http://ajp.amjpathol.org/article/S0002-9440(12)00863-2/fulltext

La participación de triple hélice del colágeno que contiene repeticiones 1 en Distrofias MuscularesItai Spector, Yael Zilberstein, Adi Lavy, Olga Genin, Hila Barzilai-Tutsch, Ana Bodanovsky, Orna Halevy, Marcos Pines

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DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajpath.2012.11.004Artículo de Información

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I. Materiales y métodos A. Materiales B. Animales C. Análisis de microarrays D. Preparación de las secciones, Colágeno tinción y inmunohistoquímica E. Microscopía Confocal F. Preparación de células y ensayo de migración G. Análisis Western Blot H. Celular CTHRC1 I. Análisis estadístico

II. Resultados A. Expresión Génica CTHRC1 durante la progresión de la distrofia muscular en el ratón mdx B. CTHRC1 Expresión y miofibroblastos Infiltración en varios MDs C. El colágeno y la CTHRC1 en el diafragma del ratón mdx D. CTHRC1 expresión en pacientes con DMD E. CTHRC1 expresión en el músculo cardíaco F. CTHRC1 y miofibroblastos Migración

III. Discusión

La fibrosis es la principal complicación de las distrofias musculares. Se identificaron colágeno de repetición

triple hélice que contiene 1 (CTHRC1) en los músculos esqueléticos y cardíacos de ratones, lo que representa

Duchenne y distrofia muscular congénita (DMD y CMD, respectivamente), y dysferlinopathy. En todos los

ratones, CTHRC1 se asoció con altos niveles de colágeno tipo I; no CTHRC1 o colágeno se observó en los

músculos de ratones de control.También se observaron altos niveles de CTHRC1 en biopsias de pacientes

con DMD, en los que se correlacionaron de forma reversible con la de-β distroglicano, mientras que los

niveles de colágeno tipo I fueron elevados en todos los pacientes con DMD. En los sitios donde musculares

colágeno y CTHRC1 estaban adyacentes, las fibras de colágeno aparecieron más pequeña, lo que sugiere la

participación de CTHRC1 en el metabolismo del colágeno. Halofuginona, un inhibidor de la fosforilación de

Smad3 aguas abajo de la señalización del factor de crecimiento transformante-β, redujo los niveles de

CTHRC1 en los músculos esqueléticos y cardíacos de ratones, lo que representa DMD, CMD, y

dysferlinopathy. Los miofibroblastos que infiltran los músculos distróficos de los modelos murinos de DMD,

CMD, y dysferlinopathy eran la fuente de CTHRC1. Factor de crecimiento transformante-β no afectó los

niveles de CTHRC1 en los mdx fibroblastos pero ellos disminuyó en los fibroblastos de control, en asociación

con el aumento de la migración de mdx fibroblastos y la invasión del músculo distrófico por

miofibroblastos. Para nuestro conocimiento, esta es la primera demostración de CTHRC1 como un marcador

de la gravedad de la progresión de la enfermedad en los músculos distróficos, y como una posible diana para

la terapia.

Las distrofias musculares (MDS) comprenden una colección diversa de trastornos genéticos hereditarios

humanos, que afectan a los músculos esqueléticos y cardíacos en diferentes grados y se caracterizan por la

pérdida de masa muscular progresiva y debilidad, de la distribución y gravedad variables. 1 Algunas formas de

MD se ven en la infancia o infancia [por ejemplo, la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia

muscular congénita (CMD)], mientras que otros, como dysferlinopathy, puede no aparecer hasta la mediana

edad o después. El complejo distrofina-glicoproteína (DGC) es un gran complejo de proteínas asociadas a la

membrana que es crítica para la integridad de las fibras musculares esqueléticas. El DGC proporciona un

vínculo entre la membrana extracelular (ECM) y el citoesqueleto y se cree que protege la fibra muscular del

daño inducido por la contracción. Las mutaciones en muchos de sus componentes hacen que las

interacciones entre la membrana del citoesqueleto de las células ECM deteriorados, lo que resulta en la

enfermedad del músculo esquelético severo. Mutaciones Humanos en dystrophin-, sarcoglycan-, y los genes

que codifican dystroglycan se asocian con Duchenne y su variante alélica, distrofia muscular de Becker, tipos

de distrofia muscular del anillo óseo 2C a 2F, y dystroglycanopathy primaria, respectivamente. Aunque los

trastornos difieren en términos de mutaciones, la distribución y el alcance de la debilidad muscular, la edad de

inicio, la velocidad de progresión, y el patrón de herencia, las características histopatológicas musculares son

una característica común de las distrofias, con variaciones en el tamaño de la fibra, la proporción de fibras

musculares con núcleos centrales, apoptosis y necrosis de miofibras, invasión de macrófagos, y, en última

instancia, la sustitución de tejido sano con la grasa y el tejido conectivo. 2 La pérdida progresiva del músculo, y

de su capacidad para funcionar, se asocia con fibrosis significativa, caracterizada por aumentos en

componentes de ECM, especialmente colágeno tipo I, que es la principal complicación en varios

MDs. 3 , 4 , 5 , 6 Respiratoria y paros cardíacos son las principales causas de muerte en la DMD; resultan de

debilidad en el diafragma y el miocardio, que son los tejidos más afectados por fibrosis. En el músculo

esquelético de pacientes con DMD y CMD, el aumento de colágeno de tipo I se observaron que se

correlaciona con la destrucción muscular. 7 , 8 , 9 , 10 En los pacientes con dysferlinopathy, se observaron cambios

degenerativos inflamatorios y fibrosis en edades posteriores. 5 , 11 fibrosis del músculo causa la disfunción

muscular, afecta la regeneración muscular y reduce gen y el vástago de suministro de células y eficiencia

injerto. 12 , 13

Una de las características de músculo distrófico es la infiltración de miofibroblastos, que son la principal fuente

de colágenos y de los enzimas responsables de colágeno post-translacional modificaciones. 14 , 15 Durante la

transdiferenciación de fibroblastos-a-miofibroblastos, regulado principalmente por factor de crecimiento

transformante ( TGF) -β, los fibroblastos se someten a un cambio de fenotipo a proliferativa y miofibroblastos

contráctiles, y adquirir capacidades migratorias. 16 Los niveles de TGF-β se han mejorado en el músculo y el

plasma de los pacientes con CMD, DMD, y la distrofia muscular de Becker. 4 , 17 , 18 , 19 de liberación de TGF-β de

miofibras necróticas y macrófagos infiltrantes contribuyó a la pérdida progresiva de la regeneración muscular,

mientras que el aumento en la fibrosis 17 , 20 y la inhibición de TGF-β / Smad3 señalización mejorado el fenotipo

patológico en ratones distróficos. 14 , 15 , 21 , 22

Halofuginona es un inhibidor de Smad3 fosforilación aguas abajo de la vía TGF-β señalización. 23 En modelos

murinos de DMD, CMD, y dysferlinopathy, halofuginona inhibió Smad3 fosforilación en los músculos cardíacos

y esqueléticos, un efecto que se asoció con fibrosis muscular disminuido y mejorada la coordinación motora y

el equilibrio. 14 , 15 , 22Además, el tratamiento de halofuginona disminuyeron fibrosis muscular y mejorar la función

pulmonar y el músculo cardíaco en mayores mdx ratones que presentaban fibrosis establecida. 24

El colágeno de repetición triple hélice que contiene 1 (CTHRC1) es una proteína glicosilada de 30 kDa

secretada con un motivo de colágeno corto, con 12 Gly-XY repite responsable de trimerización de la proteína

y, por lo tanto, que lo protege de la escisión. CTHRC1 fue identificado por primera vez durante la detección de

secuencias expresadas diferencialmente en las arterias lesionadas por balón, donde se asoció con

miofibroblastos y sitios de deposición de la matriz de colágeno. 25 , 26 CTHRC1 podrá regular la capacidad de

respuesta de TGF-β, lo que afecta los genes diana de TGF-β. 27 El la expresión del gen de  CTHRC1 estaba

bajo el control de TGF-β, y su aumento de la expresión se asoció con el aumento de la migración celular, la

motilidad y la invasión, 28 , 29 y con la inhibición de estimulada por TGF-β síntesis de colágeno de tipo I. 30 , 31 Por

lo tanto , CTHRC1 puede contribuir a la remodelación de la matriz y reparación de tejidos, al limitar el depósito

de colágeno y la promoción de la migración celular. 32

En el presente estudio, se evaluó la expresión de CTHRC1 en los músculos esqueléticos más afectadas y en

el músculo cardíaco en varios modelos de ratón de los MD y en pacientes con DMD. Se evaluaron las

funciones de TGF-β y halofuginona en la síntesis CTHRC1 y la participación de CTHRC1 en la migración de

miofibroblastos.

Materiales y métodos

Materiales

Bromhydrate Halofuginona se obtuvo de halo Therapeutics, LLC (Boston, MA). Monoclonal prolil β 4-

hidroxilasa (P 4 Hβ) y anticuerpos policlonales anti-macrófagos fueron adquiridos de Acris (Hiddenhausen,

Alemania), y CTHRC1 monoclonal, policlonal de ratón específicos de colágeno de tipo I, monoclonal β-

distroglicano (β-DG), y anticuerpos de distrofina eran de Abcam (Cambridge, UK). Policlonal de conejo anti-

Ying-Yang 1 (YY1) era de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA). TGF-β era de PeproTech (Rocky

Hill, NJ). Fibroblastos de piel humana (BJ; catolog número CRL-2522) se obtuvieron de ATCC (Manassas,

VA).

Animales

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional

Centro Volcani de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IL-234/10 y IL-274/10). Los animales fueron

alojados en jaulas en condiciones de fotoperiodo constante (12 horas de luz: 12 horas de oscuridad) con

acceso libre a comida y agua.Utilizamos las deficiencia de distrofina mdx ratones representan DMD, la dy 2J /

dy 2J ratones con reducción de la cadena α2 laminina que representa CMD1A, y el DISF - / - ratones que

representan dysferlinopathy con una deleción de los últimos tres exones del disferlina retirar su

gen trans- membrana de dominio. Todos los ratones fueron inyectados ip con solución salina o con

halofuginona tres veces por semana. Los ratones con diferentes miopatías se utilizaron a diferentes edades y

se trató con halofuginona a diferentes concentraciones, de acuerdo con la progresión de la enfermedad y la

gravedad de la fibrosis en los músculos esqueléticos y cardíacos. El mdx y la dy 2J / dy 2J ratones desarrollan

fibrosis en las primeras etapas, 14 , 22 mientras que DISF - / - ratones desarrollan fibrosis muscular en etapas

posteriores. 15 La gravedad de la fibrosis muscular de la dy 2J / dy 2J ratones requiere un tratamiento más

prolongado . Los mdx ratones ( n= 10) fueron inyectados durante 2 semanas a 7,5 g por ratón, a partir de la

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edad de 4 semanas; los dy 2J / dy 2J ratones ( n= 8) fueron inyectados durante 15 semanas a 5 g por ratón,

comenzando a la edad de 3 semanas; y la DISF - / - ratones (n = 8) fueron inyectados durante 4 meses a 7,5 g

por ratón, comenzando a la edad de 9 meses. Muscular y C57 / BL muestras de biopsia de la misma edad se

utilizaron como controles.

Análisis de microarrays

C57 / BL / 6J y mdx ratones ( n = 4 por grupo) fueron inyectados con solución salina o halofuginona a 7,5 g

por ratón, tres veces por semana, comenzando a la edad de 3 semanas. A los 5, 7, y 11 semanas, se

recogieron y agruparon los diafragmas, y el impacto del tratamiento halofuginona en la transcriptomes de los

diafragmas de mdx ratones se determinó en dos experimentos independientes que utilizan Affymetrix

GeneChip MG430A oligonucleótido y MG430B microarray basado en el perfil transcripcional ( Affymetrix,

Santa Clara, CA), como se describió previamente. 33 Los datos de microarrays se agruparon y se analizaron

mediante el uso de GeneSpring GX11 versión de software Expression 12 (Agilent Technologies, Santa Clara,

CA), y se normalizaron utilizando la robusta Multichip medio. 34

Preparación de las secciones, Colágeno tinción y

inmunohistoquímica

Al final de los experimentos, las muestras de biopsia de diafragma ( mdx ), gastrocnemio ( dy 2J / dy 2J ),

longissimus (DISF - / - ), y cardíaco ( mdx , DISF - / - ) se recogieron y se fijaron los músculos, y las secciones se

prepararon como se ha descrito previamente. 22 Los músculos se inmunotiñeron con P 4 Hβ (1:25), el colágeno

tipo I (1: 100), macrófagos (1: 250), y CTHRC1 (01:50) anticuerpos. Los bloques de parafina de gastrocnemio

muestras de biopsia de tres pacientes con DMD y de un niño de 2 años de edad, se sospecha que tiene un

trastorno metabólico que se obtuvieron del Instituto de Patología archivos (Centro Médico Rambam en Haifa,

Israel). Las biopsias fueron immunostained con distrofina (1: 100) o doble immunostained con I (1: 100) y

colágeno tipo CTHRC1 (1:50) anticuerpos. Los núcleos se detectó con DAPI.Al menos 20 imágenes de cinco

secciones de tejido de cuatro ratones por grupo diferentes se obtuvieron para cada análisis.

Microscopía Confocal

La observación microscópica y la adquisición de imágenes se realizaron con una Olympus IX 81 confocal

invertido microscopio de escaneo láser (Fluoview 500; Olympus, Tokio, Japón), equipado con un láser de

diodo de 405 nm, un láser de ion argón de 488 nm, un 543- nm láser de helio-neón, y una numérica PlanApo

apertura del objetivo de inmersión en agua 60 × 1,0. DAPI se excita a 405 nm, y se recogió la emisión a través

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de un BA 430-460 filtro; de color verde se excita a 488 nm, y se recogió la emisión a través de un BA 505-525

filtro; de color rojo estaba emocionado a 543 nm, y la emisión se recogió a través de un filtro de

inmunofluorescencia BA 560. Las imágenes de luz transmitida se obtuvieron mediante Nomarski contraste de

interferencia diferencial. Se utilizaron anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón con colorante Alexa Fluor

(Molecular Probes, Carlsbad, CA). Las imágenes Z-pila (cada uno cubriendo 1,2 micras y 12 micras de

penetración en la superficie del tejido) se visualizaron con el software 7.6 Imaris (Bitplane Scientific Software,

St. Paul, MN).

Preparación de células y ensayo de migración

Mioblastos primarios de 3 semanas de edad C57 / BL / 6J y mdx ratón diafragmas se prepararon como se ha

descrito previamente. 35 , 36 Los músculos fueron extirpados y se digirieron durante 1 hora a 37 ° C con 1,25

mg / mL Pronasa, una mezcla de proteinasas a partir de Streptomyces griseus (Boehringer, Mannheim,

Alemania) y luego con 0,25% (w / v) de tripsina durante otros 30 minutos. Los fragmentos de tejidos se

recogieron por centrifugación a 1500 × g durante 5 minutos y luego se titularon a través de una pipeta

fina. Una población enriquecida de células miogénicas se recuperó por centrifugación diferencial (500

× g durante 1 minuto y luego 1.500 × g durante 5 minutos) se resuspendió, y el sedimento en medio de

Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) que contiene 1% de solución de antibiótico-antimicótico y 10 % de

suero de caballo. El cultivo se pasó a través de una membrana de nylon (200 micras) y preplated durante 2

horas en placas de cultivo celular no recubiertas para permitir que los fibroblastos se unan a la superficie de

plástico, mientras que los mioblastos se mantuvieron en el medio. Después de 2 días, no se observaron

células Pax-7 que expresan en los cultivos de fibroblastos. Los fibroblastos (75 × 10 4 ) se cultivaron durante

48 horas, y se recogieron y se almacenaron a 4 ° C los medios de comunicación de condición. Los

fibroblastos (10 5 ) desde el diafragma de cualquiera de C57 / BL o mdx ratones fueron sembradas en placas

de cultivo de tejidos de 12 pocillos y se cultivaron casi hasta la confluencia en DMEM que contenía suero

bovino fetal al 10%. Se añadieron los medios condición a la C57 / BL y mdxfibroblastos y se incubaron

durante 2 horas, después de lo cual una herida lineal se genera en la monocapa con un 200-l punta de la

pipeta de plástico estéril. 37 se eliminó cualquier residuo celular mediante el lavado de las células con los

medios de comunicación condición apropiada. Se añadió Halofuginona (10 nmol / L), a partir de 2 horas antes

de la iniciación del ensayo, y estuvo presente durante todo el experimento. Las placas de cultivo se colocaron

en un microscopio Nikon Eclipse-Ti (Nikon, Tokio, Japón) cámara de incubación a 37 ° C con 5% de CO 2 , y

instantáneas de cada pocillo fueron tomadas en tres posiciones X, Y cada 7 minutos durante 12 horas . La

distancia de migración de cada grupo se evaluó con el software de Nis-Elements AR versión 3.2 (Nikon

Instruments Inc., Melville, NY).

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Análisis Western Blot

Se realizó análisis de transferencia de Western como se describió previamente. 36 Brevemente, cantidades

iguales de proteína (gastrocnemio) se resolvieron por 10% SDS-PAGE y después se transfirió a membranas

de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Después del bloqueo, las membranas se incubaron

con anticuerpo monoclonal de ratón anti-CTHRC1 (1: 500) y YY1 policlonal de conejo (1: 500) anticuerpos. La

transcripción YY1 proteína represora fue elegido porque su expresión génica en los diafragmas

de mdx ratones no fue alterada en comparación con la de los ratones C57 / BL (AL y MP, datos no

publicados).

Celular CTHRC1

Línea celular de fibroblastos de la piel humana y los fibroblastos primarios derivados de diafragmas de C57 /

BL y mdxratones se colocaron en cubreobjetos en DMEM libre de suero. Cuando se alcanzó 70% de

confluencia, se añadieron TGF-β y halofuginona para alcanzar concentraciones finales de 3 ng / mL y 10 nmol

/ L, respectivamente, por un período adicional de 24 horas de incubación. Las células fueron fijadas en

paraformaldehído al 2% durante 10 minutos y se inmunotiñeron con el ratón anti-CTHRC1, y luego con DAPI

durante 10 minutos.

Análisis estadístico

Los datos fueron sometidos a análisis unidireccional de varianza y de los todos los pares de Tukey-Kramer

prueba de la diferencia honestamente significativa mediante el uso de software JMP Salto Descubrimiento

Pro-Estadístico (SAS, Cary NC).

Resultados

CTHRC1 la expresión génica durante la progresión de la

distrofia muscular en el mdx Ratón

El análisis de microarrays que comparó la expresión génica en el diafragma de la C57 / BL con la de

la mdx ratón reveló que CTHRC1 fue uno de los primeros genes regulados durante la progresión de la

enfermedad (datos no mostrados). El análisis cuantitativo en tiempo real PCR reveló casi no CTHRC1 la

expresión génica en el diafragma de los / BL ratones de tipo salvaje C57 en cualquiera de los puntos de

tiempo ensayados, independientemente del tratamiento de halofuginona ( Figura 1 ). Un aumento importante

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en CTHRC1 se observó la expresión génica durante las primeras etapas de la enfermedad (7 semanas), con

una tendencia a disminuir a partir de entonces (11 semanas). Halofuginona causó disminuciones

en CTHRC1 la expresión génica en un 50% y 60% después de 4 y 8 semanas de tratamiento,

respectivamente.

Figura 1

CTHRC1 expresión génica en el mdx diafragma de ratón. C57 / Bl ymdx ratones a la edad de 3 semanas se

trataron con solución salina o con halofuginona (7.5 g por ratón, tres veces por semana). Después de 4 y 8

semanas de tratamiento, se recogieron y se sometieron a análisis en tiempo real de PCR cuantitativa

diafragmas. Los resultados son las medias ± SE de tres animales diferentes a partir de dos experimentos

separados. * P <0,05 según la prueba de rango múltiple de Duncan.

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CTHRC1 Expresión y miofibroblastos Infiltración en varios MDs

Infiltración muscular por miofibroblastos, la principal fuente de proteínas ECM, es característica de varios

MDs. 14 , 15doble inmunotinción se utilizó para evaluar los niveles de proteína CTHRC1 y el número de

miofibroblastos que expresan P 4 Hβ, la enzima importante entrecruzamiento del colágeno, en el diafragma de

la mdx ratón, el gastrocnemio de la dy 2J / dy 2J ratón, y el longissimus de la DISF - / - ratón; estos representan

los músculos más afectados en la DMD, CMD, y dysferlinopathy, respectivamente ( Figura 2 ). Las muestras

de biopsia muscular apropiados de ratones C57 / BL de la misma edad se utilizaron como controles. Ninguna

expresión CTHRC1 y no hay células que expresan P 4 Hβ se detectaron en el / BL ratón C57,

independientemente del tipo de músculo o la edad ( Figura 2 , A, D, y G). Importantes aumentos en los niveles

CTHRC1 se observaron en el diafragma, gastrocnemio, y longissimus del mdx , dy 2J / dy 2J , yDISF - / - ratones,

respectivamente ( Figura 2 , B, E y H, respectivamente). El mayor incremento en los niveles CTHRC1 estaba

en el mdx diafragma de ratón, y el incremento más bajo se observó en el longissimus del DISF - / - ratones. En

todos los músculos examinados, CTHRC1 fue localizado adyacente a la regeneración de fibras musculares,

con núcleos centrales rodeados de miofibroblastos que expresan P 4 características Hβ de minidiscos. Análisis

de la imagen (por lo menos 10 secciones diferentes de cada uno de los tres ratones) reveló que, en

el mdx diafragma, el área cubierta por CTHRC1 adyacente a miofibras regeneradoras era 21 veces mayor que

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la cubierta por CTHRC1 adyacente a miofibras nonregenerating (11783 ± 2300 en comparación con 546 ± 77

píxeles), mientras que en el DISF - / - longissimus, todas las miofibras CTHRC1 (3733 ± 900 pixeles) eran

adyacentes a las miofibrillas con núcleos centrales. Después del tratamiento halofuginona, no centralmente

miofibras nucleadas y casi no hay miofibroblastos se observaron en ninguno de los músculos estudiados, y

sólo trazas de CTHRC1 se detectaron ( Figura 2 , C, F y I). A fin de verificar la fuente de CTHRC1, un Western

blot de cultivos de mioblastos y fibroblastos derivados de C57 / BL, mdx , y DISF - - / se realizó ratones. Casi

ninguna CTHRC1 se observó en los mioblastos de cualquiera de los ratones, mientras que se observaron

altos niveles de CTHRC1 en fibroblastos, especialmente los derivados de la C57 / BL y mdx ratones ( Figura

3 ).

Figura 2

Presencia de miofibroblastos y expresión CTHRC1 en varios doctores en medicina. A : El diafragma de un 6

semanas de edad C57 / Bl ratón.B : El diafragma de un 6 semanas de edad mdx ratón. C : Diafragma de un 6

semanas de edad mdx ratón tratados durante 2 semanas con halofuginona. D : Gastrocnemius de un joven de

18 semanas de edad C57 / Bl ratón. E : Gastrocnemius de un joven de 18 semanas de edad,dy 2J /

dy 2J ratón. F : Gastrocnemius de un joven de 18 semanas de edad, dy 2J / dy 2J ratones tratados durante 15

semanas con halofuginona. G : Longissimus de un niño de 12 meses de edad C57 / Bl ratón. H : Longissimus

de un niño de 12 meses de edad, DISF - / - . ratón I : Longissimus de un niño de 12 meses -oldDISF - / - ratón

tratado durante 4 meses con halofuginona. Los diversos músculos se doble immunostained con CTHRC1

(verde) y P 4 Hβ (rojo) anticuerpos. Los núcleos (azul) se tiñeron con DAPI. Las flechas amarillas indican

miofibras con núcleos centrales, flechas rojas , miofibroblastos expresa P 4 Hβ.

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Figura 3

Western blot de miofibroblastos (mio) y fibroblastos (fibro) derivados de los gemelos de C57 / Bl, mdx ,

y DISF - / - ratones. Igual cantidad de proteína se resolvieron por 10% SDS-PAGE y después se transfirieron a

membranas de nitrocelulosa. Después del bloqueo, las membranas se incubaron con anticuerpos CTHRC1 y

YY1. AU, unidades arbitrarias que describen el nivel de CTHRC1 comparación con YY1.

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El colágeno y la CTHRC1 en el diafragma del mdx Ratón

Se observaron altos niveles de colágeno tipo I y CTHRC1 en 6 semanas de edad mdx diafragmas, junto con

miofibras con núcleos centrales, característico de mdx características histopatológicas ( Figura 4 , A y

C). Halofuginona tratamiento durante 2 semanas, comenzando a la edad de 4 semanas, causó reducciones

en el número de miofibras con núcleos centrales y en los niveles de colágeno tipo I, y la eliminación de casi

todos CTHRC1 desde el diafragma ( Figura 4 , B y D) . En tejidos embrionarios y postnatales, los sitios de

expresión CTHRC1 superponen considerablemente con colágenos intersticiales. 26 La microscopía confocal se

utilizó para obtener imágenes Z-pila de los diafragmas de los mdxratones que habían sido doble

inmunoteñidas con colágeno de tipo I y anticuerpos CTHRC1 antes ( figura 5 , A-D) y después ( Figura 5 E) de

tratamiento halofuginona. Los resultados se visualizaron mediante el uso de software Imaris, que reconstruye

una imagen tridimensional del colágeno y CTHRC1. Dentro del diafragma, el colágeno tipo I y CTHRC1

cubierto adyacente, pero diferente, áreas y no fueron colocalized ( Figura 5 , A y B). Las fibras de colágeno

eran más pequeñas en zonas de altos niveles CTHRC1 ( Figura 5 C). Las fibras de colágeno en

la mdx diafragma antes y después del tratamiento halofuginona fueron 5,6 ± 0,6 y 1,64 ± 0,3 m de diámetro,

respectivamente, tal como se mide con la herramienta de análisis Imaris en al menos 30 diferentes fibras. Una

vista de la imagen tridimensional en el plano horizontal también representa las diversas áreas de colágeno de

tipo I y de expresión CTHRC1, y mostró importantes reducciones en los niveles de ambas proteínas después

del tratamiento halofuginona, en comparación con aquellos en el diafragma no tratada ( Figura 5 , D y E).

Figura 4

Colocalización de CTHRC1 y colágeno en el mdx diafragma. Los diafragmas de 6 semanas de

edad mdx ratones ( A y C ) y mdx ratones tratados con halofuginona (7.5 g por ratón, tres veces por semana)

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durante 2 semanas ( B y D ) fueron doble immunostained con colágeno tipo I (rojo) y CTHRC1 (verde)

anticuerpos. Los núcleos (azul) se tiñeron con DAPI. Tenga en cuenta los altos niveles de colágeno tipo I y

CTHRC1, y su estrecha asociación en el espacio extracelular, y la presencia de miofibras con núcleos

centrales ( flechas ) en el mdxmouse. Tratamiento Halofuginona causó grandes reducciones en los niveles de

colágeno y elimina CTHRC1 y miofibras con núcleos centrales.

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Figura 5

Reconstrucción de colágeno de tipo I y CTHRC1 de las imágenes Z-pila del mdx diafragma de

ratón. Los mdx diafragmas de ratón antes ( A - D ) y después ( E ) de tratamiento halofuginona se doble

immunostained con colágeno tipo I (rojo) anticuerpos CTHRC1 (verde) y. Doce imágenes Z-stack fueron

tomadas, y el software Imaris se utilizó para la reconstrucción tridimensional. El colágeno tipo I y CTHRC1

cubrir diferentes áreas dentro del diafragma, con áreas de superposición ( A yB ), y las fibras de colágeno

aparecen más pequeños en las áreas de altos niveles CTHRC1 ( C ). Vistas horizontales de la mdx diafragma

ratón antes de ( D ) y después ( E ) de tratamiento halofuginona. Se observaron importantes reducciones en

tanto el colágeno tipo I y CTHRC1 después del tratamiento halofuginona.

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CTHRC1 expresión en pacientes con DMD

Las biopsias fueron tomadas de los gemelos de tres pacientes con DMD de diferentes edades (carentes de

distrofina) y una muestra de biopsia de control de un niño de 2 años de edad, sin conexión DMD (con

distrofina) ( Figura 6 ). Además de la distrofina, los niveles de una glicoproteína clave asociado a la distrofina

pueden dar una indicación del grado de alteraciones secundarias en pacientes con DMD. El nivel de β-DG

que era alta en la muestra de biopsia de control casi desaparecido en los pacientes jóvenes de 5 y 8 años,

pero fue considerablemente mayor en los 12 años de edad, paciente, lo que sugiere un fenotipo más leve de

la enfermedad ( Figura 6 ) . Las mismas muestras de biopsia se doble immunostained por colágeno tipo I y

CTHRC1 ( Figura 6 ). Estaba observé Casi nadie colágeno tipo I o CTHRC1 en la biopsia de control, mientras

que se observaron incrementos importantes en ambas proteínas en el 5-años de edad, paciente con DMD. El

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colágeno tipo I se localizó en el intersticio entre las fibras, mientras que la mayoría de la CTHRC1 fue

localizado dentro de las miofibras. En todos los pacientes, el nivel de colágeno se mantuvo alta, mientras que

la de CTHRC1 correlaciona con la gravedad de la enfermedad; que era alta en los pacientes con un bajo β-

DG y baja en el paciente con un alto β-DG. Las relaciones CTHRC1 / colágeno (evaluados mediante análisis

de imágenes de ocho campos de cada muestra de biopsia) fueron 1,52, 1,12 y 0,73 para los pacientes en las

edades de 5, 8 y 12 años, respectivamente.

Figura 6

El colágeno tipo I y CTHRC1 en pacientes con DMD. Las biopsias fueron tomadas de los gemelos de tres

pacientes con DMD de diferentes edades, ya partir de una muestra de biopsia de control. Fila superior : La

inmunotinción para la distrofina (Dys). Fila central :. La inmunotinción para β-DG (mancha verde) Las

flechasindican las miofibrillas con núcleos centrales. Fila inferior : inmunotinción doble para el colágeno tipo I

(Col 1, rojo) y CTHRC1 (verde). Los altos niveles de colágeno tipo I en los pacientes con DMD se mantuvo

similar en todos los pacientes, independientemente de su edad y el nivel de β-DG, mientras que la de

CTHRC1 fue alta en los pacientes con bajos niveles de β-DG y baja en aquellos con los más altos niveles de

β-DG.

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CTHRC1 expresión en el músculo cardíaco

Fibrosis cardiaca es una característica principal en modelos animales y en pacientes con DMD y

dysferlinopathy. 15 , 22 ,38 , 39 , 40 El músculo cardíaco de los ratones de tipo salvaje C57 / BL fue desprovisto de

cualquier CTHRC1 en las edades de 14 días y 1 año ( Figura 7 , A y D, respectivamente). Se detectaron

aumentos masivos en los niveles CTHRC1 en el músculo cardiaco de un 14 días de edad mdx  ratón y de un

1 año de edad, DISF - / - ratón ( Figura 7 , B y E, respectivamente). En contraste con la localización intersticial

de CTHRC1 en el diafragma y longissimus del mdx y DISF- / - ratones, en el músculo cardíaco, se observaron

altos niveles de CTHRC1 dentro de las fibras. Tratamiento Halofuginona dio lugar a importantes

disminuciones en los niveles cardiacos CTHRC1 tanto en mdx y DISF - / - ratones rastros, y sólo de la proteína

se mantuvo después del tratamiento halofuginona ( Figura 7 , C y F).

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Figura 7

CTHRC1 en el músculo cardíaco. Las muestras de biopsia se obtuvieron de los músculos cardíacos de 6

semanas de edad mdxratones sin ( B ) y con ( C ) 2 semanas de tratamiento halofuginona, y de 12 meses de

edad DISF - / - ratones sin ( E ) y con ( F ) 4 meses de tratamiento halofuginona. Los músculos de ratones C57 /

BL-emparejados por edad se utilizaron como controles ( A y D ). Los músculos se immunostained con

anticuerpos CTHRC1 (verde), y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul).

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CTHRC1 y miofibroblastos Migración

Existe una estrecha asociación entre CTHRC1 y TGF-β: en algunos casos, el TGF-β hasta reguladas síntesis

CTHRC1 41; en otros, CTHRC1 redujo los niveles de TGF-β y se inhibe la vía de señalización de TGF-

β. 27 , 31 , 42 Se evaluaron los efectos de TGF-β y halofuginona, solo o en combinación, sobre los niveles celulares

de CTHRC1 en fibroblastos de piel humana en cultivo ( Figura 8 ). En ambas células no tratadas y tratadas

con halofuginona, CTHRC1 fue localizado en el citosol. Cuando las células se incubaron en presencia de

TGF-β, CTHRC1 casi desapareció desde el citosol y transloca al núcleo, donde se detectaron sólo

trazas. Tratamiento Halofuginona superó la inhibición de TGF-β-dependiente de la síntesis CTHRC1 e impidió

su translocalization de nuevo a los núcleos. Como en fibroblastos de piel humana, TGF-β redujo los niveles de

CTHRC1 en fibroblastos derivados de la membrana C57 / BL ( Figura 9 A). Por otra parte, los fibroblastos

derivados de la mdx diafragma no respondieron a TGF-β, y los niveles de CTHRC1 en el citosol fueron

similares con y sin tratamiento TGF-β. Los fibroblastos de los mdx diafragmas ratón migrado a un ritmo más

rápido que las derivadas de los diafragmas C57 / BL ( Figura 9 B). Halofuginona, que no afecta a la migración

de los fibroblastos de diafragma C57 / BL, inhibe la migración de los derivados de la mdx diafragma, que

alcanzó el mismo nivel que los de los fibroblastos C57 / BL. Los diafragmas de los mdx ratones fueron

invadidos por los macrófagos y miofibroblastos que se observaron para infiltrarse en el músculo en el mismo

lugar, en las zonas adyacentes a las miofibrillas centralmente nucleadas ( Figura 9 C). Tanto los macrófagos y

los miofibroblastos desaparecido casi por completo en las halofuginona tratados mdx ratones.

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Figura 8

Síntesis de CTHRC1 por los fibroblastos. Fibroblastos de piel humana cultivadas en DMEM libre de suero se

trataron con TGF-β (3 ng / mL), halofuginona (10 nmol / L), o una combinación de los dos. Después de 24

horas de incubación, las células se fijaron y se inmunotiñeron con el ratón anti-CTHRC1 (verde), y los núcleos

se tiñeron con DAPI. En el control de las células (Cont) y los tratados con halofuginona, se encontraron altos

niveles de CTHRC1, principalmente en el citosol. En las células TGF-β-tratada, se observó una reducción

importante en CTHRC1, y sólo trazas se encontraron en los núcleos. Halofuginona superaron el efecto de

TGF-β cuando se utilizaron dos tratamientos juntos.

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Figura 9

Participación de CTHRC1 en la migración y la invasión. Fibroblastos primarios se prepararon a partir de los

diafragmas C57 / Bl y mdxratones. A : cultivos de fibroblastos se tiñeron para CTHRC1 antes y después de la

adición de TGF-β. TGF-β no afectó los niveles CTHRC1 en los mdx fibroblastos. B : ensayo de

migración. Fibroblastos primarios derivados de diafragmas de C57 / Bl y mdx ratones fueron incubadas con y

sin halofuginona, y sus tasas de migración se evaluaron en un ensayo de cero. En cada columna, medios

( n = 5) sin una letra común difieren significativamente, de acuerdo con la prueba de rango múltiple de

Duncan. * P <0,05. Los mdx fibroblastos migran mejor que los fibroblastos de control, y halofuginona

redujeron sólo el mdx fibroblastos migración. C : Los diafragmas de mdx ratones antes y después del

tratamiento halofuginona se doble immunostained para los macrófagos (rojo) o miofibroblastos-expresado

P 4 Hβ (verde). Miofibrillas con núcleos central (amarillo). Los numerosos miofibroblastos y macrófagos

observados en el mdx diafragma fueron casi completamente ausente en halofuginona tratados mdx ratones.

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DiscusiónEn este estudio, hemos demostrado por primera vez, a nuestro entender, la participación de CTHRC1 en los

músculos esqueléticos y cardíacos de varios modelos MD de ratón, que representa temprana y tardía de la

enfermedad, y en pacientes con DMD. El análisis preliminar de los datos de microarrays durante la progresión

de la enfermedad en el mdxdiafragma ratones sugiere que los genes relacionados con la biosíntesis de

colágeno se vieron afectadas durante las primeras etapas de la enfermedad, mientras que los genes

implicados en la inflamación se vieron afectadas durante todo el período. Existe una estrecha relación entre

los procesos de regeneración asociada de la inflamación y la fibrosis. 43CTHRC1 es uno de los genes que son

regulados en marcha en el mdx diafragma de ratón ( Figura 1 ). La expresión de laCTHRC1 gen está bajo la

regulación, TGF-β 25 , 41 y el tratamiento con halofuginona, un inhibidor de la fosforilación de Smad3 aguas

abajo de la señalización de TGF-β en los músculos distróficos 15 , 36 y otros tejidos, 44 , 45 resultó en una reducción

en CTHRC1 expresión génica en el mdx diafragma ( Figura 1 ). Por otra parte, el nivel de CTHRC1 fue alta en

los músculos más dañadas de la DMD, CMD, y modelos dysferlinopathy ratón, lo que sugiere que los

fenómenos generales están involucrados, independientemente de las diferentes mutaciones en los distintos

MDs ( Figura 2 ). Esta sugerencia se ve apoyado por la minería de datos de expresión génica que reveló

aumentos en CTHRC1 expresión génica, en muestras de biopsia muscular de los pacientes con muscular del

anillo óseo MD 2A con una mutación en calpaína-3, 46 en pacientes con DMD con una mutación en la

distrofina, 47 y en pacientes con Emery-Dreifuss MD con una mutación en la lamina A / C. 48 En los pacientes

con DMD, el nivel de CTHRC1 fue inversamente correlacionada con la de β-DG, lo que sugiere una

correlación con la gravedad de la enfermedad ( Figura 6 ). En circunstancias normales, se une distroglicano

laminina en el ECM y distrofina en la cara citoplasmática, permitiendo que el DGC se mantenga de forma

estable en el sarcolema. En pacientes con DMD o en el mdx ratón, el motivo de unión de dominio de WW en

distroglicano está expuesto, lo que permite la orientación de distroglicano para la degradación que resulta en

la pérdida de todo el DGC desde el sarcolema. Por otra parte, los defectos en DGC también pueden conducir

a cambios en la capacidad proliferativa de las células satélite que juegan un papel clave en el equilibrio entre

la capacidad degenerativa y de regeneración de los músculos, cambios que pueden resultar en la

regeneración muscular pobre. 49 El diafragma de la mdx mouse exhibido los más altos niveles de CTHRC1

( Figura 2 ), probablemente debido a la expresión diferencial de genes implicados en las vías de degeneración

y regeneración en diferentes modelos de ratón de MDs, 49 y debido a la naturaleza agresiva de la progresión

de la enfermedad en el diafragma.

Los miofibroblastos se infiltran, ya sea derivados de fibroblastos residentes o reclutados a partir de células

circulantes derivadas de médula ósea, fueron probablemente la principal fuente de CTHRC1 ( Figuras 2 y 4 ),

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como se observa en las arterias y las heridas de la piel. lesionada 26 En el presente estudio, los miofibroblastos

que se infiltraron en los músculos distróficos fueron reclutados por y estaban ubicados en las cercanías de las

miofibrillas con núcleos centrales (Figura 2 ), lo que sugiere la diafonía entre las miofibrillas en regeneración y

los miofibroblastos infiltrantes. 14 , 15Halofuginona inhibe la transición de fibroblastos a

miofibroblastos 23 , 50 , 51 mediante la inhibición de la síntesis de proteínas, tales como CTHRC1 ( Figura 1 , Figura

2 , Figura 8 ), colágeno, 52 proteína de activación asociada a / de las células estrelladas cytoglobin, y

transgelin, 53 todos los cuales son característicos de miofibroblastos y están bajo la el control de la TGF-β /

Smad3 vía. Una reducción en el número de miofibras dañadas por halofuginona dio lugar a disminuciones en

tanto el número de la infiltración de los miofibroblastos en los músculos distróficos y en los niveles de

CTHRC1, que de nuevo sugiere la participación de las fibras en el centro nucleadas en el reclutamiento de

miofibroblastos. En el mdx diafragma, el aumento de CTHRC1 se asoció con un aumento importante de

colágeno tipo I (Figura 4 ), lo que es característico de la mdx diafragma. 22 , 54 aumentos en el colágeno tipo I del

músculo también se observaron en CMD y modelos dysferlinopathy ratón , 14 , 15 que sugiere una posible

asociación entre el colágeno tipo I y CTHRC1 en otros MDs también. Además, se observó un alto nivel de

CTHRC1 en el músculo cardíaco, especialmente en el miocardio ( Figura 7 ), que coincidió con el sitio de la

síntesis de colágeno cardiaco en estos ratones. 15 , 22 que es más importante, la fibrosis cardiaca es una

complicación mayor en pacientes con DMD y. dysferlinopathy 55 , 56 en los músculos esqueléticos de ratones, la

mayoría de la CTHRC1 fue localizado en los espacios intersticiales entre las fibras musculares ( Figura 2 ),

mientras que en el diafragma humana y el músculo cardíaco de ratón, se localiza dentro de las miofibras ( Las

figuras 6 y 7 ). Es todavía por determinar si esta variación en la localización fue en parte por el hecho de que,

en el músculo esquelético, CTHRC1 es sintetizada por células reclutadas, mientras que en el músculo

cardíaco, que se sintetiza por las células residentes o miofibras. Al igual que en los músculos esqueléticos, se

observó una importante reducción en los niveles CTHRC1 en el músculo cardíaco después del tratamiento

halofuginona. Se observó una asociación similar entre el colágeno y CTHRC1 en las arterias lesionadas y

heridas de la piel. 26 CTHRC1 inhibe la síntesis de colágeno, probablemente mediante la regulación de la

capacidad de respuesta de TGF-β, lo que afecta los genes TGF-β-dependiente, incluyendo

colágenos. 25 , 27 Además, CTHRC1 específicamente afectada la señalización de TGF-β, mediante la inhibición

de TGF-β-dependiente Smad2 / 3, pero no la de las proteínas morfogenéticas del hueso, y las células que

sobreexpresan CTHRC1 habían reducido los niveles de ambos fosforilados Smad2 / 3 y procolágeno. 30Las

observaciones que CTHRC1 y colágeno tipo I ocuparon diferentes, pero adyacentes, áreas ( Figuras 4 y 5 ) y

que las fibras de colágeno fueron menores después del tratamiento halofuginona ( Figura 5 , C y D) apoyan la

idea de que, en los MD, CTHRC1 está implicado en la inhibición de la síntesis de colágeno, o incluso también

en la degradación del colágeno. Esta conclusión es apoyada por el importante aumento dependiente de la

edad en el colágeno y otras proteínas ECM observados en el mdx diafragma. 57 Por lo tanto, CTHRC1 es

probablemente parte de la maquinaria fisiológica que invierte la reacción fibrótica después de la terminación

del estímulo TGF-β. En condiciones crónicas, tales como el MDS, en la que el TGF gen se activa en el

proceso distrófico en todas las etapas de la degeneración, 49 CTHRC1 niveles se mantienen altos durante

períodos prolongados.

CTHRC1 ha sido implicado en la migración celular, debido a sus altos niveles en varios cánceres

metastásicos e invasoras. 32 , 42 , 58 , 59 Además, desmontables de CTHRC1 inhibieron la motilidad

celular, 28 mientras que los fibroblastos y células musculares lisas que sobreexpresan CTHRC1 emigraron a la

zona de la herida significativamente más rápido que las células de control. 25 Por otra parte, la migración en las

superficies recubiertas de colágeno se incrementó tanto en el control y CTHRC1 células que

sobreexpresan. Estas observaciones sugieren que CTHRC1 es probablemente involucrados en la motilidad

celular, independientemente de la remodelación de ECM. Las principales diferencias entre los miofibroblastos

derivados de normal y de músculo distrófico de mdx ratones o pacientes con DMD incluyen una mayor tasa de

proliferación, una mayor producción de colágeno y otras proteínas ECM, y menos de algunos

metaloproteinasas de la matriz, en este último. 60 , 61 El distrófica miofibroblastos musculares generalmente

están expuestos a altos niveles de TGF-β, que se libera de miofibras necróticas y macrófagos

infiltrantes 17 , 20 ; se sugirió que estos miofibroblastos son constitutivamente activados debido a su exposición

constante al tejido lesionado. 60 Esto puede explicar las disparidades en la producción ECM 60 y síntesis

CTHRC1 ( Figura 9 A) entre mdx fibroblastos y C57 / BL, en respuesta a TGF -β. Tanto los fibroblastos

derivados de músculo normal, que, por tanto, no fueron expuestos a ninguna tejido lesionado ( Figura 8 ), y

los de fibroblastos de piel humana ( Figura 8 ) respondieron a TGF-β mediante la reducción de la síntesis de

CTHRC1. De acuerdo con los hallazgos de otros estudios de pacientes con DMD, 62 los miofibroblastos de

la mdx diafragma migrado a una tasa mayor que los del control ( Figura 9 B), que es la razón de los muchos

miofibroblastos en los músculos distróficos ( Figura 9 C). Halofuginona, que no afecta los niveles de CTHRC1

en fibroblastos normales, impide la reducción de TGF-β-dependiente en los niveles de CTHRC1 ( Figura 8 ),

redujo el número de miofibroblastos en los músculos distróficos ( Figura 2 ), y superó colágeno TGF-β-

dependiente síntesis de fibroblastos de piel humana, 52 todos los cuales eran compatibles con halofuginona de

modo canónico de acción. 23 , 43Está todavía por determinar si un aumento en CTHRC1 también se produce en

las miopatías participación de otros tipos de colágeno, como Ullrich distrofia muscular congénita, autosómico

dominante Distrofia muscular de cinturas, autosómica recesiva miopatía myosclerosis y miopatía de Bethlem

con mutaciones en el colágeno tipo VI. 63

En resumen, hemos demonstratedfor primera vez, a nuestro entender, los principales aumentos en los niveles

CTHRC1 en los músculos esqueléticos y cardíacos severamente dañadas de varios MDs en modelos

animales y en pacientes con DMD. El CTHRC1 encuentra en los músculos distróficos se asoció con altos

niveles de colágeno tipo I. El Ctrhrc1 que fue sintetizado por los miofibroblastos fue probablemente

relacionada con su capacidad para infiltrarse en el músculo distrófico y para iniciar la reacción

fibrótica. Halofuginona, que inhibe la fibrosis, la síntesis de colágeno tipo I, y el músculo de miofibroblastos

infiltración característica del músculo distrófico, también previno el aumento de la CTHRC1, a través de la

inhibición de la señalización de TGF-β.

AgradecimientosAgradecemos Edouard Belauso por su ayuda con la microscopía confocal y Tatiana Kisliouk por su ayuda con

la cuantitativa en tiempo real PCR. Este artículo es una contribución de la Organización de Investigación

Agrícola (Volcani Center, Bet Dagan, Israel).

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