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BIOTECNOLOGIA

Es la aplicación de organismos vivos en

procesos analógicos para beneficios de

hombre.

La biotecnología es uno de los campos

multidisciplinarios que mayor expansión se ha

experimentado, considerándose prioritario

para el desarrollo tecnológico del país, dadas

las posibilidades que ofrece para producir

bienes y servicios a través de procesos

biológicos intensivos y controlados en lugar de

los tradicionales procesos biológicos y/o

químicos extensivos.

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Biotecnología:

Campo del conocimiento dirigido a la

producción de bienes y servicios mediante

sistemas biológicos y sus productos.

Aprovecha enzimas, microorganismos,

tejidos celulares, estructuras subcelulares,

etc.

Cultivo de tejidos

BIOTECNOLOGIA

Ingeniería genética

Es interdisciplinaria

Ciencia y tecnología de

alimentos

Ingeniería mecánica

Microbiología

Biología celular

Química Ingeniería

bioquímica

Informática

Genética

Electrónica

Bioquímica

BIOTECNOLOGIA

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CONOCIMIENTOS:

BIOQUÍMICA

FISIOLOGÍA

GENETICA

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CULTIVO DE TEJIDOS

Es una herramienta de gran utilidades la

biotecnología.

Esta técnica se basa en la totipotencialidad

celular; obteniendo de esta forma una

propagación rápida y masiva de plantas

idénticas a la original a partir de cualquier

parte aislada de la planta.

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Consiste en extraer bajo condiciones asépticas, órganos,

tejidos o células de cualquier parte de la planta y colocarlas en

medios nutritivos para luego cultivarlos en condiciones

ambientales controlados.

TRES FENOMENOS BASICOS

1) ORGANOGENESIS: Formación de órganos (diferenciación).

2) CAULOGENESIS: Formación de callo (no diferenciado,

solamente se acumulan no forman órgano ni nada).

3) EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a

partir de células no germinadas.

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TOTIPOTENCIA

Capacidad de cualquier célula somática para

dividirse y crear un individuo completo y

semejante de aquel que se toma la muestra,

bajo ciertas condiciones químicas y físicas

dados en el cultivo in vitro.

Tipos de cultivos

1. El Desarrollo de estructuras pre-existentes

2. Nueva formación a base de totipotencialidad

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Brote axilar o yema

Desarrollo de ovario

Injerto in vitro

Tuberización

Germinación de semillas

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Floración in vitro Rhizogenesis

Promotor de brotes

Desarrollo de bulbo

Embriogenesis

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APLICACIONES

- INDUSTRIA DE FERMENTACIÓN

- INDUSTRIAS AGROALIMENTARIAS

- INDUSTRIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

- PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS CON CONCENTRADOS DE

PROTEÍNA

- TRATAMIENTO Y VALORIZACIÓN DE SUBPRODUCTOS

AGRICOLAS Y SUS DERIVADOS.

- PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES Y PRODUCCIÓN DE

BIOGAS

- TRATAMIENTO DE MINERALES

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MECANISMO DE GERMINACIÓN EN SEMILLAS

PROCESO DE GERMINACIÓN: TRES ETAPAS

CONDICIONES: HUMEDAD, LUZ, OXIGENO, TEMPERATURA

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CULTIVO IN VITRO

Es una técnica que usa para propagar plantas a partir de

plantas madres por lo que las plántulas obtenidas son

idénticas entre si a la planta madre.

El cultivo de vegetales superiores se inicio hace mas de

medio siglo y es en esta época que alcanza importancia en la

agricultura, en la obtención de nuevas variedades y por la

multiplicación vegetativa a escalas industriales.

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Ventajas

1.- Es masiva y más rápida .

2.- Propagar especies difíciles de multiplicar en forma

tradicional; esto es posible al fenómeno de rejuvenecimiento.

3.- El crecimiento de las plantas in vitro es más vigoroso que el

de las clonadas in vivo; esto se debe sobre todo al

rejuvenecimiento y / o al hecho de que las plantas in vitro se

encuentran libres de enfermedades.

4.- Se consigue una multiplicación libre de enfermedades con

selección rigurosa del material inicial, o bien liberando el

material inicial de enfermedades.

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5.- Homogeneidad del material.

6.- Multiplicación todo el año. Porque se trabaja en

condiciones ambientales controladas.

7.- Ya que se necesita una cantidad de material

relativamente pequeña para iniciar un cultivo in vitro,

se puede realizar una cuidadosa selección del

mismo.

8.- Ahorro de espacio con respecto de los sistemas

tradicionales.

9.- Conservación del material genético.

10.- Fácil transporte e intercambio de material

vegetal.

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Desventajas

1.- En algunos sistemas de propagación in vitro la

estabilidad genética es débil.

2.- Las plantas producidas in vitro pueden mostrar

características poco convenientes in vivo: Excesiva

producción de ramas laterales y paso total a la fase juvenil.

3.- La aclimatación de las plántulas es un proceso difícil y

puede que muchas veces, los mayores porcentajes de la

pérdida se presenten en esa etapa.

4.- Difícil respuesta inicial de algunas especies y genotipos.

5.- Variación de respuesta entre los genotipos.

6.- Alto costo de establecimiento de un laboratorio, lo que

incide indirectamente en el precio final de la planta

producido de esta manera.

7.- Necesidad de una mano de obra especializada.

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ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO in vitro

ESQUEMA DE LA REALIZACIÓN DE CULTIVO “IN VITRO”

Material a sembrar

Aislamiento o explante

Esterilización del hipoclorito o Cl2Hg

Preparación del medio nutritivo

Esterilización en autoclave

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EQUIPO NECESARIO PARA EL CULTIVO IN VITRO

- Autoclave

- Cámara de flujo laminar

- Medio de cultivo

- Planta

- Cámara de cultivo

Presión de 1.5 atm y una temperatura hasta 120º.

- Cámara de flujo laminar

Es una mesa con una campana de extracción, para uno o dos

operarios en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para

esterilizar el aire.

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TECNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MANIPULACIONES

ASEPTICAS

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE

ESTERILIZACIÓN POR MEDIOS QUÍMICOS

ESTERILIZACIÓN POR MEDIO NUTRITIVO

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

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Ejemplos:

Avena sativa - 7 Hrs

Zea mays - 8 Hrs

Triticum aestivum - 15 Hrs

Phaseolus vulgaris - 5 Hrs

CLORURO DE MERCURIO

CLORAMINAT Y IODOSUCCIANAMIDA

ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

HIPOCLORITO DE CALCIO

TIEMPO DE ESTERILIZACIÓN DE SEMILLAS EN

HIPOCLORITO DE CALCIO 3%

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-Medio de cultivo

Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de

ensayo, que se tapa con un tapón.

Dependiendo del material que se va a

propagar, el tubo se pone vertical o un poco

inclinado.

-Planta

El material vegetal de partida puede ser del

campo, pero esto conlleva un alto riesgo de

enfermedades y contaminación, aunque se lave

mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes

que crecen en condiciones controlada para que

halla menos infecciones.

-Cámara de cultivo

La cámara de cultivo es una habitación de

dimensiones muy variables, en la que se controlan

las condiciones de luz, temperatura, humedad,

variación día-noche, etc..

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Medio de cultivo

Es suma importancia

Estado del cultivo - Sólido o líquido

Componentes

La diferencia principal entre los medios surge por ser variables los

requerimientos nutritivos de las especies.

Debe ser específicos para la parte de la planta que se esté cultivando

y para la respuesta que se desea obtener.

Una vez preparado el medio de cultivo, se ajusta el pH, ya que su

valor final es importante pues puede afectar, entre otros, a los enzimas y

a algunos componentes del medio de cultivo.

Medio de Iniciación:

Rugini (MIR),

Olive Medium (OM),

Murashige y Skoog (MS),

Lloyd y McCown,

García-Berenguer,

Fiorino y Leva

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COMPONENTES DEL MEDIO NUTRITIVO

AGUA

SALES MINERALES

MACRONUTRIENTES (N, S, P, Ca, K, Mg)

MICRONUTRIENTES (Fe, Cu, Mn, Al, B)

COMPUESTOS ORGANICOS

CARBOHIDRATOS

SUSTANCIAS HORMONALES

AMINOACIDOS Y AMIDAS

COMPUESTOS ORGANICOS

BASES ORGANICAS

INOSITOL

ACIDO MALICO

COMPUESTOS NATURALES

SUSTANCIAS INERTES

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Reguladores de crecimiento

Aquellas substancias que son sintetizadas en un

determinado lugar de la planta y se translocan a otro,

donde actúan a muy bajas concentraciones, regulando el

crecimiento, desarrollo ó metabolismo del vegetal.

Pueden ser de origen natural como sintetizadas en

laboratorio que determinan respuestas a nivel de

crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta.

Las hormonas vegetales se clasifican en cinco grupos:

Auxinas

Citocininas o citokininas

Giberelinas

Etileno

Acido abcísico

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REGULADORES DE CRECIMIENTO

AUXINAS ACIDO-3- INDOLACETICO (AIA)

ACIDO-3-INDOLBUTIRICO (AIB)

ACIDO NAFTALENACETICO (ANA)

ACIDO-4- CLOROFENOXIACETICO (2, 4-D)

ACIDO -4-AMINO- 3, 5, 6 TRICLOROPICOLINICO

(TORDAN)

CITOCININAS 6-ISOPENTENIL AMINOPURINA (IPA)

ZEATINA

6-FURBURIL ADENINA (KINETINA)

6-BENCIL AMINOPURINA (BA)

GIBERELINAS GA, GA2, GA3.... GA40

GA3 = ACIDO GIBERELICO

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Las funciones de las auxinas:

1. Dominancia apical

2. Aumentar el crecimiento de los tallos

3. Promover la división celular en el cambio vascular y diferenciación del

xilema secundario

4. Estimular la formación de raíces adventicias

5. Estimular el desarrollo de frutos (partenocárpicos en ocasiones9

6. Fototropismo

7. Promover la división celular

8. Promover la floración en algunas especies

9. Promover la síntesis de etileno (influye en los procesos de maduración

de los frutos)

10. Favorece el cuaje y la maduración de los frutos

11. Inhibe la abscisión ó caída de los frutos

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Funciones de las citocininas:

1. Estimulan la división celular y el crecimiento

2. Inhiben el desarrollo de raíces laterales

3. Rompen la latencia de las yemas axilares

4. Promueven la organogénesis en los callos celulares

5. Retrasan la senescencia ó envejecimiento de los órganos vegetales

6. Promueven la expansión celular en cotiledones y hojas

7. Promueven el desarrollo de los cloroplastos.

Funciones de la giberelinas:

• Incrementan el crecimiento en los tallos

• Interrumpen el período de latencia de las semillas, haciéndolas

germinar y mobilizan las reservas en azúcares

• Inducen la brotación de yemas

• Promueven el desarrollo de los frutos

• Estimulan la síntessis de mRNA (RNA mensajero)

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Funciones Acido abcísico:

1. Promueve la latencia en yemas y semillas

2. Inhibe la división celular

3. Causa el cierre de los estomas

4. Antagónico de las giberelinas

5. Inhibe el crecimiento

Las funciones etileno:

1. Promueve la maduración de los frutos

2. Promueve la senescencia (envejecimiento)

3. Caída de las hojas

4. Geotropismo en las raíces

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Equipo para un laboratorio de cultivo de tejidos:

Cámara de flujo horizontal

Autoclave (20 litros)

Termómetro de máx. y min.

Conductimetro de bolsillo

Equipo de aire acondicionado

Microscopio compuesto

Binocular con sistema de

Estéreo microscopio

Cámara Digital

Agitador magnético con calefacción.

Tanque Eternit de 1100 Litros con

Electro bomba

Centrífuga

Reloj/ alarma

Estabilizador de Voltaje (1000 Wa)

Estabilizador de Voltaje (1KVa)

Autoclave (30 litros)

Autoclave (40 Litros)

Destilador (2 litros/hora)

Destilador de agua

pH-metro

Balanza analítica

Balanza analítica

Des-ionizador

Incubadora

Agitador

Pastilla magnética

Refrigerador

Cámara de termoterapia

Cocinilla eléctrica

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Material de laboratorio:

Pipetas Pasteur s

Pipetas de 1 ml

Frascos de 15 onzas

Probetas 50, 500, 1000 ml

Erlenmeyer de 1000, 500 , 250, 125 ml

Microtiter plate

Discos de Aluminio

Frascos Autoclavables

Recipientes plásticos para pesado

Pipetas 10, 5, 1 ml

Balón de destilación de 1000 y 15000 ml

Matraz quitazato

Placa petri chica y grande

Tubo de ensayo 15 x 150 y 25 x 150 mm

Tubo de ensayo grande 25 x 150

Refrigerante (incompleto)

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Pinzas de Acero inoxidable curva

Mangos de Bisturí

Gradillas 25 x 150

Hojas de Bisturí

Pabilo

Papel aluminios 822.8 m x 304 mm)

Mascarillas 23 unidades

Tijeras de Acero inoxidable

Espátula de acero quirúrgico

Espátula de bronce en curva

Espátula de bronce recta

Secador para material de vidrio

Embudo plástico

Guantes quirúrgicos

Cubre bocas

Baldes de 10 litros

Pizetas de plástico

Algodón 06,5 kg.

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CONDICIONES DEL CULTIVO IN VITRO

En la cámara de flujo laminar no puede entrar material

contaminado. El problema más importante en todo el proceso

son las contaminaciones.

No se pueden esterilizar en el autoclave determinadas

sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico,

sacarosa, enzimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco

recipientes que no soporten altas temperaturas.

El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no

suministre al medio sustancias contaminantes para la planta.

Los reguladores de crecimiento (hormonas) son

imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio

de cultivo.

Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.

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El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Valores bajos,

inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes

añadidos a los medios sólidos.

Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se

puede producir su licuación.

El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos

componentes del medio de cultivo.

El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados

nutrientes por parte del explante (p.e. la absorción de iones NO3-

aumenta con la acidez del medio).

El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y

como consecuencia a la actividad de muchos enzimas

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El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de

energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

El medio de cultivo es específico, y se pueden tardar dos años en

prepararlo.

En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20

horas) y temperatura.

- Existen plantas que se desarrollan en la oscuridad.

- Lo normal son 22-26ºC, y en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y

también 28-30ºC para plantas tropicales.

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LAMPARAS

INCANDESCENTES

Producen la luz por fenómenos de incandescencia

del filamento calentado por el paso de la corriente

eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la

zona del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad

de calor y mucho consumo de electricidad.

LAMPARAS

FLUORESCENTES

Producen la luz por fenómenos de fluorescencia

del gas sometido a un arco voltáico. El espectro de

la luz producida es rico en la zona del azul, existen

fluorescentes especiales con un espectro rico en

la zona azul y roja. Consumen menos electricidad.

LAMPARAS DE

VAPOR DE

MERCURIO Y

SODIO

Producen la luz por efecto del paso de la corriente

eléctrica a través de gases calientes de mercurio

(azul y verde) y sodio (naranja). Son altamente

eficientes en el consumo de electricidad.

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Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación

también influyen determinadas características de la

planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de

explante, parte más juvenil o más adulta.

En cuanto a los recipientes, deben permitir el

intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo

que provocaría un aumento de la concentración de sales,

y por tanto la muerte de la planta. Importante el cerrar o

sellar.

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Explante es un fragmento cortado de un tejido o de un

órgano utilizado para iniciar un cultivo. Un explante

puede ser utilizado casi cualquier órgano o tejido, pero

para la micropropagación es conveniente partir de una

yema o ápice meristemático para garantizar la estabilidad

genética de sus células.

Inicio del cultivo in vitro

El material vegetal: Célula, tejido u órgano de la planta.

Partiendo de: fragmentos de tejidos somáticos, tallo, raíz,

hoja, meristemos, embriones; o de células o tejidos no

somáticos, anteras, polen, microesporas, óvulos, etc.

Según sea el explante utilizado se hablará de cultivo de

secciones nodales, cultivo de hoja, de meristemo, de polen,

de embriones, etc.

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Una regeneración de planta completa (morfogénesis o

órganogenesis) puede ser mediante la formación de raíces

(rizogénesis) y/o de tallos.

La morfogénesis parte del explante inicial por la formación de

raíces y/o tallos en posición normal o en posición no normal

(adventicias/os).

Morfogénesis indirecta:

Se produce después de la

formación de un callo.

Morfogénesis directa:

Se produce directamente

del explante sin que este

pase por fase de callo.

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Las condiciones de cultivo pueden dar origen a una

proliferación desorganizada de las células del explante

dando lugar a un callo o incluso a un cultivo de células

cuando se separan éstas del callo.

Se conoce como Caulogenesis a la formación de callo (no

diferenciado, solamente se acumulan no forman órgano ni

nada).

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El explante puede producir unas estructuras bipolares que

presentan las propiedades morfológicas de los embriones

zigóticos.

Estas estructuras se denominan embriones somáticos. Estos

pueden provenir directamente del explante o de un callo y se le

denomina Embriogénesis directa o indirecta.

EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a partir de

células no germinadas.