio ha sido

investigada en muchos aspectos, incluyendo la adicin de varios

nutrientes en la forma de extracto de levadura, peptona o jarabe de maz.

Las concentraciones de la fuente de nitrgeno en el medio de cultivo se

encuentran, por lo general, entre 10 y 25 gr/L, mostrando que la adicinde nutrientes y concentraciones ms altas de estos, tienen un efecto

positivo en la produccin de cido lctico. Con solo extracto de levadura

se obtiene mayor produccin de cido lctico que con extracto de

levadura y peptona en bajas cantidades, pero lo opuesto ocurre cuando la

concentracin de extracto de levadura se mantiene constante y se

adiciona peptona (Amrane y Prigent, 1997).

1.4.1.4 Temperatura: El efecto de la temperatura en la produccin

de cido lctico ha sido estudiado en pocos reportes. La temperatura que

da mayores productividades es en algunos casos menor que la

temperatura que resulta en el mayor rendimiento y concentracin de cido

lctico, mientras que en otros la misma temperatura obtuvo los mismos

resultados en todas las categoras. Por ejemplo, para el Lactobacilluscaseiy Lactobacillus paracaseila temperatura ptima fue reportada entre

37 y 44C (Linko y Javanainen, 1996).

1.4.1.5 Densidad Celular: Las ms altas densidades celulares (48-

103 gr/L) han sido logradas con recirculacin, pero en fermentaciones sin

recirculacin se han alcanzado concentraciones entre 60 y 77 g/L de


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clulas. La fermentacin de las LAB, por lo general est acompaada de

un incremento en la masa celular, lo que constituye un subproducto

indeseado si el objetivo del proceso es la produccin de cido lctico.

Pero, al obtener altas concentraciones de microorganismos, estos

pueden ser usados como las materias primas principales en la produccin

de probiticos (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

1.4.1.6 Ismeros del cido Lctico: La mayor parte de las LAB

producen solo un ismero, pero en algunos casos una pequea cantidad

del otro ismero es producida. Lactobacillus helveticus y Lactobacillus

plantarum producen una mezcla racmica cuya composicion vara. La

enzima lactato deshidrogenasa es estereoespecfica, produciendo cido

lctico D L; la(s) forma(s) de la enzima presente en la bacteria

determina cual ismero es producido. Para algunas aplicaciones, como la

sntesis de cido polilctico, se desea un producto pticamente puro o

una mezcla racmica de composicin constante. Para la produccin de

cido lctico L(+), en algunas LAB como Lactobacillus amylophilus,Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus rhamnosus no se produce el

ismero D(-) cuando el pH es variado, ni cuando se cambian las

concentraciones de los nutrientes. Por otro lado, Lactobacillus delbrueckii

spp. bulgaricus, solo produce cido lctico D(-) en cultivos batch y

continuo a partir de glucosa y lactosa y cuando se modifican las

concentraciones de los nutrientes. La composicin de la mezcla racmica

formada por Lactobacillus plantarum cambia con la aireacin y laconcentracin de NaCl. Comparando los modos batch y continuo, la

concentracin del ismero predominante fue mayor en el primero, ya sea

L(+) D(-). La concentracin del ismero deseado tambin ha variado

aumentando el pH y la concentracin de sustrato, pero disminuye con la

temperatura y cuando el pH no es controlado (Hagerdal y Hofvendahl,

2000).


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32

1.4.1.7 Modo de Fermentacin: El cido lctico, por lo general, se

produce en modo batch, pero existen numerosos ejemplos de cultivo

continuo as como fed-batch y fermentaciones repetidas batch

semicontinuas. Cuando se compara los modos de fermentacin batch y

continuo, el primero resulta en mayores concentraciones de cido lctico y

mejores rendimientos en la mayora de estudios. Esto es debido a que

todo el sustrato es usado en el modo batch. Por otro lado, el modo

continuo resulta en mayores productividades, probablemente por que se

trabaja a altas tasas de dilucin, en donde la ventaja sobre el modo batch

es pronunciada. En general los modos fed-batch, semicontinuo y modobatch repetido han obtenido rendimientos mayores que el modo batch

(Ishiaki y Vonktaveesuk, 1996).

Inmovilizacin y recirculacin de clulas: Las clulas de LAB

pueden ser recirculadas o inmovilizadas en soportes slidos en diferentes

modos para aumentar la densidad celular; pero esto no ha sido muy

exitoso en trminos de aumento del rendimiento del cido lctico yproductividad. Por otro lado la recirculacin de clulas ha dado mayores

concentraciones de cido lctico y rendimientos iguales o mayores

(Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

Fermentaciones fed-batch: El proceso batch consiste en realizar

una alimentacin inicial con todos los nutrientes necesarios para el

microorganismo dentro del reactor, para que este se reproduzca en formaexponencial hasta el momento en que se agote el sustrato,

posteriormente la fermentacin llega a fase estacionaria. En contraste, la

metodologa fed-batch consiste en suministrar los nutrientes al

microorganismo durante el proceso fermentativo sin la eliminacin del

medio agotado, esta corriente de alimentacin puede ser suministrada de

forma continua, con flujos variables o constantes, o de forma discontinua

en forma de pulsos (Soto, 2004).


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1.4.2 Consideraciones del proceso.

Las mejores condiciones de fermentacin no siempre son las ms

favorables para todo el proceso desde el punto de vista econmico,

porque el costo del sustrato y de los procesos de separacin son

proporcionalmente altos. El sustrato, por lo general, es un asunto de

disponibilidad geogrfica. Los desechos de agricultura y silvicultura,

debido a su bajo precio, son preferibles a azcares puros y costosos. Para

sustratos lignocelulsicos una cepa que fermente pentosas y hexosas

como Lactobacillus pentosus es requerida para maximizar el rendimiento.

El almidn puede ser hidrolizado y fermentado por algunas cepas deLactobacillus productoras de amilasas, como Lactobacillus amylovorus,

o, despus de ser hidrolizado a glucosa, ser fermentado. Una cepa

homofermentativa maximiza la productividad de cido lctico producido.

Independientemente de la fuente de carbono, la fermentacin batch ha

sido superior a la fermentacin continua en todos los aspectos, excepto

en la productividad volumtrica. En modo continuo o en repetidos batch,se incrementa el rendimiento aun ms. Si el sustrato es costoso el

rendimiento debe ser maximizado (como en operacin batch o

semicontinua), mientras que la productividad volumtrica debe ser

maximizada mediante operacin continua si los costos de inversin son

altos. Una alta productividad puede ser alcanzada reciclando las clulas,

resultando en alta masa celular sin reducir el rendimiento (Hagerdal y

Hofvendahl, 2000).

1.5 LOS PROCESOS DE SEPARACIN.

La sntesis qumica de cido lctico siempre lleva a la mezcla racmica

pticamente inactiva, mientras que la selectividad puede ser alcanzada

mediante fermentacin usando el microorganismo apropiado. De cualquier


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manera, el proceso biolgico requiere el uso de un proceso de separacin

econmico y eficiente para recuperar cido lctico y aislarlo de varias

impurezas en el caldo de fermentacin.

Los carbohidratos son fermentados a cido L-lctico por varios

microorganismos, haciendo que el pH del caldo de fermentacin

disminuya afectando la productividad de los microorganismos. Se han

realizado investigaciones para desarrollar cepas que puedan producir

cido lctico a bajos pH, pero no son todava comercialmente viables. Se

tienen dos procesos convencionales para mantener el pH del fermentador

estable:

El caldo de fermentacin clarificado es concentrado al 32%, muy

por encima del punto de cristalizacin y acidificado con cido sulfrico

para obtener el cido lctico crudo (Joglekar et al., 2006).

El carbonato de calcio es adicionado al caldo para mantener una

concentracin de cido lctico baja para prevenir la inhibicin de labacteria. La solucin de lactato de calcio caliente es despus clarificada

mediante filtracin y lavada; subsecuentemente es cristalizada y

convertida a cido lctico agregando cido sulfrico, el cual se convierte

en grandes cantidades de sulfato de calcio como subproducto (Jackman

et al., 2004). Este sulfato de calcio es eliminado mediante filtracin. Una

mayor purificacin es alcanzada mediante tratamiento con carbn

activado, resinas de intercambio inico, extraccin con solventes oesterificacin, seguida por destilacin e hidrlisis (Ohkouchi y Inoue,

2006).


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1.5.1 Extraccin reactiva.

El cido lctico es poco extrable con solventes orgnicos comunes

debido a su naturaleza hidroflica, por lo que la extraccin reactiva ha sido

considerada para su recuperacin a partir de procesos convencionales.

La extraccin reactiva usa la reaccin entre el extractante y el material ha

ser extrado. El extractante en la fase orgnica reacciona con un material

en fase acuosa y el complejo que reacciona es solubilizado en la fase

orgnica. El cido lctico es recuperado de la capa orgnica mediante

una desorcin. El prerrequisito de una recuperacin econmica mediantedistribucin es un alto coeficiente de distribucin (Kd) (Joglekar et al.,

2006.).

1.5.2 Adsorcin.

La recuperacin de cidos carboxlicos de caldos de fermentacinpresenta un problema de separacin desafiante debido a la compleja

naturaleza de estos. Mtodos de recuperacin que utilizan agentes de

separacin, como adsorbentes slidos que son selectivos para cidos

carboxlicos, son atractivos. Caractersticas importantes de los

extractantes y de los adsorbentes slidos son una alta capacidad, una alta

selectividad para el cido sin serlo para el agua ni el sustrato,

regenerabilidad y, dependiendo del proceso, configuracin ybiocompatibilidad con los microorganismos (Joglekar et al., 2006).

1.5.3 Electrodilisis.

La fermentacin con electrodilisis es promisoria porque puede remover

cido lctico continuamente y mantener el pH del medio. La mayor parte


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de la literatura muestra la produccin de cido lctico a sales de lactato en

dos pasos: electrodilisis convencional y purificacin con electrodilisis

bipolar para la conversin de las sales de lactato en cido lctico con la

recuperacin del compuesto alcalino (Joglekar et al., 2006).

1.5.4 Esterificacin y destilacin reactiva.

La esterificacin es el nico proceso de separacin que separa el cido

lctico de otros cidos orgnicos. El cido lctico de alta pureza puede ser

preparado mediante la formacin de un ster al reaccionar el cido lcticocon alcohol. Posteriormente, la purificaron del ster se da por destilacin o

extraccin y luego se realiza su conversin en cido lctico.

La destilacin simultnea con esterificacin-hidrlisis es llamada

destilacin reactiva. El caldo fermentado con cido lctico necesita ser

pretratado para remover algunas impurezas antes de la destilacin

reactiva, para lo cual se usan camas de resinas que sirven comocatalizador y como relleno para la columna de destilacin (Joglekar et al.,

2006).

1.5.5 Proceso de separacin del cido lctico.

En la figura 6 se muestra el proceso de separacin de cido lcticocuando el pH de la fermentacin es controlado con carbonato de calcio.


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Figura 6. Proceso de separacin del cido lctico.

En la fermentacin se produce el cido lctico y ya que el pH de esta es

controlado con carbonato de calcio estos reaccionan para generar lactato

de calcio. Posteriormente, se realiza una filtracin con el fin de eliminar labiomasa y una evaporacin para separar el exceso de agua y as

disminuir el tamao de los equipos posteriores.

Despus de la evaporacin se realiza una esterificacin en donde el

lactato de calcio reacciona con cido sulfrico en presencia de metanol

para generar lactato de metilo y sulfato de calcio (el cual es un

subproducto).

El lactato de metilo generado junto con el agua que esta presente en el

proceso desde el comienzo van a una destilacin reactiva donde estos

dos compuestos reaccionan para regenerar y separar el metanol y el

cido lctico.

1.6 EL MERCADO DEL CIDO LCTICO

1.6.1 Precios y costos.

El cido lctico tiene un precio comercial que varia entre 1.38 US$/kg

(para 50% de pureza) y 1.54 US$/kg (para 88% de pureza) (Wee et al.,

2006). La produccin sinttica de este tiene un costo entre 1.30 y 1.40


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US$/kg. (Zacchi y Akerberg, 2000); pero para ser competitivo el costo del

monmero debe ser menor a 0.8 US$/kg, (Datta et al., 1995). En todo

caso, todava hay varios tpicos que deben ser estudiados para producir

cido lctico por medios biotecnolgicos en el rango de costos sealado,

como el desarrollo de microorganismos de alto desempeo en la

produccin de cido lctico, la disminucin de los costos de las materias

primas y los procesos fermentativos. Los procesos biotecnolgicos para la

produccin de cido lctico a partir de materias primas de bajo costo

deben ser mejorados para hacerlos competitivos con los procesos

qumicos (Wee et al.,2006).

1.6.2 Produccin y cuanti ficacin de la oferta existente.

Se estima que la demanda actual del cido lctico en el mundo est entre

130,000 a 150,000 toneladas mtricas por ao (Wee et al., 2006). Este

compuesto posee un uso potencial como insumo para aplicaciones de

gran volumen, con ventas proyectadas que exceden los US $ 3 billonesanuales slo en Estados Unidos (72 millones de libras), (Wisconsin

Biorefining Development Initiative, 2006).

Para resumir cabe decir que el mercado mundial para sustitucin de

solventes sera de US$ 4.5 billones/ao, el de polmeros biodegradables

US$ 0.9 billones/ao y el de qumicos oxigenados US$ 5.4 billones/ao

(Bolaos et al., 2000.).

1.6.3 Crecimiento esperado y factores que inciden.

Actualmente, a nivel mundial, algunos observadores estiman que la

produccin de cido lctico tiene un incremento de 12-15% anual

(Joglekar et al., 2006) y se tiene proyectado un aumento de la demanda


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de cido lctico de un 45.5% anual para el uso en polmeros

biodegradables (Jarvis, 2001).

Los productores de cido lctico estn esperando aumentar sus

ganancias con el potencial del producto como monmero del cido

polilctico. La industria espera que haya suficiente capacidad de cido

lctico para mantener la demanda de polmeros biodegradables y

solventes. El mercado por el cido polilctico crece, adems, con los

requerimientos de los consumidores de productos verdes; igual ocurre

con los solventes y agentes de limpieza biodegradables, en donde el

consumo de lactatos crece debido a su biodegradabilidad. El etil lactatoes el producto primario, y es usado como agente de limpieza en las

industrias de la microelectrnica, metalmecnica y de impresin (Jarvis,

2001).

1.6.4 Proyecc in de la demanda.

Actualmente, todo el cido lctico consumido en Colombia es de origen

extranjero, el cual se encuentra distribuido segn se muestra en la tabla 2.

Proyectando las tendencias mostradas hasta el 2010, se esperaran

volmenes de 297.3, 320.6, 343.9 y 367.2 Ton para los aos 2007, 2008,

2009 y 2010, respectivamente, considerando incrementos acordes con el

comportamiento de la tendencia en los ltimos aos.


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Tabla 2. Estadsticas de las Importaciones de Colombia por Pases para

el cido lctico (Comunidad Andina de Naciones, 2007).

Volumen en Toneladas2000 2001 2002 2003 2004

MUNDO 140 159 170 198 237

Alemania 1 0 0 0 4

Blgica 9 28 25 76 109

Brasil 114 115 107 104 135

China 13 5 27 1 20

Espaa 0 3 2 4 1

Estados

Unidos 0 0 4 0 5

Italia 0 0 0 0 4

Japn 0 0 0 0 1

Mxico 0 0 1 6 32

Pases

Bajos 3 7 5 7 74

Per 0 0 0 0 9

1.7 SIMULACIN DE PROCESOS BIOTECNOLOGICOS

En la actualidad, se han venido implementando la utilizacin deherramientas computacionales para realizar simulaciones de bioprocesos

con el fin de optimizarlos. Par esto se cuenta con herramientas tales como

Superpro designer, Excel, Matlab o ASPEN, en donde es posible la

manipulacin de distintos tipos de datos y utilizacin de ambientes

grficos que representan los comportamientos descritos por los modelos.

La simulacin puede ser usada como una importante herramienta para el

desarrollo de bioprocesos, jugando un importante rol para lograr undiseo ptimo de ellos, mientras acelera el desarrollo de los proceso para

la industria bioqumica.

Las ventajas de la simulacin para el desarrollo y escalamiento de

bioprocesos han sido conocidas por largo tiempo. Los simuladores de

procesos ofrecen la oportunidad de reducir el tiempo requerido para el

desarrollo de estos. Ellos permiten la comparacin de alternativas de


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proceso para que un gran nmero de ideas puedan ser sintetizadas y

analizadas interactivamente en poco tiempo (Zhou et al.,1997).

1.7.1 Modelo de simulacin.

Un modelo es aquel que describe las relaciones entre las principales

variables de estado y explica cuantitativamente el comportamiento de un

sistema. El modelo puede proveer sugerencias para el anlisis, diseo y

operacin de un fermentador. Los modelos de fermentacin normalmente

son divididos en dos clases: en modelos estructurados en donde las rutasmetablicas intracelulares son consideradas y modelos no estructurados,

en donde la biomasa es descrita por una variable. Los modelos

estructurados parecen ser complicados para el uso regular, mientras que

los modelos no estructurados son mucho ms fciles de usar y han

demostrado que tienen la capacidad de describir adecuadamente muchas

fermentaciones (Liu et al.,2003).

A continuacin se muestran algunos modelos que describen las cinticas

de crecimiento microbiano, produccin de cido lctico y consumo de

glucosa (Islam et al., 2003; Liu et al., 2003 ):

1.7.1.1 Crecimiento microbiano (X): Los modelos no estructurados

ms ampliamente usados para describir el crecimiento celular son elmodelo cintico de Monod, la ecuacin logstica y el modelo de Haldane.

La ecuacin logstica es un modelo independiente del sustrato que puede

describir la inhibicin de crecimiento de la biomasa que se presenta en

muchas fermentaciones batch. El modelo logstico se describe en la

ecuacin 1.


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Ecuacin 1. Modo diferencial del modelo de crecimiento logstico (Liu et

al., 2003).

= Xm

X

Xdt

dXm

1*

La forma integrada de la Ecuacin1 usando X=Xo (t=0) (ecuacin 2) da

una variacin de X como funcin de t, el cual puede representar tanto la

fase exponencial como la fase estacionaria.

Ecuacin 2. Forma integrada de la ecuacin de crecimiento logstico (Liu

et al., 2003).

tm

tm

eXoXoXm

eXmXoX

*

*

*

**

+=

Donde Xmrepresenta la concentracin de biomasa (g/L) mxima obtenida

durante la fermentacin, X0la concentracin inicial de biomasa (g/L), y

mla velocidad especfica mxima de crecimiento (h-1).

1.7.1.2 Formacin de producto (P): La cintica de la formacin de

cido lctico se bas en las ecuaciones de Luedeking-Piret. Este modelo

fue originalmente desarrollado para la formacin de cido lctico por

Lactobacillus delbrucckii (Gong y Lun, 1996). De acuerdo con este

modelo, la velocidad de formacin de producto depende de la

concentracin de biomasa y de la velocidad de crecimiento dX/dt, demanera linear (ecuacin 3).

Ecuacin 3. Modo diferencial de la ecuacin de Luedeking-Piret (Liu et

al., 2003).

Xdt

dX

dt

dP* +=


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Donde (g/g) y (g/g.h) representan la constantes de produccin de

cido lctico asociada y no asociada al crecimiento respectivamente.

1.7.1.3 Consumo de glucosa (S): Una fuente de consumo de

carbono como la glucosa es usada para formacin de biomasa, de

productos resultantes del metabolismo celular y para el mantenimiento de

las clulas. La Ecuacin 4 muestra como se relacionan:

Ecuacin 4. Ecuacin de consumo de glucosa (Islam et al., 2003).

( )1*00

++

+= t

xss

xs

m eY

mY

XSS

Donde S0 representa la concentracin inicial de sustrato (g/L), Yxs el

rendimiento real de sustrato en biomasa (g/g), ms el coeficiente de

mantenimiento (g/g.h) y es la velocidad especifica de crecimiento (h-1).


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2 MATERIALES Y MTODOS.

2.1 LOCALIZACIN.

Los anlisis y pruebas correspondientes a este trabajo, se realizaron en los

laboratorios de Biotecnologa y Anlisis Instrumental de la Universidad EAFIT, en la

ciudad de Medelln.

2.2 MEDIO DE CULTIVO.

El medio de cultivo usado fue el MRS, el cual es un medio creado por DeMan,

Rogosa y Sharpe (1960) para el enriquecimiento, cultivo y aislamiento de las

diferentes especies de Lactobacillus. Las concentraciones de los nutrientes en elmedio (Tabla 3) fueron las reportadas por Guoqiang et al. (1991), cambiando la

concentracin de glucosa. Las soluciones de sales y la glucosa fueron autoclavadas

por separado a 15 psi y 120C durante 20 minutos.

2.3 MICROORGANISMO UTILIZADO.

Se utiliz el microorganismo, Lactobacillus casei ATCC 7469 (Figura 7) obtenido

en laAmerican Type Culture Collection (ATCC).


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Tabla 3. Composicin del medio de cultivo MRS (Guokiang et al., 1991).

Compuesto Composicin (g/L)Glucosa 100

Extracto de levadura 10K2HPO4 0.5KH2PO4 0.5

Citrato de sodio 1.0MgSO4.7H2O 0.005MnSO4.H2O 0.0031FeSO4.7H2O 0.002

Acido ascrbico 0.005Agar Agar 13.0

Figura 7. Lactobacillus caseiATCC 7469

Inicialmente el microorganismo se encontraba liofilizado por lo que fue activado de la

siguiente forma:

- Una asada del lifilo (Figura 8) se agreg a 20 mL de medio MRS lquido

(Tabla 3) y se ubic en un shaker a 37C y 90 rpm, durante dos das.

- El caldo de cultivo resultante fue el inculo para sembrar una caja petri, la


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cual a su vez sirvi para almacenar la cepa en el sistema de perlas Criobank (

- Figura 9), para lo cual:o De una caja petri de cultivo fresco se retir toda la biomasa con un asa

estril y se disolvi en el medio que el sistema de perlas contiene.

o Se agit hasta incorporar completamente la muestra al medio

invirtiendo el vial. Esto permiti que las bacterias se adhirieran a las

perlas.

o Con una pipeta estril, se removi el medio de cultivo de Cryobank y

se almacenaron las perlas a 4C.

- Para generar las cepas de trabajo se tom una perla del vial con un asa

de siembra y se extendi sobre la superficie de una caja petri con agar MRS.

- Las cajas petri se incubaron a 37C durante dos das y posteriormente se

almacenaron a 4C.

Figura 8. Lifilo.


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Figura 9. Sistema de perlas Cryobank.

2.4 MTODOS ANALTICOS

Las muestras para realizar las curvas de crecimiento, generacin de producto y

consumo de sustrato fueron tomadas por duplicado a tiempos dados desde el tiempo

cero que corresponde a la inoculacin, hasta que termina cada fermentacin. Luego,las muestras fueron analizadas para determinar la concentracin celular por peso

seco, el consumo de sustrato por DNS (Miller, 1959) y la concentracin de cido

lctico por cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC.

Las fermentaciones, los anlisis y la toma de muestras fueron llevadas a cabo por

duplicado y los valores aqu presentados son el promedio de las mediciones con su

respectivo error estndar.

2.4.1 MEDICIN DE BIOMASA

La medicin de biomasa de L. caseise realiz por el mtodo de peso seco. Para ello

se tom de manera estril 1 mL de muestra, luego se centrifug a 14000 rpm a 4C,


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durante 60 minutos para eliminar el sobrenadante. Al pellet resultante se le agreg 1

mL de cido clorhdrico 1 M para que el carbonato de calcio presente reaccionara yse centrifug a las mismas condiciones anteriores. Finalmente, el eppendorf fue

secado a 50C durante 24 h para luego ser pesado. El clculo de la concentracin de

biomasa en g/L se comput de acuerdo a la ecuacin 5:

Ecuacin 5. Concentracin (g/L) de biomasa

( )%100*

001,0

____

L

EppendorfInicialPesoEppendorfFinalPesoBiomasa

=

2.4.2 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA

La cintica de consumo de sustrato se determin por el mtodo de cido

Dinitrosaliclico (DNS) (Miller, 1959), que permite cuantificar la presencia de azcares

reductores (Anexo 1). Para llevar a cabo la cuantificacin se realiz una dilucin delsobrenadante obtenido despus de la centrifugacin de 1:165.7.

2.4.3 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE CIDO LCTICO

La concentracin de cido lctico y del lactato de calcio presente en el cultivo debido

a la reaccin del cido con el carbonato de calcio, fue determinada por medio decromatografa lquida (HPLC). El equipo usado fue un HPLC Agilent Technologies

serie LC 1200 Series Quaternary a temperatura ambiente, en una columna C18, con

cido sulfrico 0.01 M como fase mvil y con un flujo de 0.7 mL/min, se us un

detector de absorcin ultravioleta a 210 nm, con un volumen de inyeccin de 10 l.

Como preparacin de las muestras se siguieron los protocolos encontrados en


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Snchez y Ramrez (2004) y Wang et al. (2007).

A cada muestra primero se le elimin la biomasa por medio de la centrifugacin de 2

mL, a 14000 rpm, por 60 minutos, a 4C; despus, para desproteinizar la muestra se

tomaron 1.5 mL de esta y se le agreg 0.1 mL de H 3PO40.1 N, luego se centrifug

durante 60 minutos, a 12000 rpm, a 4C y se tom el sobrenadante.

Posteriormente, se calent el sobrenadante durante 10 minutos a 30C en bao

Mara para despolimerizar al cido y se filtr por acetato de celulosa con un dimetro

de puro de 0.3 m. En este punto las muestras estaban listas para ser llevadas al

cromatgrafo y realizar las mediciones.

Para cada muestra, se ley en el cromatograma el rea del pico correspondiente

tanto al cido como al lactato presente, los cuales aparecen a 6 y 3.1 minutos

respectivamente y se obtiene la concentracin a partir de las curvas de calibracin

(Anexo 2 y 3), teniendo en cuenta los factores de dilucin usados.

2.5 FERMENTACIONES

2.5.1 Evaluacin de la concentracin de carbonato de calcio .

Las fermentaciones fueron realizadas en el agitador lineal con control de temperatura

(Figura 10) a 37C y a una velocidad de 90 rpm. Estas fueron llevadas a cabo porduplicado en erlenmeyers de 500 mL con 300 mL de medio MRS. Los erlenmeyers

fueron cubiertos con algodn, aluminio y vinipel, para crear condiciones parcialmente

anaerobias.


50/117

50

Figura 10.Agitador lineal con control de temperatura.

La inoculacin fue realizada con 3 asadas del microorganismo, provenientes de cajaspetri preparadas a partir del sistema de perlas Criobank.

Para la toma de muestras, los erlenmeyers fueron llevados a la cmara de flujo

laminar y all se les retir la cubierta y se tom de manera estril 1 mL de muestra

por duplicado. Los erlenmeyers fueron nuevamente tapados y llevados al agitador.

Las concentraciones de carbonato de calcio evaluadas fueron 15, 37.5 y 60 g/L.

2.5.2 Sistema batch en bior reactor.

Primero se realiz un preinculo a partir de tres asadas de las cajas petri en

erlenmeyers de 50 mL con 20 mL de medio de cultivo MRS. Despus de 2 das de

cultivo a 37C y 90 rpm en el agitador lineal con control de temperatura, el contenido

fue pasado, en condiciones estriles, a erlenmeyers de 500 mL con 180 mL de medio


51/117

51

de cultivo MRS. El proceso se llev a cabo a 37C, 90 rpm, por 48 horas para ser

usado despus como inculo con una OD de 1.9 0,5 en el biorreactor.

El equipo utilizado fue un biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 (Figura 11) con un

volumen total de 3 L, cuatro bafles y 2 agitadores de seis hojas planas tipo Rushton.

Figura 11. Biorreactor BIOENGINEERING CH 8636

2.5.3 Sistema Fed-batch.

En las fermentaciones batch se realiz el mismo procedimiento descrito para las

fermentaciones batch, en el cual fue preparado el preinculo y el inculo,

adicionalmente, se prepararon las soluciones para la alimentacin del biorreactor.


52/117

52

La estrategia de alimentacin fed-batch se dividi en tres etapas: primero se oper el

biorreactor en modo batch con 2 L de medio de cultivo hasta finalizar la faseexponencial, posteriormente, comenz la alimentacin fed-batch hasta que fue

agregado 1 litro de solucin de glucosa y por ltimo se oper nuevamente el

biorreactor en modo batch durante las ltimas 24 horas del proceso

Los procesos fed-batch realizados fueron los siguientes:

Fed-batch 1: flujo 74 mL/h, concentracin de glucosa de 850 g/L.

Fed-batch 2, flujo 43mL/h, una concentracin de glucosa de 100 g/L.

Fed-batch 3 flujo 14 mL/h y concentracin de glucosa de 100 g/L.

Todos los procesos fed-batch operaron con una agitacin de 90 rpm, una

temperatura de 37 C y una concentracin inicial de CaCO3de 15 g/L.

2.5.3.1 Clcu lo de los parmetros productivos en las fermentaciones.

Rendimiento observado de sustrato en producto (Yps).

El clculo del rendimiento de sustrato en producto se define como los gramos de

cido lctico producidos sobre los gramos de glucosa consumida, por esto el clculo

de este parmetro est definido por la ecuacin 6:

Ecuacin 6. Rendimiento observado de sustrato en produc to (g/g).

ConsumidaaGludeGramos

oducidosLcticocidodeGramospsY

_cos__

Pr____ =

El rendimiento terico de sustrato en producto est definido como los gramos de

cido lctico producidos sobre los gramos de glucosa consumida para la produccin


53/117

53

de este cido, por lo tanto, ya que esta es solo una fraccin de la glucosa total

consumida, el rendimiento terico es mayor que el rendimiento observado.

Productividad Volumtrica (Q).

La productividad volumtrica est definida como los gramos de cido lctico

producidos por unidad de volumen, en un tiempo dado (ecuacin 7)

Ecuacin 7. Productividad volumtrica (gr/L.h).

VolumennFermentacideTiempo

oducidosLcticocidodeGramosQ

=

__

Pr____

Rendimiento observado de sustrato en biomasa (Yxs)

El rendimiento observado de sustrato en biomasa esta definido como los gramos de

biomasa obtenida sobre los gramos de glucosa consumida y se calcula con la

ecuacin 8:

Ecuacin 8. Rendim iento observado de sustrato en biomasa (g/g).

ConsumidaaGludeGramos

ObtenidaBiomasadeGramosY xs

_cos__

___ =

2.6 SIMULACIN.

Para la implementacin del modelo de simulacin, fueron escogidas las ecuaciones

que describen el proceso de fermentacin, propuestas por Liu, et al. (2003) para la

produccin de biomasa y de cido lctico e Islam et al. (2003) para el consumo de

sustrato. En ellas se presentan los modelos que representan a estos parmetros en

el tiempo; siendo estas las Ecuacin 2, 3 y 4. Ellas fueron usadas para simular los


54/117

54

resultados experimentales, mediante el uso de EXCEL, los valores de los parmetros

cinticos fueron encontrados con el software Polymath 6.0.

2.7 ANL ISIS ESTADSTICO

Se realizaron diferentes anlisis estadsticos segn la etapa del proceso en el

software Statgraphics 5.0. El primero fue llevado a cabo para las fermentaciones

realizadas en el agitador lineal, en donde se evaluaron diferentes concentraciones de

carbonato de calcio.

A estas fermentaciones se les realiz un anlisis de varianza ANOVA con un nivel de

confianza del 95%. Para ello se evaluaron las diferencias que existan entre las

diferentes concentraciones de carbonato y los diferentes parmetros productivos

(concentracin de cido lctico, Yps, Q).

Posteriormente se realiz un anlisis estadstico para comparar las diferenciasexistentes entre todas las fermentaciones realizadas en el biorreactor. Tambin

consisti en un anlisis de varianza ANOVA con un nivel de confianza del 95%.

Adems, se llev a cabo un anlisis de rangos mltiples para determinar que grupos

eran homogneos y as identificar cuales medias eran significativamente diferentes

de las otras.


55/117

55

3 RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1 VARIACIN DE LA CONCENTRACIN DE CARBONATO DE CALCIO

El carbonato de calcio es un agente regulador de pH, el cual reacciona con el cido

lctico formando lactato de calcio. Por ello, es importante determinar la concentracinde este compuesto que permita altas productividades y buenos rendimientos. En este

estudio, se evaluaron diferentes concentraciones de este compuesto en un sistema

de fermentacin batch (15, 37.5 y 60 g/L)

Se observ un comportamiento muy similar en todas las concentraciones evaluadas,

en la Figura 12 se puede observar su comportamiento.

En la figura 12a se observa que durante el crecimiento de L. casei se hallaron

diferentes fases de crecimiento. La fase lag correspondi a un perodo de 8 horas,

donde el microorganismo se adapt a las condiciones fsico qumicas del proceso.

Posteriormente, ocurri la fase exponencial con una duracin de 54,5 h, en donde

aument considerablemente la concentracin del microorganismo, para luego entrar

en la etapa de fase estacionaria y muerte celular evidenciada por la disminucin en la

concentracin de biomasa de 2.68 a 2.49 g/L.

La disminucin en la concentracin de glucosa est relacionada con el aumento en la

concentracin de biomasa y la mayor velocidad en el consumo de este se da durante

la fase exponencial de crecimiento, llegando a un valor final de 47.7 gr/L de glucosa.


56/117

56

Figura 12.Cintica de las fermentaciones variando la concentracin de carbonato de

calcio. a)15 g/L, b)37.5, c)60 g/L.Biomasa ( ) , Glucosa ( ) , cido lctico ( ).

a)

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Tiempo (h)

Concentracion

(g/L)(X)

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

Concentracion

(g/L)(S,P

)

b)

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Tiempo (h)

Co

ncentracion(g/L)(X)

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

Con

centracion

(g/L)(S,P

)


57/117

57

c)

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Tiempo (h)

Concentracin

(g/L)(X)

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

Concentracin

(g/L)(S,P

)

Finalmente, se puede ver cmo la produccin de cido lctico comenz al igual que

el crecimiento celular a las 8 horas y al finalizar el crecimiento exponencial se

alcanz el 95% (94.7 g/L) del cido total que se produjo en la fermentacin completa.

Al final de la fermentacin, se encontraron 99.3 g/L de cido lctico, habindose

generado aun una pequea fraccin de este (5%) durante la fase estacionaria. Por

ello, bajo las condiciones evaluadas, este metabolito est relacionado parcialmente

con el crecimiento celular, ya que se produjo principalmente en la fase exponencial,

pero tambin, aunque en menor proporcin, en la fase estacionaria tal como fue

reportado por Islam et a., (2003).

Para cada fermentacin se evaluaron los siguientes parmetros a las 80 horas:

concentracin final de cido lctico (AL), rendimiento observado de sustrato en

producto (Yps), productividad volumtrica de cido lctico (Q) y rendimiento

observado de sustrato en biomasa (Yxs) (Tabla 4). Los datos reportados son el


58/117

58

promedio de sus duplicados.

Las figuras 12b y 12c tienen el mismo comportamiento que la figura 12a, pero al

aumentar la concentracin de carbonato de calcio aument la fase lag de estas, esto

pudo ser debido a que el inculo de estas fue obtenido directamente de cajas petri y

en estas el medio de cultivo no contena carbonato de calcio. Por esto, para estas

fermentaciones el carbonato consisti en un agente nuevo en el medio y al aumentar

la concentracin de este tambin aument el tiempo de adaptacin de la bacteria al

medio de cultivo.

Tabla 4. Parmetros productivos bajo diferentes concentraciones de carbonato de

calcio.

Carbonato de calcioParmetro 15 g/L 37.5 g/L 60 g/L

AL (g/L) 99.1 94.9 92.4Yps(g/g) 2.38 1.70 1.72Q (g/L.h) 1.24 1.19 1.23

Yxs (g/g) 0.056 0.061 0.053

A estas fermentaciones se les realiz un anlisis de varianza ANOVA con un nivel de

confianza del 95%. Para ello se evaluaron las diferencias que existan entre las

concentraciones de carbonato y los parmetros productivos (concentracin de cido

lctico, Yps, Q). No se hallaron diferencias significativas entre estas variables

dependientes y la concentracin de CaCO3(P>0,05) (Anexo 5) concluyendo as que

la produccin de este cido no se ve afectada por la concentracin de esta sal bajolas condiciones evaluadas en este proyecto.

El carbonato de calcio es un agente inerte para la bacteria ya que esta no lo puede

consumir y a las concentraciones trabajadas tampoco es nocivo para ella. La nica

funcin de este compuesto en el medio de cultivo es reaccionar con el cido lctico


59/117

59

producido, posiblemente por esto es que su concentracin en el medio no afect de

manera significativa a los parmetros productivos.

Los resultados obtenidos son mejores a los de Vzquez et al. (2003) en donde con

una concentracin de 100 g/L de carbonato de calcio se obtuvo 58,9 g/L de cido

lctico con L.coryniformis en erlenmeyers de 250 mL y 100 mL de medio de cultivo.

Las concentraciones obtenidas tambin son ms altas que aquellas logradas por

Elibol et al. (2004) quienes estudian diferentes fuentes de carbono para la produccin

de cido lctico con Rhyzopus oryzae, logrando una concentracin mxima de 60 g/L

del cido en erlenmeyers de 250 mL con 50 mL de medio de cultivo y 50 g/L de

carbonato de calcio.

En Patel et al. (2007)trabajando con Lactobacillus sp. KCP01 se obtuvo un aumento

de 23,48 g/L a 45,59 g/L en la concentracin final de cido lctico al pasar de realizar

las fermentaciones sin control de pH, a llevarlas a cabo con 20 g/L de carbonato de

calcio. Esto evidencia que un control adecuado del pH puede aumentarsignificativamente la produccin de cido lctico.

Por esto, y para disminuir el gasto de reactivos, se decidi trabajar con la menor

concentracin de carbonato de calcio, correspondiente a 15 g/L de la misma manera

como lo realizaron Tan y Ding (2006).

3.2 PROCESO FERMENTATIVO EN MODO BATCH EN BIORREACTOR.

El proceso de fermentacin a nivel de agitador lineal se llev a un biorreactor de 3 L,

con el fin de evaluar la produccin de cido lctico a una escala mayor y

posteriormente, comparar el proceso batch con uno fed-batch. La cintica de

crecimiento de biomasa, consumo de sustrato y formacin de producto se describe


60/117

60

en la Figura 13.

Figura 13. Cintica de Fermentacin en biorreactor en modo batch.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (h)

Concentracin(g/L)(X)

0

20

40

60

80

100

120

140

Concentracin(g/L)(S,P

)

Biomasa (X)

Glucosa (S)

cico Lctico (P)

Tabla 5. Parmetros productivos de cido lctico en un biorreactor en modo batch.

La fase de adaptacin de crecimiento encontrada a nivel de los agitadores orbtales,

desapareci en el biorreactor, probablemente debido a mejores condiciones de

fermentacin. Ellas pueden ser una mejor agitacin, un mejor control sobre la

AL (g/L) 122.6Yps(g/g) 2.71

Q (g/L.h) 2.4Yxs (g/g) 0.058


61/117

61

temperatura del proceso y la posibilidad de garantizar anaerobiosis desde el

comienzo de la fermentacin, lo cual no se poda garantizar en el montaje realizadoen el agitador. El efecto inmediato se evidencia por el aumento inmediato de la

concentracin de biomasa observado en la Figura 13. La fase exponencial se

extiende entonces desde el tiempo cero hasta las 27 horas, terminando esta fase

37.5 horas antes que en la fermentacin en frascos agitados (70 horas), debido a las

condiciones de fermentacin explicadas anteriormente.

La corta fase estacionaria y la acelerada muerte celular se deben a la acelerada tasa

de consumo de glucosa, alcanzando lmites inhibitorios muy rpidamente, ya que la

bacteria deja de consumir sustrato casi completamente desde las 27 horas.

La concentracin de glucosa disminuy desde 98.2 g/L hasta 52.7 g/L, valor

alcanzado a las 27 horas, momento en se que alcanz el final del crecimiento

exponencial de las clulas.

Finalmente, la concentracin de cido lctico que comenz en 30 g/L (producidos enlos inculos) aument hasta un valor de 118.9 g/L, producindose la mayor cantidad

de este metabolito (90.6%) durante las primeras 27 horas de la fermentacin en la

fase exponencial, de manera similar a lo que ocurri en el agitador lineal. La

proporcin de cido lctico producido durante la fase estacionaria y de muerte celular

se increment respecto al montaje anterior, aumentando de 5 a 9,4%. Este resultado

muestra una vez ms cmo el cido lctico, en las condiciones de proceso

evaluadas, se comport como un metabolito parcialmente relacionado con elcrecimiento celular. Esto se concluye ya que la fase de crecimiento exponencial

termin a las 27 horas, y es durante este tiempo que se dio la mayor produccin de

cido lctico; por lo cual en las prximas fermentaciones en modo fed-batch, la

alimentacin de sustrato comenz en este tiempo.

El rendimiento observado de sustrato en biomasa fue muy bajo (0.058 g/g)


62/117

62

comparado con el de sustrato en producto (2.71 g/g). Esto muestra cmo las

condiciones que se estn trabajando son las apropiadas para favorecer la produccinde cido lctico sobre el crecimiento de biomasa. Esto se debe a que los

rendimientos de sustrato en biomasa siempre son mucho menores en

fermentaciones anaerobias, ya que se favorece la produccin de otros metabolitos

sobre la biomasa (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).

La concentracin final de cido lctico, el rendimiento observado de sustrato en

producto y la productividad volumtrica obtenidos en modo batch en el biorreactor,

fueron un 28.4%, 42.63% y 96.8% respectivamente, superiores a aquellas logradas

en el agitador, indicando que en el primero, se dan mejores condiciones tales como

la anaerobiosis y un mejor control en la agitacin y temperatura que favorecen la

produccin de cido lctico.

En los trabajos consultados en la siguiente comparacin de resultados los estudios

fueron realizados con Lactobacillus caseiATCC 7469:

La produccin de cido lctico obtenida en el modo batch (118.9 g/L) es mayor a la

obtenida por Schugerl et al. (1993), los cuales lograron una concentracin de cido

lctico de 26.8 g/L trabajando en un reactor de 3 L y una concentracin inicial de

glucosa de 30 g/L.

En el trabajo realizado por Guoqiang et al.(1991), lograron concentraciones de cido

lctico de 68 g/L en erlenmeyers de 100 mL y una concentracin inicial de glucosa de140 g/L.

En este estudio se present una mayor produccin de cido lctico a la encontrada

por Petrov et al. (2007), los cuales obtuvieron una concentracin de 10g/L de cido

lctico con clulas inmovilizadas y 30 g/L de lactosa.


63/117

63

La concentracin de cido lctico obtenida en este estudio es comparable con la

producida por Vaccari et al. (1993) los cuales con una concentracin inicial deglucosa de 119.6 g/L obtuvieron una produccin de cido lctico de 99.9 g/L en un

reactor de 3 L.

El rendimiento de 2.71 g/g es ms alto que los reportados en la literatura, como en

los estudios de Schugerl et al. (1993) los cuales encontraron un rendimiento de 0.93

g/g y en Guoqiang et al.(1991) que fue de 1.1 g/g.

Por otra parte la productividad volumtrica lograda (2,4 g/L.h) tiene un valor cercano

al reportado por Guoqiang et al.(1991) el cual fue de 2.6 g/L.h.

3.3 FERMENTACIONES FED-BATCH

3.3.1 Fed-batch 1

Un proceso fed-batch es usado para complementar los contenidos del reactor y

proveer control sobre la concentracin de sustrato. Idealmente, al comenzar con una

solucin diluida de sustrato y aadiendo nutrientes, se evaden altas velocidades de

crecimiento. Esto es de gran importancia para cultivos que demandan grandes

cantidades de oxgeno por sus altas tasas de crecimiento, al igual que para

fermentaciones que puedan sufrir inhibicin por sustrato y cambiar sus rutas

metablicas a algunas deseadas. Por lo anterior, si el reactor se opera en modobatch hasta obtener una alta concentracin celular y una baja concentracin de

sustrato, y posteriormente se comienza la adicin de sustrato, se espera que la

concentracin de ambas permanezcan aproximadamente constantes durante la

operacin fed batch.

Despus de tener los datos de las fermentaciones batch, se procedi a evaluar


64/117

64

diferentes estrategias fed-batch con el fin de mejorar el proceso para obtener

mayores productividades. La primera estrategia de evaluacin se realiz con un flujode 74 mL/h y una concentracin de glucosa de 850 g/L de acuerdo con lo reportado

por Tan y Ding (2006).

Figura 14. Cintica de la fermentacin fed-batch 1.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0

Tiempo (h)


0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

Concentracin(g/L)(S,P

)

Biomasa (X)

Glucosa (S)

cido Lctico (P)

En la figura 14 se puede observar que la concentracin de biomasa aument durantetodo el tiempo, lo cual indica que el lactobacilo se adapt al cambio en las

condiciones de fermentacin provocado por la adicin de sustrato. Una vez comenz

la adicin de glucosa su concentracin aument desde 49.3 g/L hasta 283.9 g/L y la

fermentacin solo tuvo la capacidad de disminuirla despus de 13.5 horas de haber

finalizado el proceso de adicin de sustrato. Por ende, la cantidad de glucosa

Batch

Fed-batch

Batch


65/117

65

adicionada fue elevada, aunque no tanto para inhibir el crecimiento del

microorganismo.

Al comenzar el proceso fed-batch hubo un pequeo aumento en la concentracin de

cido lctico, sin embargo este se diluy y baj desde 107.8 g/L hasta 52.5 g/L.

Este comportamiento indica que el flujo trabajado fue mayor al requerido para poder

ver un efecto positivo en este modo de fermentacin.

Tabla 6. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 1.

Nota: estos resultados se refieren a toda la fermentacin

En Tan y Ding (2006) la cepa Lactobacillus casei LA-04-1 fue usada para realizar

procesos fed-batch. All todas las fermentaciones fed-batch fueron iniciadas como

cultivos batch con una concentracin inicial de glucosa de 90 g/L. Posteriormente

una solucin de glucosa de 850 g/L comenz a alimentar al fermentador a un flujo de

30 mL/h cuando la concentracin de glucosa en el biorreactor se encontraba entre 0-

5 g/L. En este estudio se alcanz una concentracin final de 152.5 g/L de cido

lctico y una productividad volumtrica de 1.82 g/L.h.

3.3.2 Fed-batch 2

Debido a los resultados obtenidos en el sistema anterior, se disminuy la

concentracin de glucosa en la solucin a 100 g/L y el flujo a 43 mL/h, obteniendo los

resultados reportados en la figura 15.

AL (g/L ) 82.7

Yps(g/g) 0.78

Q (g/L.h) 1.29

Yxs(g/g) 0.059


66/117

66

Figura 15. Cintica de la fermentacin fed-batch 2.

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tiempo (h)


0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

Con

centracin(g/L)(S,P

)

Biomasa (X)

Glucosa (S)

cido Lct ico (P)

Tabla 7. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 2.

AL (g/L ) 92.9Yps(g/g) 2.05Q (g/L.h) 1.27Yxs(g/g) 0.070

En la figura 15 se puede observar que a las 27 horas, justo en el momento que

comenz a ingresar la solucin de glucosa en el reactor, tanto la concentracin de

cido como de biomasa empezaron a diluirse, indicando que el flujo era todava

bastante alto para que el sistema pudiera asimilarlo de forma adecuada.

En una fermentacin en modo fed-batch se espera que la concentracin de glucosa

suba un poco en el momento que la adicin de sustrato comienza, pero debido a la

Batch Batch

Fed-batch


67/117

67

alta cantidad de biomasa presente en el fermentador, la concentracin de glucosa

baja rpidamente.

En la fermentacin mostrada en la Figura 15 comenz a verse un poco este

comportamiento, ya que aunque la concentracin de glucosa aument en el

momento que comienza el proceso fed-batch, esta baja un poco antes de que se

acabe el proceso. Esto indica que a diferencia de la fermentacin anterior, en esta

configuracin del sistema, el microorganismo asimil la glucosa que ent

Simulacon de La Produccion de Acido Lactico

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