EFECTO COOPERADOR DE E6E7HPV16 Y LA AUSENCIA DE RXRa …

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

EFECTO COOPERADOR DE E6E7HPV16 Y LA AUSENCIA DE RXRa EN LA

CARCINOGÉNESIS CERVICAL EN RATONES TRIPLE TRANSGÉNICOS

T E S I S

PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR

PRESENTA: Maestro en Ciencias

OCÁDIZ DELGADO RODOLFO BENJAMÍN

DIRECTORES DE TESIS

DR. PATRICIO GARIGLIO DR. DAVID GUILLERMO PEREZ-ISHIWARA

MÉXICO, D.F. 2012

Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012

ÍNDICE

ÍNDICE …………………………………………………………………………….. i

Dedicatoria ................................................................................ v

Agradecimientos …………………………………………………………………………….. vi

Lista de Figuras …………………………………………………………………..........… x

Lista de Tablas …………………………………………………………………………..… xi

Abreviaturas ………………………………………………………………………..…… xii

Resumen …………………………………………………………………………….. xiv

Abstract …………………………………………………………………………….. xv

1 INTRODUCCIÓN ……………………………........................................... 1

1.1 Funciones de las oncoproteínas E6 y E7 del HPV ….………………………….… 3

1.2 La oncoproteína E6 …………………………………..……….………………….……. 3

1.2.1 Inactivación y degradación de p53 a través

del complejo E6/E6AP ……………………..…………………………….….. 3

1.2.2 Inducción de hTERT mediada por E6 ……….……………………….….. 4

1.2.3 Las proteínas PDZ son degradadas por E6 ..…………………………… 5

1.3 La función de la oncoproteína E7 ………………………………………………….. 5

1.3.1 Inactivación de pRb ………………………………………………….. 5

1.3.2 Oncogenes, anti-oncogenes, marcadores tumorales

y Cáncer Cervicouterino ………………..………………………………... 6

1.4 Ratones transgénicos para los

oncogenes E6 y E7 del HPV16:

bK6-E6/E7 [E6E7 (tg/0)] ……..................………………………...… 10

1.5 Receptores a retinoides ..................................................... 11

1.6 Cáncer Cervical y Receptores a Retinoides ……………………………….……….. 15

1.6.1 Receptores a Retinoides y cáncer …………………………………….….. 17

1.7 Apoptosis y Cáncer ………………………………………..………… 20

i


2 ANTECEDENTES ………………………………………………….. 24

2.1 El modelo murino triple transgénico condicional para

RXRα / transgénico para E6/E7

[RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0); Tam-RTT] ……..……………………………… 24

3 JUSTIFICACIÓN …………………………..……………………… 27

4 HIPÓTESIS ……..…………………………………………... 28

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo General …………………………………………..……… 29

5.2 Objetivos Específicos …………………………………..……………… 29

6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ………………..……………….………….……. 30

7 MATERIALES Y MÉTODOS ………………………..………………………… 31

7.1 Generación de ratones RXRα condicionales

(RXRα L2/L2) tratados con Tamoxifén

[(Cvx L-/L-)], Ratones Triple Transgénicos

[RTT; RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)]

y Ratones Triple Transgénicos tratados

con Tamoxifén [Tam-RTT: RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)] ................. 31

7.2. Genotipificación de los alelos RXRα ………………………………..……………….. 32

7.3. Genotipificación de los alelos E6E7 ………………………………..................... 33

7.4. Muestras de tejido cervical ………………………………………………….. 34

7.5. Análisis histopatológico ………………………………………………….. 34

7.6. Inmunohistoquímica ………………………………………………….. 35

7.7. Determinación de los niveles de

apoptosis mediante TUNEL ………………………………………………….. 36

7.8. PCR in situ ..................................................... 37

7.9. RT-PCR in situ ..................................................... 38

7.10. Detección in situ de los productos de

amplificación ………………………………………………….. 40

7.11. Captura digital de imágenes, análisis y

cuantificación de la señal ………………………………………………….. 40 ii


7.12. Aislamiento y purificación de

RNA total ………………………………………………….. 41

7.13. Síntesis de cDNA para el análisis

cuantitativo por RT-PCR en Tiempo Real

(RTqPCR) ………………………………………………….. 41

7.14. Cuantificación relativa del mRNA

mediante RTqPCR ………………………………………………….. 41

8 RESULTADOS

8.1. Eliminación específica del receptor RXRα

en epitelio cervical de ratones triple transgénicos

RXRα (Cvx L-/L)/E6E7 (tg/0) tratados con

Tamoxifén (Tam-RTT) ………………………………………………….. 43

8.2. El transgén E6E7 en el cérvix de ratones

transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones

Tam-RTT ………………………………………………….. 46

8.3. Detección de la oncoproteína E6 del HPV-16 y

de la expresión de p16NK4A en tejido cervical

de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT ………………………………………… 46

8.4. Cambios histológicos en cérvix de ratones

transgénicos E6E7 (tg/0) y

RTT-Tam ………………………………………………….. 48

8.5. Incremento de los niveles de proliferación

celular e inhibición de la apoptosis en

ratones -RTT …………………………….……………………. 51

8.6. Determinación de los niveles de expresión

de los genes c-myc, Bax, Bcl-2 y p21WAF1

en ratones transgénicos E6E7

(tg/0) y RTT-Tam ………………………………………………….. 54

9 DISCUSIÓN ………………………………………………….. 56

iii


9.1. La deleción del receptor RXRα incrementa

los niveles de apoptosis en el cérvix de

ratones condicionales RXRα

(Cvx L-/L-) ……..……………………………………………. 57

9.2. La expresión de las oncoproteínas E6 y E7

del HPV-16 disminuyen los niveles de

apoptosis en cérvix de ratones transgénicos

E6E7 (tg/0) y RTT-Tam …………………………………................... 57

9.3. Los niveles de proliferación celular están

incrementados en el epitelio cervical de

los ratones triple transgénicos

RTT-Tam ……………………………………………………. 60

9.4. El biomarcador tumoral p16INK4A está

incrementado en ratones condicionales

RXRα (Cvx L-/L-) y

ratones RTT-Tam …..……………………………………………….. 60

9.5. Modificación de los niveles de expresión de

un grupo de genes asociados con

carcinogénesis cervical …….……………………………………………… 61

9.6 Posible mecanismo molecular de la

carcinogénesis cervical en ratones

triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)

/E6E7 (tg/0) ……………………………………………………. 63

9.7 Consideraciones finales ……………………………………………………. 66

10 CONCLUSIONES ………………….………………………………… 67

11 PERSPECTIVAS ………………….………………………………… 68

12 BIBLIOGRAFÍA ………………….………………………………… 69

13 PRODUCCIÓN RELACIONADA CON ESTE TRABAJO ……………………….79 iv


DEDICATORIA

El esfuerzo que representa este trabajo lo dedico con

humildad a quien todo lo debo:

DIOS

Él guía mis pasos.

A quienes han dado ánimo y motivo a mi vida:

Mi Esposa (Mi Gabox, Mi Esposita) y a

Mi Hija (Mi Melissa, Mi Princesa).

A mis Padres, a quienes debo la vida.

A las personas que han perdido la vida por causa del cáncer.

A las pacientes que padecen esta enfermedad y

que sin embargo no he podido todavía ayudar directamente.

Salmos

121:1 Alzaré mis ojos a los montes; ¿De dónde vendrá mi socorro? 121:2 Mi socorro viene de Jehová, Que hizo los cielos y la tierra.

124:8 Nuestro socorro está en el nombre de Jehová, Que hizo el cielo y la tierra.

v


Agradecimientos

Al Creador, A quien todo lo debo,

DIOS

Quien en su infinito Amor, nos permite aprender

tan sólo un poco de su Eterna Sabiduría

GRACIAS DIOS!, GRACIAS PADRE!

Cada día te bendeciré, Y alabaré tu nombre eternamente y

para siempre.

Salmos 145:2

vi


AGRADECIMIENTOS

A la QFB Gabriela González Rodríguez,

Mi Esposa,

Mi Pequitas

Con todo mi Amor, Cariño, Respeto, Admiración y Alegría

Gracias por tu infinita paciencia y sobretodo por Tu Amor,

Sin tu apoyo no hubiese llegado hasta este día

Siempre estaré agradecido por todo lo bueno que

has traído a mi vida

GRACIAS

TE AMO

Agradezco a la personita increíble y bella que me ha hecho

mejorar día con día:

Mi Hija: Melissa Ocádiz González

Gracias por tus sonrisas, gracias por tus miradas tiernas,

por Tu Amor

Tú eres una razón más para superarme

GRACIAS

TE AMO

Dios las Bendiga Siempre

vii


AGRADECIMIENTOS

A la Enfermera Blanca Delgado Díaz, Mi Madre, que aunque ya no está

conmigo, sé que está orgullosa y feliz. Gracias “Jechu”!!!!

Al Dr. Benjamín Ocádiz López, mi Padre, por sus enseñanzas y apoyo.

Gracias “Apá”!!!

Agradezco al Dr. Patricio Gariglio por sus constantes enseñanzas durante

más de 25 años realizando investigación en Oncología Molecular.

Agradezco al Dr. Guillermo Pérez Ishiwara por su apoyo, paciencia y

constantes consejos.

Agradezco especialmente a mis asesores: Dra. Consuelo Gómez García,

Dra. Laurence Marchat y Dra. Esther Ramírez Moreno.

Agradezco muy especialmente a la Dra. Luz Ma. Barajas por su constante

apoyo.

Agradezco al PiBioM-IPN, al CINVESTAV-IPN, al CONACyT, al ICGEB

(Trieste, Italia) y al IGBMC (Estrasburgo, Francia) por las facilidades y apoyo

para realizar este trabajo.

Al Dr. Guillermo Alfaro Martínez (1942-2008), por ser uno de mis mejores

maestros y amigos. Gracias Memo!!!.

Al Dr. Eduardo Castañeda Saucedo por su apoyo y amistad. Y obviamente

por haber obtenido los ratones triple transgénicos (tema principal de esta

Tesis!!, gracias Lalo!!).

viiviii


AGRADECIMIENTOS

A los Drs. Pierre Chambon y Daniel Metzger (IGBMC, Estrasburgo, Francia)

por diseñar los ratones condicionales RXRα.

Especialmente al Dr. Rogelio Hernádez-Pando (Depto. de Patología del

INCMNSZ, INNSZ) por su amistad y por toda la asesoría para el análisis

histológico de los tejidos.

Al Dr. Luis Covarrubias (IBT-UNAM) por los ratones transgénicos bK6-E6/E7.

A mis compañeros del CINVESTAV del Departamento de Genética y Biología

Molecular y del PiBioM-IPN.

Agradezco a mi gran amigo Wilox R. por la escritura, transcripción y revisión

de este trabajo. Feliz 33 Aniversario Ratón!!

En general, agradezco a todas y cada una de las personas que de algún modo contribuyeron a la realización de este trabajo.

ix


Lista de Figuras Figura 1. Inducción de la transformación celular por la infección persistente por el HPV. La Figura muestra el proceso de transformación celular desde la infección por el HPV a través de una lesión hasta el desarrollo de carcinoma invasor. Figura 2. Efecto de la expresión de los oncogenes E6 y E7 sobre procesos celulares. Figura 3. El producto del gen C-Myc actúa como regulador transcripcional de muchos genes que participan en el progreso del ciclo celular, apoptosis y transformación celular. Figura 4. La proteína p21WAF1 participa en diferentes eventos celulares como son la reparación y replicación del DNA en la fase S del ciclo celular y en la inhibición de la apoptosis. Figura 5. Expresión de p21WAF1 durante la carcinogénesis cervical. Figura 6. Características fenotípicas e histológicas de los ratones transgénicos bK6-E6/E7 [E6E7 (tg/0)]. Figura 7. Los retinoides y sus receptores (RXR, RAR) controlan diferentes eventos celulares. Figura 8. Regulación de la transcripción génica mediada por receptores nucleares. En el esquema se muestra la activación de receptores nucleares que funcionan como heterodímeros con RXR. Figura 9. La deficiencia de Vitamina A induce el desarrollo de metaplasia epidermoide. Figura 10. Alteraciones histológicas de tejido cervical de ratones condicionales después de la deleción selectiva del gen RXRα. Figura 11. La apoptosis puede ser inducida principalmente mediante dos vías de señalización celular: la vía extrínseca y la vía intrínseca. Figura 12. Participación de Bcl-2 y Bax en la vía intrínseca de la apoptosis. Figura 13. Los ratones Triple Transgénicos tratados con Tamoxifén presentan elevados niveles de proliferación celular (determinado mediante la detección del marcador PCNA). Figura 14. Imágenes representativas de ratones triple transgénicos sin tratar con Tamoxifén (RTT) y ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén (Tam-RTT) [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)]. Figure 15. Controles positivos (tratamiento con DNasa) y negativos (sin incubación con TdT) para el ensayo de TUNEL. Figura 16. Tipificación molecular de la recombinación de los alelos “floxed” para RXRα (L-) después del tratamiento con Tamoxifén (Tam) y de la presencia del transgén E6E7 en cepas de ratones incluidas en este trabajo. Figura 17. Deleción tejido específica del gen RXRα y expresión eficiente de los oncogenes E6 y E7 en cérvix de ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén (Tam-RTT) mediante PCR in situ (Panel PCR) y RT-PCR in situ (RT-PCR). Figura 18. Detección de las proteínas E6 y p16INK4A. Los niveles de expresión de estas proteínas están incrementados en el cérvix de ratones Tam-RTT. Figura 19. Alteraciones histológicas y de proliferación celular en tejido cervical después de la deleción del gen RXRα y la expresión de las oncoproteínas virales E6 y E7. Figura 20. Incremento de los niveles de proliferación celular en ratones Tam-RTT. Se determinó el efecto de la deleción de RXRα y la presencia de E6 y E7 sobre los niveles de proliferación en los tejidos cervicales de las diferentes cepas de ratón. Figura 21. Los niveles de apoptosis en el cérvix de ratones mutantes RXRα se reducen importantemente debido a la expresión de las oncoproteínas E6 y E7.

x


Figura 22. Expresión relativa (RTqPCR) de genes involucrados en los procesos de proliferación celular y apoptosis en cérvix murino. Figura 23. Modelo teórico que describe la posible cooperación entre la expresión de los oncogenes E6 y E7 del HPV y la deleción del receptor RXRα, alterando el control del crecimiento celular, la proliferación celular y la apoptosis en el cérvix de Ratones Triple Transgénicos. Figura 24. Modelo simplificado de la participación de los oncogenes E6 y E7 del HPV y la deleción del receptor RXRα en la carcinogénesis cervical en Ratones Triple Transgénicos.

Lista de Tablas

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos y condiciones de

amplificación utilizados en los ensayos de RT-PCR

in situ y RT-PCR cuantitativa en tiempo real ………………………………. 39

Tabla 2. Análisis histológico de tejido cervical …………………………...... 50

xi


Abreviaturas

AR Receptores a Andrógenos

atRA “all trans Retinoic Acid”

bK6 Promotor bovino de citoqueratina 6

CaCu Cáncer Cervicouterino

CIN Neoplasia Intraepitelial Cervical

DBD Dominio de Unión al DNA

DNA Ácido deoxirribonucleico

ER Receptores a Estrógenos

GR Receptores a Glucocorticoides

HPV Virus del Papiloma Humano; Papilomavirus Humano

HR-HPV Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo

HREs Elementos de Respuesta a Hormonas

IFNs Interferones

Kb Kilobases

LBD Dominio de Unión al Ligando

MHC Complejo Principal de Histocompatibilidad

mRNA Ácido ribonucleico mensajero

NRs Receptores Nucleares

pb Pares de bases

PCNA Antígeno Nuclear de Proliferación Celular

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

PPARs Receptores activados por compuestos inductores de la

proliferación de peroxisomas

PRs Receptores a Progestinas

RA Ácido Retinoico

RAR Receptor(es) para el Ácido Retinoico

RAREs Elementos de Respuesta en el DNA

REs Elementos de Respuesta

RT-PCR Retrotranscripción-Reacción en Cadena de la Polimerasa

RAR Receptores para el Ácido Retinoico xii


RXR Receptor(es) X a Retinoides

Tam Tamoxifén

TRs Receptores a Hormonas Tiroideas

VDR Receptor para la Vitamina D

WHO Organización Mundial de la Salud

xiii


Resumen

El Cáncer de cérvix es la segunda causa de las muertes por cáncer en las

mujeres a nivel mundial. Los papilomavirus de alto riesgo (HR-HPVs) juegan un

importante papel etiológico en el desarrollo del carcinoma del cuello uterino. Sin

embargo, existen factores importantes como es el estatus inmunológico del

huésped, que pueden determinar el desenlace de una infección genital con HR-

HPV. Normalmente, la infección es controlada y eliminada en la mayoría de las

lesiones precancerosas, sin progresar a carcinomas invasores. Los retinoides,

que llevan a cabo su acción a través de sus receptores (RARs, RXRs), juegan

un papel crucial en el desarrollo del cérvix así como en la homeostasis del

epitelio, regulando el crecimiento y la diferenciación de una amplia variedad de

tipos celulares; de hecho, estos receptores pueden inhibir la proliferación

celular así como también inducir la diferenciación celular o la muerte celular

programada (apoptosis). En este trabajo estudiamos un modelo murino que

desarrolla en forma espontánea lesiones cervicales malignas, las

características histopatológicas y la expresión de diversas moléculas del

huésped relacionadas con el proceso oncogénico. Este modelo presentó

características similares a lo reportado para los tumores obtenidos de muestras

clínicas como son: altos niveles de proliferación celular, bajos niveles de

apoptosis y cambios en los niveles de genes relacionados con estos procesos,

lo que condujo al desarrollo de carcinoma in situ y carcinoma invasor. Los

resultados obtenidos nos permiten sugerir que existe un efecto cooperador

entre la expresión de los oncogenes E6E7 del HPV16 y la ausencia del

receptor RXRα en el desarrollo de cáncer cervicouterino. Este modelo puede

ser útil no solo para el estudio de la carcinogénesis en el cuello uterino en

etapas múltiples sino para la evaluación de diversas estrategias

quimioterapéuticas para el tratamiento de esta neoplasia.

Palabras clave: E6E7; HPV; Receptor a Retinoides; Cáncer Cervicouterino;

Modelos murinos

xiv


Abstract

Cervical cancer is the second leading cause of cancer deaths among women

worldwide. High-Risk-Human Papillomaviruses (HR-HPVs) play an important

etiologic role in the development of carcinoma of the uterine cervix. However,

host factors, mainly host immunological status, are important in determining

the outcome of genital HPV infection as most cervical precancerous lesions

containing HR-HPVs normally do not progress to invasive carcinomas. Retinoids,

acting through nuclear receptors (RARs, RXRs), play a crucial role in cervix

development and in homeostasis regulating growth and differentiation of a wide

variety of cell types; indeed, they can inhibit cell proliferation, and induce cell

differentiation or apoptotic cell death. Here we studied a mouse model that

develops spontaneously malignant cervical lesions, histopathological features

and the expression of selected molecules related with the oncogenic process.

This model showed similar characteristics to those reported for tumor clinical

samples: high cell proliferation levels, low apoptosis levels and changes in the

expression of genes related to both processes. These alterations induced the

development of in situ carcinoma and invasive carcinoma. These results

strongly suggest a cooperative effect between HPV16E6E7 expression and the

lack of RXRα in cervical cancer development. This model could be useful not

only to study multistep carcinogenesis of uterine cervix tissue and might

improve chemopreventive and chemotherapeutic strategies for this neoplasia,

but for the evaluation of several therapeutic strategies.

Keywords: E6E7; HPV; Retinoid receptor; Cervical Cancer; Murine models

xv


1 INTRODUCCIÓN

Los Virus del Papiloma Humano (HPVs por sus siglas en inglés: “Human

Papillomaviruses”) son pequeños virus de DNA que se encuentran estrechamente

asociados con el desarrollo de cánceres específicos [zur Hausen, 2006; zur Hausen, 2009;

Acevedo-Rocha et al., 2012] (Figura 1). Los HPVs de alto riesgo (siendo los más

frecuentes los tipos 16 y 18) se encuentran en más del 90% de los cánceres invasores

del cérvix, una de las enfermedades más comunes en la mujer. Los papilomavirus de alto

riesgo codifican dos oncoproteínas, E6 y E7, las cuales inactivan la función de las

proteínas supresoras de tumor p53 y retinoblastoma, respectivamente [Scheffner et al.,

1994] y se ha demostrado que inmortalizan células en cultivo. Sin embargo, en el epitelio

escamoso del cérvix humano, la mayoría de las lesiones que contienen HPVs de alto

riesgo no progresan hacia carcinomas in situ o invasores, implicando cofactores ya sea

ambientales (dieta baja en ácido retinoico [RA; del inglés “Retinoic Acid”], ingesta crónica

de estrógeno, alteración de los mecanismos epigenéticos de la regulación de la

expresión) o genéticos (oncogenes celulares o mutaciones en genes supresores de

tumor, mutaciones en receptores al ácido retinoico [RAR; del inglés “Retinoic Acid

Receptor”] o receptores a retinoides X [RXR; del inglés “Retinoid Receptor X”]) en

aquellos casos en donde ocurre una progresión maligna. [Castellsagué y Muñoz, 2003;

Muñoz et al., 2006; Gariglio et al., 2009; Huh, 2009; zur Hausen, 2009].

Entre los cofactores que han sido repetidamente asociados con neoplasias en las

que participa el HPV, tenemos el tabaquismo y la exposición a estrógeno

(www.cancer.gov; http://cancernet.uci.nih.gov/trialsrch.shtml). Parece ser que durante el

embarazo se crea un ambiente permisivo para una infección permanente con HPV;

también ha sido demostrado que el uso prolongado de anticonceptivos orales, la mayoría

de los cuales contienen estrógenos, duplica el riesgo de desarrollar una neoplasia

asociada al HPV (Figura 1). Por otro lado, hay varios reportes de ratones transgénicos

para los oncogenes E6 y E7 en los que se ha inducido la neoplasia [Song et al., 2000;

Eckert et al., 2000; Wolf, et al., 2003; Shai et al., 2010; Valencia et al., 2008; Jabbar et

al., 2009]. En uno de estos modelos se demostró que la exposición crónica a estrógeno

puede inducir carcinogénesis escamosa de cérvix y vagina, mientras que cuando se


2

Figu

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201

2].


3

emplearon concentraciones bajas de estrógeno en este sistema modelo, sólo se observó

carcinogénesis de células escamosas en la zona de transformación [Elson et al., 2000].

De gran interés ha sido la observación de que el tratamiento con RA de

queratinocitos humanos inmortalizados, reduce la transformación celular y los niveles de

mRNA y de proteína de los oncogenes E6 y E7 de HPV16 [Creek et al., 1994]. De

manera similar, células CaSki tratadas con ácido retinoico “all-trans” (atRA) presentaron

un nivel bajo de transcripción para E6 y E7, comparado con el control sin tratar. Aún más

importante, se reportó la ausencia de respuesta al RA en células cervicales inmortalizadas

después de que estas se volvieron tumorigénicas [Sarma et al., 1996].

1.1 Funciones de las oncoproteínas E6 y E7 del HPV

Las proteínas E6 y E7 son esenciales para inducir y mantener la transformación

celular debido a su capacidad de interferir con el control del ciclo celular y de la

apoptosis. Asimismo, la inestabilidad genómica tiene un papel central para la

transformación maligna, de hecho, se ha demostrado in vitro que las oncoproteínas E6 y

E7 pueden inducir rápidamente poliploidía poco después de haber sido introducidas en las

células [Narisawa-Saito et al., 2007]. Esto parece ser debido a la desregulación de Plk1

durante la pérdida de p53 mediada por E6 y el secuestro y destrucción de miembros de la

familia de pRb mediada por E7 [Incassati et al., 2006]. Incluso, la pérdida severa de los

miembros de la familia de pRb puede inducir amplificación del centrosoma y aneuploidía

(18 de narisawa). Además, como ya se ha mencionado anteriormente, E6 y E7 pueden

causar la desregulación tanto de genes celulares que controlan la fase de transición G2/M

del ciclo celular permitiendo la progresión a mitosis, como de genes con controlan la

homeostasis del centrosoma [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007] (Figura 2).

1.2 La oncoproteína E6

1.2.1 Inactivación y degradación de p53 a través del complejo E6/E6AP

Es bien conocida la capacidad que tiene la proteína E6 para promover la

degradación de p53 a través de su interacción con una proteína celular denominada

E6AP, la cual es una ubiquitina ligasa [zur Hausen, 2006]. El gen supresor de tumores

p53 tiene la capacidad de regular el ciclo celular y la apoptosis en caso de existir daño al

DNA. Cuando este daño es moderado, se produce un arresto prolongado del ciclo celular


4

dependiente de p53 permitiendo la reparación del DNA, sin embargo, si el daño es

severo, se induce la apoptosis. En el caso de las células infectadas con HPV, la muerte

celular es inhibida por la inactivación de p53 mediada por E6. Además, E6 interfiere con

otras proteínas pro-apoptóticas como Bak, FADD y procaspasa 8 [Lagunas et al., 2010]

[Ganguly y Parihar, 2009] (Figura 2).

1.2.2 Inducción de hTERT mediada por E6

En la última década se han descrito diversas proteínas propuestas como blanco de

E6, las cuales podrían contribuir a la transformación celular [Ganguly y Parihar, 2009],

siendo la telomerasa un importante ejemplo. La telomerasa humana es un complejo

ribonucleoproteico compuesto por la transcriptasa catalítica reversa (hTERT; por sus

siglas en inglés: “human Telomerase Reverse Transcriptase”) y un componente de RNA

(hTR). hTERT es expresada normalmente en células germinales linaje-específico, células

madre precursoras en tejidos en reparación y en células cancerosas. La expresión de

Figura 2. Efecto de la expresión de los oncogenes E6 y E7 sobre procesos celulares [Modificado de Narisawa-Saito y Kiyono, 2007].


5

hTERT en células normales reconstituye la actividad de la telomerasa y suprime la

senescencia o envejecimiento [Narisawa et al., 2007]. Debido a que la actividad de la

telomerasa es mínima en la mayoría de los tejidos, los telómeros se acortan en cada

división celular, conduciendo eventualmente a la senescencia, debido a una síntesis

incompleta de la cadena de DNA. Se ha observado una alta actividad de la telomerasa en

más del 85% de células humanas cancerosas, indicando un papel clave de esta enzima

en la tumorigénesis [Pendido et al., 2006]. E6 tiene la capacidad de inducir la actividad

de la telomerasa y por lo tanto contribuir a la inmortalización de células epitelales

mediante el mantenimiento del largo de la longitud del telómero. Se ha demostrado

tambíén, que la interacción entre E6 y el oncogene Myc permite la activación del

promotor de hTERT [Veldman et al., 2003]. En forma adicional, se ha confirmado que

E6/E6AP degrada a NFX1-91, el cual es represor celular del promotor de hTERT

resultando en el incremento de su expresión [Gewin et al., 2004] (Figura 2).

1.2.3 Las proteínas PDZ son degradadas por E6

Se ha demostrado que la oncoproteína E6, mediante su motivo C-terminal, tiene la

capacidad de interactuar con proteínas que contienen el dominio denominado PDZ,

conduciendo a su degradación [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007] (Figura 2). Esta

capacidad, la cual es distinta a la mostrada para la degradación de p53, es importante

para la transformación celular debido a que las proteínas PDZ están involucradas en

diversas funciones tales como señalización y adhesión celular.

1.3 La función de la oncoproteína E7

1.3.1 Inactivación de pRb

E7 es una pequeña fosfoproteína separada en tres regiones conservadas

denominadas CR1, CR2 y CR3 [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007]. E7 tiene la capacidad de

unirse al producto del gene supresor de tumores de retinoblastoma (pRb) así como a los

miembros de la familia p107 y p130. En el estado hipofosforilado, las proteínas de la

familia pRb pueden unirse a factores de transcripción como los de la familia E2F y así

reprimir la transcripción de genes involucrados en la síntesis de DNA y progresión del

ciclo celular [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007]. La fosforilación de pRb realizada por

cinasas dependientes de ciclina G1, permite la liberación de E2F conduciendo a la


6

progresión del ciclo celular hacia la fase S. Debido a que E7 se une a pRb no fosforilado,

puede inducir a las células a entrar a la fase S evitando la formación de complejos pRb-

E2F [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007] (Figura 2). Recientemente se ha demostrado que E7

promueve la degradación proteosomal de pRb [Narisawa et al., 2007]. La inactivación de

pRb mediada por E7 puede inducir la expresión de un inhibidor de cinasas dependientes

de ciclina p16INK4A [Samarawardana et al., 2010]. Normalmente, la sobre-expresión de

p16INK4A resulta en el arresto del ciclo celular sin embargo, la expresión de E7 evita esta

función. Con base en esto, la sobre-expresión de p16INK4A se utiliza como un bio-

marcador útil para evaluar la actividad patogénica del HPV en lesiones cervicales

[Narisawa-Saito y Kiyono, 2007; Ganguly y Parihar, 2009; Samarawardana et al., 2010]

(Figura 2).

La proteína E7 también puede inactivar a otros miembros de la familia pRb. Por

ejemplo, E7 se asocia a desacetilasas de histonas (co-represores transcripcionales;

HDAC) permitiendo el crecimiento celular [Narisawa et al., 2007]. Asimismo, E7 tiene la

capacidad de interaccionar con p48 e IRF1 permitiendo la evasión de la respuesta inmune

[Ganguly y Parihar, 2009] (Figura 2). En resumen, la proteína E7 permite la replicación

del HPV en las capas superiores del epitelio en donde las células hijas normalmente

tendrían que diferenciarse y salir completamente del ciclo celular.

En conclusión, las oncoproteínas E6 y E7 del HPV son factores esenciales para la

inmortalización celular, transformación y carcinogénesis inducida por HPV (Figura 2)

[Ganguly y Parihar, 2009; Narisawa-Saito y Kiyono, 2007].

1.3.2 Oncogenes, anti-oncogenes, marcadores tumorales y Cáncer

Cervicouterino

A nivel molecular, se ha descrito la activación de oncogenes y/o la inhibición de la

función de genes supresores tanto en líneas celulares derivadas de Cáncer Cervicouterino

(CaCu) como en muestras de tumores obtenidos de pacientes con esta enfermedad

[Brychtová et al., 2004; Incassati et al., 2006; Gariglio et al., 2009]. Por ejemplo, las

alteraciones del oncogén C-Myc en muestras de CaCu fue descrita por primera vez en el

mundo en 1987 en donde se analizaron muestras de pacientes mexicanas [Ocadiz et al.,

1987]. El producto de este gen actúa como regulador transcripcional de muchos genes

que participan en el progreso del ciclo celular, apoptosis y transformación celular. Aunque


7

se ha reportado que los cambios en la expresión del producto de C-Myc son significativos

cuando se comparan lesiones displásicas de alto grado con lesiones de bajo grado, se ha

observado que los cambios en su expresión génica no son significativos cuando se

comparan muestras de tejido tumoral cervical con tejido normal, sin embargo, se ha visto

que su expresión es mayor en carcinomas cervicales escamosos en comparación con

adenocarcinomas [Ocadiz et al., 1987; Brychtová, 2004] (Figura 3).

Por otro lado, se ha identificado un marcador tumoral el cual funciona normalmente

como un antioncogén: p21 (WAF1 o CDKN1) [Gartel y Tyner, 2002]. Esta proteína inhibe

la actividad de las cinasas 2 y 4, regulando negativamente el ciclo celular en la fase G1;

TP53 regula fuertemente la expresión de este gen. La proteína p21WAF1 puede

interactuar con el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), un factor accesorio de

la DNA polimerasa, induciendo así la reparación y replicación del DNA en la fase S del

Figura 3. El producto del gen C-Myc actúa como regulador transcripcional de muchos genes que participan en el progreso del ciclo celular, apoptosis y transformación celular.


8

ciclo celular. Esta proteína también interviene en la inhibición de la apoptosis (Figura 4).

Hace algunos años se sugirió a p21WAF1 como marcador pronóstico, ya que su expresión

era suprimida en adenocarcinomas cervicales en comparación con tejido glandular

cervical normal. Posteriormente, se observó de forma similar una tendencia en la

reducción de la expresión de p21WAF1 de epitelio normal hacia cáncer invasor.

Figura 4. La proteína p21WAF1 participa en diferentes eventos celulares como son la reparación y replicación del DNA en la fase S del ciclo celular y en la inhibición de la apoptosis.


9

Estos datos apoyan la idea de emplear a p21WAF1 como marcador tumoral de

pronóstico (Figura 5). En estudios de análisis global se ha reportado la expresión de este

gen a través de varias estrategias. En una de ellas, ya descrita para el gen p16INK4a y

BIRC5, se estudió el efecto de los genes E6 y E7 del HPV16 mediante la infección de

queratinocitos cervicales con un retrovirus. Cuando se infectaron éstos se encontró un

cambio significativo de 0.47 (valor de corte menor y mayor a 1.0, p<0.01) en la

expresión de p21WAF1. En otro análisis se identificó similarmente la supresión de la

expresión de p21WAF1 (-4.0 de un valor de corte de ±2.0) mediante la expresión de las

oncoproteínas E6 y E7 del HPV16 en cultivos primarios de queratinocitos infectados con

un retrovirus [Gartel y Tyner, 2002].

Figura 5. Expresión de p21WAF1 durante la carcinogénesis cervical.


10

1.4 Ratones transgénicos para los oncogenes E6 y E7 del HPV16: bK6-E6/E7

[E6E7 (tg/0)]

A finales de la década pasada, el grupo del Dr. Patricio Gariglio

(Departamento de Genética y Biología Molecular, CINVESTAV- IPN) en colaboración con

el grupo del Dr. Luis Covarrubias (Departamento de Genética y Fisiología Molecular, IBT-

UNAM), diseñaron un modelo murino en el cual la expresión de los oncogenes E6 y E7 del

HPV se encuentra bajo el control del promotor de la citoqueratina 6 de bovino (bK6 por

sus siglas en Inglés), esto lo lograron insertando la región completa del marco de lectura

abierta de los oncogenes E6/E7 del HPV16 en un vector que contenía el promotor bK6.

Recientemente, estos investigadores describieron anomalías en el ciclo del desarrollo del

pelo de estos ratones provocadas por la expresión de los genes E6/E7 [Escalante-Alcalde

et al., 2000]. De hecho, una de las características principales de estos ratones es la de

poseer un pelaje con una densidad baja así como también tienen la característica de

regenerarlo más rápidamente que los ratones silvestres. Esta regeneración se identificó

en los folículos pilosos los cuales muestran una fase de crecimiento más larga (anagena),

así como una regresión del bulbo (catagena) mientras que no se observó una fase de

arresto (telogena) [Escalante-Alcalde et al., 2000]. Estos ratones muestran una

capacidad de regeneración epitelial aumentada después de haber recibido una herida

[Valencia et al., 2008]. Por otro lado, estudios previos han demostrado que los ratones

hembra en cérvix expresan diferentes niveles de E6/E7 de acuerdo al ciclo estral,

detectándose los niveles más altos de expresión durante las fases proestro-estro [Ocádiz-

Delgado et al., comunicación personal]. Además, estos ratones muestran alteraciones

histopatológicas en el epitelio de la lengua como son: binucleación, núcleos irregulares,

hipercromatismo, alta frecuencia de halos perinucleares e infiltrados inflamatorios, todas

estas características coinciden con condiciones preneoplásicas [Ocádiz-Delgado et al.,

2009] (Figura 6).

A pesar de que este modelo fue desarrollado con el propósito de estudiar el

efecto de la expresión de los oncogenes virales E6 y E7 en células suprabasales del cérvix

murino, a la fecha no existe ningún reporte al respecto. Algunos estudios preliminares

sugieren que algunos de estos ratones presentan a nivel cervical, en forma espontánea,

principalmente displasia moderada y en pocos casos displasia severa [Ocádiz-Delgado,

comunicación persona] (Figura 6).


11

1.5 Receptores a retinoides

La Vitamina A (all-trans retinol) así como sus metabolitos activos, colectivamente

son llamados retinoides, regulan muchos eventos celulares durante el desarrollo de los

vertebrados y controlan aspectos importantes de la célula como la proliferación, la

diferenciación y la apoptosis [Tang y Gudas, 2011; Bastien y Rochette-Egly, 2004;

Gariglio et al., 2009] (Figura 7). Los receptores para el ácido retinoico (isoformas

múltiples: RARα, RARβ, RARγ) y los receptores X para retinoides (isoformas RXRα, RXRβ

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Figura 6. Características fenotípicas e histológicas de los ratones transgénicos bK6-E6/E7 [E6E7 (tg/0)]. (A) Los ratones E6E7 (tg/0) presentan alopecia severa; (B) capacidad de regeneración incrementada; (C) en forma espontánea presentan hiperplasia folicular en lengua y (D) displasia moderada a severa en cérvix. Las flechas indican la señal positiva para el marcador de proliferación PCNA. Como se observa, existe proliferación celular prácticamente en todos los estratos del epitelio cervical (Escalante-Alcalde et al., 2000; Valencia et al., 2008; Ocadiz-Delgado, Comunicación Personal, 2008; Ocadiz-Delgado et al., 2009). Wt: RatónSilvestre; Tg: Ratón Transgénico; hp: halo perinuclear; hf: hiperplasia folicular; ii: infiltrado inflamatorio; bn: binucleación; MB. Membrana Basal.


12

y RXRγ), constituyen dos tipos de factores de transcripción, los cuales intervienen en la

mayoría de las acciones del ácido retinoico biológicamente activo all-trans (RA) y sus

metabolitos específicos [Gudas, 2011]. La diferenciación inducida por los Retinoides es

una respuesta celular crucial para la protección contra el desarrollo de cáncer. Sin

embargo, la investigación de este proceso ha estado limitada a ensayos en células en

cultivo [Abu et al., 2005; Germain et al., 2006; Mongan et al., 2007; Soprano et al.,

2007] o a algunos modelos murinos que han permitido la manipulación condicional de la

deleción del receptor a retinoides RXRα en queratinocitos epidérmicos de ratones adultos

[Indra et al., 1999; Metzger et al., 2003].

Los RAR y RXR forman heterodímeros estables requeridos para la unión de alta

afinidad con elementos de respuesta en el DNA (RAREs; del inglés; “Retinoic Acid

Response Element”). Después de su unión al DNA, los heterodímeros RAR-RXR regulan la

expresión genética de genes blanco para el RA de una manera dependiente de ligando

[Chambon, 1996; Kastner et al., 1997]. Los RXR son también capaces de formar

homodímeros y heterodímeros con otros miembros de la superfamilia, como TRs, VDR y

PPARs [MacDonald et al., 2001]. En tejidos epiteliales RXRα es el más abundante y actúa

como un factor auxiliar en la unión a RAREs (Figura 7), permitiendo la intercomunicación

Figura 7. Los retinoides y sus receptores (RXR, RAR) controlan diferentes eventos celulares (modificado de: Altucci y Gronemeyer, 2001)


13

y la intermodulación por RA, de múltiples vías de señalización. Adicionalmente, la

expresión de RXRα puede ser regulada por otros miembros de la familia de recptores

nucleares (NRs; del inglés: “Nuclear Receptors”), tal como el Receptor a Estrógeno (ER;

del inglés: “Estrogen Receptor”) activado por estrógeno (E2). Los retinoides y las

hormonas esteroideas (como E2) son reguladores poderosos de la diferenciación y

función epitelial normal del tracto reproductivo murino. E2 induce la expresión de RXRα

(dentro de los primeros 30 min de tratamiento) y expresión de RARγ (a las 4h) en el

epitelio cervical del ratón [Celli et al., 1996].

Utilizando un modelo murino condicional [RXRα (Cvx L-/L-)], se demostró que la

deleción epitelio específica temporalmente controlada de los alelos RXRα resulta en

anormalidades severas en la piel incluyendo alopecia, hiperproliferación, procesos

inflamatorios y diferenciación terminal aberrante [Li et al., 2000; Indra et al., 2007].

Además, en este mismo modelo, se ha demostrado que la eliminación del receptor RXRα

en células epiteliales de ratones adultos, resulta en el incremento simultáneo de los

niveles de proliferación celular y de apoptosis, acompañado de la alteración en los niveles

de expresión de genes involucrados en ambos procesos [Ocádiz-Delgado et al., 2008].

En conclusión, los retinoides transducen señales importantes en cérvix, piel y otros

tejidos epiteliales. El modelo actual de la acción de los retinoides concibe una acción dual

para los heterodímeros RXR-RAR: actúan como represores en ausencia de ligando y como

activadores en su presencia (Figura 8). En la ausencia de ligando, los heterodímeros se

unen a la región regulatoria de genes blanco y se asocian a un complejo represor que

incluye a la histona desacetilasa. Esta desacetilación resulta en la condensación de la

cromatina y la represión de la transcripción (Figura 8a). Después de la unión del ligando,

los receptores liberan los corepresores y reclutan un complejo coactivador el cual

contiene componentes que catalizan modificaciones de las histonas originando la pérdida

de la estructura de la cromatina (Figura 8b). Subsecuentemente, un complejo coactivador

diferente, denominado mediador, establece una unión entre los receptores y la

maquinaria general de transcripción reclutando a la polimerasa II e iniciando la


14

transcripción (Torchia et al., 1998; Altucci, 2007; Noy N, 2010). En tejido cervical, los

RXR y en particular RXRα podrían jugar un papel muy importante en la regulación de

genes implicados en proliferación y en apoptosis, es decir en el control de procesos

neoplásicos.

Figura 8. Regulación de la transcripción génica mediada por receptores nucleares. En el esquema se muestra la activación de receptores nucleares que funcionan como heterodímeros con RXR [Altucci, 2007; Noy N, 2010].


15

1.6 Cáncer Cervical y Receptores a Retinoides

Numerosas observaciones tanto epidemiológicas como experimentales han indicado

que los retinoides tienen un efecto protector del cáncer. Por ejemplo, se ha encontrado

una asociación inversa significativa entre la concentración de retinol (vitamina A) en el

suero y neoplasia intraepitelial cervical (NIC) [French et al., 2000]. Por otro lado, la

ausencia de retinoides en la dieta de ratones induce lesiones premalignas equivalentes a

NICs, sin embargo, se ha descrito que mujeres con deficiencia en Vitamina A induce el

desarrollo de metaplasia epidermoide [Ponnamperuma et al., 1999] (Figura 9). En parte

debido a estas observaciones, el RA está considerado actualmente como uno de los

compuestos más prometedores en quimioterapia y quimioprevención del cáncer.

Se ha demostrado que los RAR son expresados en todos los epitelios cervicales

normales, mientras que todas las lesiones NIC, incluyendo NIC I, NIC II y NIC III,

exhiben un claro decremento en la expresión de RARα, RARβ y RARγ [Xu et al., 1999].

Además, se ha reportado que RARβ es un gen supresor de tumor [Sun et al., 2000], el

cual se encuentra regulado negativamente en células de carcinoma cervical y que es

capaz de inhibir el crecimiento in vitro de células derivadas de CaCu [Geisen et al., 2000].

Dado que el ácido retinoico es uno de los compuestos más prometedores en

quimioprevención y quimioterapia del cáncer, muchos laboratorios han intentado

encontrar los mecanismos por los cuales actúa [Dong et al., 1995]. Se ha propuesto para

la actividad antitumoral de los heterodímeros RXR-RAR, activados por retinoides, el

bloqueo de la función de AP1 o la activación de RAREs en algunos genes blanco. La

expresión regulada del factor transcripcional AP1 juega un importante papel en la

progresión preneoplásica-neoplásica en modelos de cultivo celular [Dong et al., 1995].

Las NICs han sido definidas como lesiones precursoras del cáncer cervical invasor

y constituyen un sistema modelo humano para estudiar el desarrollo de lesiones

premalignas ya que exhiben varias anormalidades histológicas graduales. Varios reportes

clínicos sugieren que los retinoides son agentes quimiopreventivos efectivos para NICs

[Meyskens et al., 1995]. También parecen ser efectivos en el tratamiento del cáncer

cervical invasor, en particular cuando los retinoides se asocian con interferones (IFNs)

[Lotan et al., 1995]. Observaciones posteriores han demostrado que la combinación de

retinoides e IFNs resulta en un efecto sinérgico que induce la apoptosis en líneas

celulares derivadas de carcinoma [Giandomenico et al., 1997]. Respecto a los


16

mecanismos de este efecto terapéutico cooperador se ha observado que el RA puede

incrementar los niveles de factores de transcripción requeridos en la activación de genes

inducida por IFNs [Percario et al., 1999]; entre estos genes podemos citar a los que

intervienen en adhesión celular [Matarrese et al., 1998] y los que codifican para

Moléculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC; del inglés “Major

Histocompatibility Complex”) [Santin et al., 1998].

Figura 9. La deficiencia de Vitamina A induce el desarrollo de metaplasia epidermoide (Ponnamperuma et al., 1999).


17

1.6.1 Receptores a Retinoides y cáncer

El epitelio cervical contiene dos fenotipos, estratificado escamoso y columnar simple,

los cuales se juntan en la unión escamocolumnar o zona de transformación. Estas

regiones en donde un tipo de epitelio reemplaza a otro (metaplasia) tienen predilección

por el desarrollo de cáncer; en particular, los cánceres cervicales asociados a infecciones

con HPV se desarrollan primariamente en la zona de transformación (una región donde

se pueden detectar células escamosas metaplásicas en el epitelio columnar de las

glándulas endocervicales). Es justamente en la zona de transformación donde la

exposición a estrógeno induce la carcinogénesis cervical escamosa [Elson et al., 2000].

Algo muy interesante es que el epitelio columnar simple sufre metaplasia escamosa

(condición premaligna) en respuesta a la deficiencia en vitamina A. Es importante señalar

que los transcritos de RXR (α y β) y de RARγ se expresan en el epitelio escamoso

estratificado del cérvix [Darwiche et al., 1994]. También, el epitelio columnar simple, el

cual responde notablemente a la concentración de vitamina A, expresa altos niveles de

transcritos de RARα, RARβ y RXR (α y β). Sólo los transcritos RARβ y RXR (α y β) fueron

regulados negativamente por la condición de deficiencia en vitamina A y se expresaron

menos en los foci metaplásicos escamosos que en el epitelio columnar simple [Darwiche

et al., 1994]. El hecho de que los RXRs están localizados principalmente en células

basales y columnares del cérvix sugiere que ejecutan funciones específicas, tanto en la

diferenciación epitelial del cérvix [Darwiche et al., 1994] como en la prevención del

cáncer cervical.

Ya que éstos y otros resultados experimentales sugieren que los receptores a

retinoides están asociados a transformación celular y a la formación de tumores, es

importante estudiar el efecto fenotípico causado por la inactivación específica de los

receptores a retinoides en piel y en tejido cervical y determinar la contribución de estas

mutaciones en el desarrollo del cáncer. RARα, RARγ y RXRα son los receptores a

retinoides más frecuentemente expresados en la epidermis del ratón, tanto durante la

embriogénesis, como en el adulto; sin embargo ratones “knockout” (nulos) para RARα o

RARγ son completamente normales con respecto a la estructura de la piel, tal vez debido

a una redundancia funcional entre estos receptores [Kastner et al., 1997]. Apoyando la

observación anterior se encontró que los doble mutantes RARα-/-/RARγ-/- mueren en una

etapa temprana del desarrollo [Mascrez et al., 1998]. Más aún, un ratón nulo para RXRα,


18

el principal isotipo RXR en piel, es letal en útero antes de la formación de la piel [Mascrez

et al., 1998]. Este problema fue recientemente resuelto con el desarrollo de una técnica

eficiente para crear mutaciones somáticas en ratones adultos, controladas espacio-

temporalmente por Tamoxifén (Tam), el cual actúa como inductor de la Cre-ERT2

recombinasa, enzima de fusión que contiene una mutación en el dominio del receptor

para estrógeno por el cual normalmente este receptor se une a la hormona [Metzger y

Chambon, 2007; Vasioukhin et al., 1999]. En este sistema modelo ha sido posible abatir

RXRα en forma selectiva en queratinocitos del ratón adulto y demostrar que este receptor

participa en la homeostasis de la piel y en el ciclo de crecimiento del pelo, probablemente

a través de heterodímeros RXR/VDR [Li et al., 2000]. Recientemente, nuestro grupo ha

descrito que, a nivel cervical, los ratones mutantes para el gen RXRα mostraron una

alteración importante en la homeostasis epitelial, alteraciones en los niveles de

proliferación celular y apoptosis, así como también mostraron el desarrollo de lesiones

preneoplásicas como son metaplasia cervical y mitosis frecuentes (Figura 10) [Ocádiz-

Delgado et al., 2008].

En conclusión, los NRs y en particular RAR/RXR juegan un papel clave en el control

del crecimiento normal o maligno de los epitelios; los retinoides, al activar estos

receptores, inhiben la proliferación e incrementan la apoptosis de varios tipos de células

tumorales in vitro e in vivo y reducen la incidencia de cánceres epiteliales. Los RXRs

forman heterodímeros con VDR (del inglés: “Vitamin D Receptor”), RAR, TRs (del inglés:

“Thyroid Receptor”) y PPARs (del inglés: “Peroxisome Proliferator-Activated Receptor”) y

las moléculas diméricas son la forma activa de estos NRs. El RXRα es muy importante en

la transmisión de señales inducidas por los retinoides y se expresa abundantemente en

tejido cervical. Para entender la participación de los RXR en neoplasias humanas

frecuentes, es crucial el desarrollo de sistemas modelo que permitan estudiar in vivo el

papel de los receptores nucleares y en particular de los RAR y RXR.


19

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20

1.7 Apoptosis y Cáncer

La apoptosis o muerte celular programada es un proceso finamente regulado, que

es utilizado para la eliminación de células innecesarias, dañadas, mutadas, infectadas con

virus o desconocidas para el organismo [Boya et al., 2004; Elmore, 2007]. Este

mecanismo es imprescindible para el funcionamiento de diferentes procesos fisiológicos

normales en los organismos multicelulares, dentro de los cuales se incluyen el desarrollo

embrionario, la renovación tisular, la diferenciación, la morfogénesis, la respuesta

inmunológica, entre otras [Elmore, 2007; Krammer et al., 2007a; Opferman y Korsmeyer,

2003]. La apoptosis puede ser inducida por una gran variedad de factores, como son la

carencia de factores de crecimiento, mediante receptores de muerte, exposición a luz

ultravioleta, radiaciones o también mediante drogas quimioterapéuticas. Dependiendo del

estímulo apoptótico y el tipo de célula afectada, este proceso puede durar desde unas

cuantas horas, hasta unos pocos días [Norbury y Hickson, 2001].

La apoptosis puede ser inducida principalmente mediante dos vías de señalización

celular: la vía extrínseca y la vía intrínseca (Figura 11). La primera incluye la activación de

receptores de muerte, moléculas de superficie celular de la superfamilia del Factor de

Necrosis tumoral (TNF; por sus siglas en inglés: “Tumoral Necrosis Factor”); mientras que

la vía intrínseca involucra la liberación de factores pro-apoptóticos de la mitocondria al

citoplasma como Citocromo C. Ambas vías son seguidas por una cascada de eventos

dependientes principalmente de la activación de caspasas proteolíticas, resultando así en

la degradación de proteínas y activación de enzimas que culminan en la muerte

apoptótica [Krammer et al., 2007b].


21

Como se mencionó anteriormente, la apoptosis se encuentra involucrada en una

gran variedad de procesos fisiológicos y es de vital importancia en la vida de un

organismo multicelular, ya que se encarga de mantener un equilibrio entre el número de

células que proliferan y las que mueren (homeostasis) [Green, 2003]. Un desequilibrio en

este proceso puede provocar diversos trastornos patológicos, por ejemplo, una apoptosis

excesiva puede dar origen a enfermedades neurodegenerativas como son Alzheimer,

Parkinson o Huntington. De igual forma, puede provocar una disminución de linfocitos,

dando lugar a padecimientos como el síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)

[Fink y Cookson, 2005; Lockshin y Zakeri, 2007]. Contrariamente, una disminución de la

apoptosis puede ocasionar acumulación de células, induciendo así la formación de

tumores, por lo que éste mecanismo juega también un papel relevante en la regulación

Figura 11. La apoptosis puede ser inducida principalmente mediante dos vías de señalización celular: la vía extrínseca y la vía intrínseca (tomado de Noy, 2010).


22

de la progresión tumoral [Folkman, 2003]. Muchos tipos de cáncer tienen su origen por

infecciones virales, por lo que no es de sorprenderse que muchos virus hayan

desarrollado numerosas estrategias para bloquear la apoptosis [Boya et al., 2004;

Galluzzi et al., 2008]. Entre ellos se encuentra el virus del papiloma humano (HPV), el

cual posee la habilidad de persistir en el huésped por prolongados periodos de tiempo sin

ser eliminados, demostrando de esta manera, los sofisticados mecanismos de evasión

que posee. Gran cantidad de evidencias han sugerido que las oncoproteínas virales E6 y

E7, al igual que E5, pueden inhibir la señalización de los receptores de muerte en puntos

clave [Lagunas et al., 2010]. De esta manera, el HPV es capaz de regular la supervivencia

de las células infectadas para facilitar su replicación y asegurar la producción e

incremento de la progenie [Garnett y Duerksen-Hughes, 2006].

Dentro de la regulación de la vía intrínseca de la apoptosis se han descrito proteínas

asociadas a la membrana de la mitocondria. En general, estas proteínas han sido

clasificadas de acuerdo a su función como anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, MCL-1,

BCL2A1, BCL-B) como pro-apoptóticas (Bax, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik, Blk, BimL, PUMA,

NOXA, BMF, HRK) [Reed, 2006]. Actualmente, se reconoce a las proteínas Bcl-2 y Bax,

pertenecientes a la familia de proteínas Bcl-2, como reguladores centrales de la vida y la

muerte celular programada; además, es bien conocido que Bcl-2 promueve la

sobrevivencia celular, mientras que Bax promueve la muerte celular [Adams y Cory,

1998], de tal manera que la relación de expresión entre Bcl-2/Bax determina la

sobrevivencia o muerte después de un estímulo apoptótico [Liu et al., 2006]. Con base en

lo anterior, en este trabajo nos hemos enfocado a la determinación de los niveles de

expresión de estas moléculas.

La proteína Bcl-2 pertenece a la familia de proteínas Bcl-2/Bax, con un peso entre

los 25 y 26 kDa. Contiene en su extremo carboxilo terminal aminoácidos hidrofóbicos

necesarios para su inserción en membranas lipídicas. Se localiza en la mitocondria, el

retículo endoplásmico y membranas perinucleares. Bcl-2 pertenece a la familia de los

protooncogenes, pero su capacidad de promover el crecimiento tumoral difiere de otros

oncogenes; esta puede rescatar a células destinadas a morir sin afectar la relación de

proliferación celular. Bcl-2 está implicada en el mantenimiento de la homeostasis del

Calcio en la célula y también puede inhibir la muerte celular mediante el secuestro o la

neutralización de las moléculas con dominios BH1, BH2 y BH3 como Bax. Posiblemente


23

evitando la formación de polímeros de Bax, uniéndose Bcl-2 a ambos extremos de la

cadena en formación [Reed, 2006] (Figura 12). Por otro lado, la proteína Bax pertenece

a la familia de proteínas proapoptóticas Bcl-2/Bax. En esta familia existen dos clases

principales de proteínas [Korsmeyer, 2000] (Figura 12):

1. Aquellas que comparten varias regiones de secuencias homólogas, específicamente los

dominios BH1, BH2 y BH3, llamadas proteínas “multidominio”, (MDPs; del inglés: “multi-

domain proteins”).

2. Aquellas que comparten poca similitud de secuencias, salvo por su dominio BH3

(llamadas proteínas de sólo dominio BH3 (BOPs). Las proteínas BOPs usan sus dominios

BH3 como ligandos para captar otros miembros de la familia Bcl-2/Bax, tanto para

suprimir proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 y Bcl-X Bax y Bak.

Figura 12. Participación de Bcl-2 y Bax en la vía intrínseca de la apoptosis (tomado de Cotter, 2009).


24

2 Antecedentes

El desarrollo del cáncer comúnmente toma décadas para desarrollarse siguiendo un

patrón histopatológico progresivo que involucra la adquisición de múltiples cambios

genéticos y epigenéticos, los cuales están relacionados con la alteración de los perfiles de

expresión génica. Además, existen factores externos tales como las infecciones virales

que pueden cooperar al desarrollo del cáncer. Un subgrupo de de los papilomavirus

(HPVs), los virus denominados de alto riesgo (HR-HPVs), está asociado con el desarrollo

de tumores malignos, incluyendo a la mayoría de los casos de cáncer cervicouterino

(CaCu) [zur Hausen, 1996, 2009; Walboomers et al., 1999]. El CaCu es el segundo tipo

de cáncer más común entre las mujeres, con una elevada mortalidad a pesar de los

esfuerzos de detección temprana a nivel mundial [Sankaranarayanan y Ferlay 2006].

Recientemente, la prevención del CaCu se está realizando mediante el uso de vacunas

profilácticas contra los tipos virales de alto (HR-HPV) y bajo (LR-HPV) riesgo. Sin

embargo, el beneficio potencial clínico de estas vacunas profilácticas será detectable

hasta después de algunas décadas. Además, debido a su alto costo, estas vacunas no

han podido ser usadas ampliamente en países con incidencias altas de tumores asociados

a los HR-HPVs. Por otro lado, actualmente no existen todavía tratamientos antivirales

específicos o vacunas terapéuticas disponibles [McLaughlin-Drubin y Münger, 2009].

2.1 El modelo murino triple transgénico condicional para RXRα / transgénico

para E6/E7 [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0); Tam-RTT]

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, el CaCu es un proceso multifactorial por

lo que, con el objetivo de obtener un modelo murino que permita reproducir algunos de

los factores de riesgo relacionados con el CaCu, se llevó a cabo la cruza entre ratones

condicionales para RXRα (deficiencia alimenticia) y ratones que expresan a los oncogenes

E6/E7 (infección persistente por HR-HPV). Esta cruza se llevó a cabo en el Instituto de

Genética y Biología Molecular y Celular de la Universidad Luis Pasteur, en Estrasburgo,

Francia (IGCEB), a cargo del Dr. Eduardo Castañeda del grupo de los Doctores Pierre

Chambon y Daniel Metzger. Proponemos que este modelo tendrá las características de los

dos modelos anteriormente descritos, es decir, expresará las oncoproteínas E6 y E7 del

HPV16 y se le podrá deletar el exón 4 del RXRα en forma espacio-temporal-tejido

específica.


25

Para estudiar el posible efecto cooperador entre la deleción del receptor RXRα y la

expresión de los oncogenes E6E7 para inducir lesiones cervicales malignas, se produjo un

Ratón Triple Transgénico [RTT: condicional para RXRα que expresa a los oncogenes E6 y

E7 del HPV16; RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)]. Previamente habíamos observado que

estos ratones triple transgénicos desarrollan en forma espontánea carcinoma in situ y

ocasionalmente carcinoma invasor. Además, se observó que durante la transformación

celular se modifican los niveles de proliferación celular (Ocádiz-Delgado R, Tesis de

Maestría, PIBioM, ENMyH-IPN, 2009) (Figura 13).

En este trabajo se finalizó la caracterización a nivel molecular e histopatológica del

cérvix obtenido de ratones triple transgénicos después de haber sido tratados con

Tamoxifén (Tam-RTT), determinando los niveles de apoptosis así como el análisis de los

niveles de expresión de genes involucrados en procesos de proliferación celular y

apoptosis. Nuestros hallazgos sugieren que la inducción de cáncer cervical en los ratones

RTT tratados con Tam puede ser un modelo valioso para el estudio del cáncer

cervicouterino.

Este modelo será útil no sólo para identificar cofactores involucrados en la génesis

del cáncer cervical, sino también para identificar biomarcadores tumorales tempranos

para el diagnóstico molecular del Cáncer Cervicouterino.


26

Figura 13. Los ratones Triple Transgénicos tratados con Tamoxifén presentan elevados niveles de proliferación celular (determinado mediante la detección del marcador PCNA).


27

3 JUSTIFICACION

Es importante determinar la posible cooperación entre alteraciones de los

receptores a retinoides (en particular RXRα) y la expresión de los oncogenes E6 y E7 del

HPV en el desarrollo del CaCu, así como su efecto en los niveles de apoptosis y en los

niveles de expresión de genes involucrados en proliferación celular y apoptosis.

Además, es necesario caracterizar en forma más detallada un modelo murino para el

estudio de la carcinogénesis cervical. Esto nos permitirá proponer posibles mecanismos

moleculares de transformación mediados por al menos dos factores de riesgo para

desarrollar CaCu.


28

4 HIPOTESIS

“Si la deleción del receptor a retinoides RXRα y la expresión de los oncogenes E6 y E7 de

HPV cooperan en el desarrollo de lesiones premalignas y malignas del cérvix murino,

entonces disminuirán los niveles de apoptosis en el cérvix de ratones triple transgénicos y

se observará un incremento en los niveles de expresión de C-Myc, p21WAF1 y Bcl-2, así

como una disminución de los niveles de expresión de Bax”


29

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo General

Determinar a nivel histopatológico y molecular, si existe un efecto cooperador entre

la deleción del receptor a retinoides RXRα y la expresión de los oncogenes E6 y E7 de

HPV en el desarrollo de lesiones malignas en el cérvix de ratones triple transgénicos

RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0).

5.2 Objetivos específicos

5.2.1 Determinar si la expresión de los oncogenes E6 y E7 disminuye o aumenta los niveles de apoptosis en el epitelio cervical de ratones transgénicos bK6E6E7 y de ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)] 5.2.2 Determinar si la expresión de los oncogenes E6 y E7 disminuye o aumenta los niveles de expresión de los genes C-Myc, Bcl-2, Bax y p21WAF1 en el epitelio cervical de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y de ratones RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) 5.2.3 Establecer la correlación entre la deleción de RXRα y la expresión de los oncogenes E6 y E7 con cambios histopatológicos del cérvix de ratones RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) 5.2.4 Establecer la correlación entre la deleción de RXRα, la expresión de los oncogenes E6 y E7, los cambios en los niveles de apoptosis y los cambios en los niveles de expresión de los genes C-Myc, Bcl-2, Bax y p21WAF1 con el desarrollo de cáncer cervicouterino en ratones RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) 5.2.5 Con base en los resultados obtenidos se propondrá un mecanismo molecular para la carcinogénesis cervical en ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)


30

6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL


31

7 Materiales y Métodos

7.1 Generación de ratones RXRα condicionales (RXRα L2/L2) tratados con

Tamoxifén [(Cvx L-/L-)], Ratones Triple Transgénicos [RTT; RXRα (Cvx

L2/L2)/E6E7 (tg/0)] y Ratones Triple Transgénicos tratados con Tamoxifén

[Tam-RTT: RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)]

Para llevar a cabo la deleción condicional específica del receptor RXRα, el grupo del

Dr. Pierre Chambon desarrolló una cepa doble transgénica condicional para RXRα en la

que el exón 4 del gen está flanqueado por sitios lox-P (floxed) [Li et al., 2000]. La

genotipificación de estos ratones se realizó mediante el análisis de DNA obtenido de un

fragmento de la cola como se ha descrito previamente [Metzger et al., 2003; Schuler et

al., 2004; Li et al., 2001; Brocard et al., 1997], utilizando el método de DNazol de

acuerdo a las intrucciones del fabricante (Invitrogen, USA). De acuerdo a la construcción

genética de los ratones triple transgénicos, se utilizó Tamoxifén para inducir la actividad

de la CreRecombinasa, la cual reconoce en forma específica los sitios lox-P eliminando

cualquier secuencia de DNA que se encuentre dentro de estas marcas. El tratamiento de

estos ratones con Tamoxifén se realizó de acuerdo a lo descrito por Indra y cols. (2007).

La cepa transgénica que expresa a los oncogenes E6 y E7 del HPV16 [E6E7 (tg/0)] fue

generada por el grupo del Dr. Luis Covarrubias [Escalante-Alcalde et al., 2000; Ocádiz-

Delgado et al., 2009]. Con la finalidad de generar los ratones triple transgénicos RXRα

(Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0), se cruzaron tres parejas reproductoras de ratones RXRα L2/L2

(fondo C57BL/6xSJL) [Feil et al., 1996] con tres parejas E6E7 (tg/0) (fondo CD-1). El

fondo de la línea triple transgénica mostró un fenotipo dominante parecido al fondo CD-1

(Figura 14) [Ocádiz-Delgado et al., 2012]. Los ratones fueron destetados a los 21 días de

edad y alimentados con una dieta diseñada para apoyar la gestación, la lactancia y el

crecimiento de las crías (“Teklad global”; 18% de proteínas; Harlan, Indianápolis, IN,

USA). Los animales fueron alojados individualmente y se mantuvieron bajo ciclos

constantes día-noche (luz de 06:30 a 18:30 horas). Ratones de 4 a 6 semanas de edad

fueron inyectados vía i.p. ya sea con vehículo (etanol) o con 0.01 mg de Tamoxifén

(Tam). Ratones silvestres RXRα (L2/L2; silvestres) fueron utilizados como controles. Los

animales se manejaron y sacrificaron de acuerdo con las normas institucionales del

Instituto de Genética y de Biología Molecular y Celular (IGBMC, Estrasburgo Francia). El

protocolo de manejo de tejidos y muestras de origen murino fue registrado ante la


32

Unidad de Producción y Experimentación con Animales de Laboratorio del CINVESTAV-

IPN (Protocolo 212/04; NOM-062-ZOO-1999, México D.F.).

7.2 Genotipificación de los alelos RXRα

La identificación de los alelos RXRα silvestres y deletados se realizó mediante PCR in

vitro y PCR in situ. El DNA genómico se aisló y purificó de acuerdo a protocolos

establecidos previamente [Feil et al., 1996]. La amplificación por PCR se realizó con los

primers ZO243 (5’-TCCTTCACCAAGCACATCTG-3') (localizado en el intrón 3) y ZO244 (5'-

TGCAGCCCTCACAACTGTAT-3') (localizado en el exón 4). Estos primers amplificaron tanto

Figura 14. Imágenes representativas de ratones triple transgénicos sin tratar con Tamoxifén (-Tam) y ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén (+Tam) [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)]. Los ratones triple transgénicos tratados mostraron un tamaño menor en comparación con los ratones no tratados con Tam.


33

el alelo silvestre (Wt) como los alelos L2 (650 y 700 pares de bases, respectivamente)

[Ocádiz-Delgado et al., 2008]. El primer UD196 (5'-CAACCTGGACTTGTCACTTAG-3') se

localiza en el intrón 4, lejos de los exones 3 y 4. Cuando este primer es utilizado con el

primer ZO243, tanto en el ratón silvestre como en el ratón condicional sin tratar con

Tamoxifén no se obtiene ningún producto de amplificación debido a la lejanía de las

secuencias. Sin embargo, cuando es inducida la recombinación, y por lo tanto la

eliminación del exón 4 de RXRα, la secuencia reconocida por el primer UD196 se

encontrará más cerca del exón 3 y se obtiene un producto de amplificación de 400 pares

de bases. Con base en lo anterior, el primer UD196 fue utilizado como control positivo de

recombinación tanto en los ensayos de PCR in vitro como de PCR in situ [Ocádiz-Delgado

et al., 2008]. Para verificar la eficiencia de escisión de los alelos “floxed” RXRα en epitelio

cervical, se realizó la amplificación de la región mediante PCR en el buffer de reacción

que contenía Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, dNTPs 0.2 mM, 0.25

µM de cada primer y 2 unidades de Taq DNA polimerasa (Invitrogen, U.S.A.), utilizando 1

µg de DNA genómico como templado. Después de 35 ciclos (30 seg a 94°C, 30 seg a 59

°C y 30 seg a 72 °C), los productos de amplificación fueron analizados mediante

electroforesis en geles de agarosa al 2.5%, teñidos con bromuro de etidio [Ocádiz-

Delgado et al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2012]. En todos los experimentos de

genotipificación, la amplificación del gen p21WAF1 fue incluida para confirmar la

integridad de las muestras de DNA genómico.

7.3 Genotipificación de los alelos E6E7

Para identificar a los alelos E6E7 se realizaron experimentos de PCR in vitro y PCR in

situ utilizando primers y condiciones previamente descritos [Fujinaga et al., 1991; Ocádiz-

Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012]. Para lograr este objetivo se utilizaron

los oligonucleótidos consenso pU-1M (sentido): 5’ TGTCAAAAACCGTTGTGTCC 3’ y pU-2R

(antisentido): 5’ GATCTGTCGCTTAATTGCTC 3’ [Fujinaga et al., 1991]. Tanto el DNA

genómico como las muestras de tejido cervical obtenidos de las diferentes cepas de ratón

fueron analizados utilizando las siguientes condiciones de amplificación: desnaturalización

a 94°C durante un minuto, alineamiento a 55°C por dos minutos y síntesis a 72°C

durante dos minutos. En el caso de PCR in vitro se utilizaron 40 ciclos de amplificación,

mientras que para los ensayos de PCR in situ se utilizaron 18 ciclos. Para evitar falsos


34

positivos, se incluyeron dos controles negativos: muestras obtenidas de ratones silvestres

y una reacción a la cual no se le añadió DNA templado. Los productos de PCR fueron

analizados por electroforesis en geles de agarosa al 2.5 %, teñidos con bromuro de etidio

y visualizados en un transiluminador de luz UV. En el caso de los ensayos de PCR in situ

la señal de amplificación fue detectada mediante el uso de un sistema de desarrollo de

color por medio de una peroxidasa (ver adelante).

7.4 Muestras de tejido cervical

Tejido cervical obtenido a partir de ratones mutantes y controles fue fijado en

paraformaldehído al 3.75% en PBS e incluido en parafina de acuerdo a protocolos

descritos previamente [Sambrook y Maniatis, 1989; Riley et al., 2003] y descritos

brevemente a continuación: Antes de ser sacrificados, los ratones fueron anestesiados

con Avertina al 2.5% y perfundidos a través de la aorta con Paraformaldehído al 3.75%.

El tracto reproductivo fue colocado en casetes de inclusión (Fisher Scientific, USA) con

una esponja para compresión y sometidos a una fijación adicional en paraformaldehído al

3.75%, toda la noche a 4 °C. Esta post-fijación produjo muestras linealmente dispuestas

de tal manera que el corte de los tejidos se pudo realizar en un solo plano [Riley et al.,

2003]. Los tejidos fueron lavados en PBS 1X y posteriormente deshidratados en alcoholes

graduales (70%, 80%, 90% y etanol absoluto; 1 hora en cada solución) y finalmente

aclarados con Alcohol:Xileno y Xileno (1 hora en cada paso). Una vez que el tejido fue

incluido en parafina (1 hora en parafina ultrapura a 55°C, enfriando posteriormente a 4°C

toda la noche), las muestras fueron cortadas en un micrótomo en forma serial (5µm de

grosor). Estos cortes fueron montados en laminillas electrocargadas y fueron utilizados

para la tinción con Hematoxilina y análisis por inmunohistoquímica, PCR in situ y RT-PCR

in situ. Todos los ratones hembra fueron sincronizados mediante la exposición al olor de

ratones machos o a su orina (“Efecto Whitten”) [Whitten et al., 1959]. Los animales

fueron sacrificados en la fase estro del ciclo estral.

7.5 Análisis histopatológico

Todos los tejidos fueron evaluados por un patólogo experto (Dr. Rogelio Hernández-

Pando; Departamento de Patología; Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición

Salvador Zubirán, México, D.F.). El criterio histológico para el análisis del tejido cervical


35

murino, fue estrictamente acorde a lo establecido por la Organización Mundial para la

Salud (WHO). En el análisis se incluyeron muestras de las diferentes cepas murinas:

ratones silvestres RXRα (L2/L2 no Cre); ratones condicionales tratados con Tamoxifén

[RXRα (Cvx L-/L-)]; ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones triple transgénicos

tratados con Tamoxifén [Tam-RTT; RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)].

7.6 Inmunohistoquímica

Los cortes de cérvix murino fueron desparafinizados y rehidratados de acuerdo a

protocolos descritos en trabajos similares [Ocádiz-Delgado et al., 2008; Sambrook y

Maniatis, 1989]. La detección de proteínas fue llevada a cabo utilizando un el kit

“Mouse/Rabbit PolyDetector HRP/DAB Detection System” (Bio SB, USA). Inicialmente, los

tejidos fueron rehidratados en PBS y se realizó un procedimiento de recuperación de

antígenos utilizando una solución de citratos (ImmunoRetriever Citrate Solution, Bio SB,

USA) en una olla de presión digital (121 °C, 20 lb de presión, 15 minutos tiempo total).

Las laminillas con los cortes fueron enfriadas a temperatura ambiente durante 30 minutos

y los tejidos fueron tratados con una solución de bloqueo para inhibir las peroxidasas

endógenas (PolyDetector Peroxidase Block quenching buffer; Bio SB, USA). Después de

tres lavados en PBS, los cortes fueron incubados de 12 a 16 horas a 4 °C con uno de los

siguientes anticuerpos monoclonales primarios diluidos 1:50 en buffer de dilución: Tris-

HCl, pH 8.0 1OO mM (concentración final) y NaCl 150 mM (concentración final) en agua

ultrapura: anti-PCNA o anti-Ki67 (marcadores de proliferación celular, anti-HPV16

E6/HPV18 E6 (C1P5), anti-p16INK4A (Santa Cruz Biotechnology, USA); o anti-Caspasa 9

activada (marcador de apoptosis; Cell Signalling, USA). Se realizaron cuatro lavados en

PBS y los cortes fueron incubados durante 30 minutos con un anticuerpo secundario

(PolyDetector HRP label; Bio SB, USA). Después de tres lavados en PBS, los cortes fueron

incubados con el substrato (PolyDetector DAB chromogen; Bio SB, USA), se contratiñeron

con hematoxilina y se montaron en Permount (Fisher Scientific, USA). En todos los

ensayos se incluyeron controles negativos omitiendo el anticuerpo primario.


36

7.7 Determinación de los niveles de apoptosis mediante TUNEL

La fragmentación de DNA genómico fue detectada mediante ensayos de TUNEL

(“TdT-mediated dUTP-X Nick End Labeling”) de acuerdo a las especificaciones del

fabricante (Roche, USA). Los cortes de tejido fueron desparafinizados en xilol,

rehidratados en PBS y desproteinizados utilizando Proteinasa K durante 15 minutos a

temperatura ambiente (Proteinasa K, 0.5 mg/ml en PBS; Invitrogen, USA), lavados en

PBS y deshidratados nuevamente en alcoholes seriados (70%, 80%, 90% y etanol

absoluto; 5 minutos en cada solución). Para evitar la fragmentación artificial del DNA, se

utilizaron exclusivamente soluciones libres de nucleasas durante todo el procedimiento. El

marcaje con fluoresceína-dUTP de los extremos 3’-OH del DNA fragmentado se llevó a

cabo utilizando 12.5 U de la enzima deoxinucleotidil transferasa (TdT; Roche, USA),

incubando durante 1 hr a 37 °C en una cámara húmeda. Como control positivo se utilizó

tejido cervical normal el cual fue tratado previamente con DNasa I (4 U/ corte, 10

minutos a temperatura ambiente; Roche USA). Estos controles mostraron señal

fluorescente en el núcleo de la mayoría de las células (Figura 15). En todos los ensayos

se incluyeron tejidos cervicales normales sin la enzima TdT como controles negativos. Las

laminillas fueron analizadas por microscopía de fluorescencia. En total se observaron al

menos 500 células por cada muestra, tomando en cuenta al menos tres áreas diferentes.

Con el propósito de confirmar los resultados, en forma adicional se realizó la detección de

Caspasa 9 activada, mediante ensayos de inmunohistoquímica (ver sección 6.6).


37

7.8. PCR in situ

Con el propósito de demostrar: a) la deleción selectiva del gen RXRα así como la

eliminación del transcrito respectivo en ratones condicionales y b) la presencia del

transgén E6E7 y su transcrito en células epiteliales del cérvix murino de ratones

transgénicos [E6E7 (tg/0)] y triple transgénicos (Tam-RTT), decidimos utilizar tanto la

técnica de PCR in situ como RT-PCR in situ. Estas técnicas combinan la sensibilidad

extrema y especificidad de la amplificación por PCR con la capacidad de localizar ácidos

nucleicos en tejidos proporcionada por la técnica de hibridación in situ, permitiendo

realizar una comparación entre tejido epitelial y el estroma. Con base en lo anterior, en

este trabajo se realizó la técnica de PCR in situ directa de acuerdo a lo descrito

previamente con algunas modificaciones [Nuovo, 2001; Ocádiz-Delgado et al., 2008;

Controles Positivos

Controles Negativos

MB

MB

MB

MB

Figura 15. Controles positivos (tratamiento con DNasa) y negativos (sin incubación con TdT) para el ensayo de TUNEL. MB: Membrana Basal.


38

Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012]. Los cortes de tejido

previamente fijados en laminillas electrocargadas fueron incubados en un buffer de lisis

que contenía Tris-HCl 0.1 M pH 8.0, EDTA 50 mM pH 8.0 y Proteinasa K 0.5 µg/ml,

durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las laminillas fueron lavadas

cuidadosamente con agua tratada con DEPC. Después de deshidratar los tejidos con

alcohol absoluto, cada tejido fue cubierto con una solución de amplificación que contenía:

Digoxigenina-11(2’-deoxiuridina-5’)-trifosfato (DIG; Roche, USA). Para reducir la

formación de híbridos entre los primers (dímeros de oligonucleótidos), la solución de PCR

fue precalentada a 70 °C durante 10 minutos antes de añadir 5 U de Taq DNA

polimerasa. En todos los ensayos se incluyeron controles negativos que no contenían

alguno de los primers o no se añadió la enzima Taq. La amplificación mediante PCR in

situ se llevó a cabo utilizando el sistema diseñado por Perkin Elmer (USA). Las laminillas

fueron precalentadas a 70 °C utilizando la herramienta de ensamblaje incluida en el

equipo. Después de depositar 50 µl de la reacción de PCR sobre cada uno de los tejidos,

la reacción fue sellada utilizando los discos y clips AmpliCover (Perkin Elmer, USA).

Después del ensamblaje, las laminillas fueron pre-incubadas a 70 °C en el equipo

“GeneAmp In situ PCR system 1000” (Perkin Elmer, USA) hasta que se inició la

amplificación. La reacción de PCR se llevó a cabo durante 18 ciclos de acuerdo a lo

descrito previamente [Ocádiz-Delgado et al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-

Delgado et al., 2012]. Los primers utilizados para la amplificación in situ fueron los

mismos que se utilizaron para el análisis cuantitativo de RT-PCR en Tiempo Real

(RTqPCR) (Tabla 1). Una vez que finalizaron los ciclos, los tejidos fueron conservados a

una temperatura de 4 °C hasta el desensamblaje. Los clips y discos AmpliCover fueron

removidos cuidadosamente sin maltratar los tejidos, posteriormente se realizaron dos

lavados de 5 minutos cada uno en PBS a temperatura ambiente y los tejidos fueron

deshidratados en alcohol absoluto durante 3 minutos dejándolos secar al aire.

7.9. RT-PCR in situ

Después de la digestión con Proteinasa K (ver sección 6.8.), los tejidos fueron tratados

con 1 U/muestra de DNasa I libre de RNasa (Roche, USA), durante 48 horas a

temperatura ambiente. Se realizaron al menos 8 lavados con agua tratada con DEPC. Se

realizó la reacción de transcripción reversa utilizando la enzima SuperScript II (Invitrogen,


39

USA) de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La reacción (70 µl volumen final en

agua tratada con DEPC) contenía 2.5 µg de oligo(dT)12-18, una mezcla de dNTPs (10 mM

de cada uno de los deoxinucléotidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP), buffer 5X, DTT 0.1 M,

40 U de inhibidor de ribonucleasas recombinante y 100 U/tejido de transcriptasa reversa

(Invitrogen, USA). Las laminillas fueron incubadas a 42 °C durante una hora en una

cámara húmeda sellada. Después de varios lavados, se llevó a cabo la reacción de PCR in

situ directa utilizando primers específicos de acuerdo a lo descrito en la sección 2.8

[Ocádiz-Delgado et al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012].

Se incluyeron controles negativos en los cuales uno de las primers fue sustituido con H2O

durante la reacción de PCR u omitiendo la incubación con la enzima transcriptasa reversa.

Tabla 1 Secuencias de oligonucleótidos y condiciones de amplificación utilizados en los ensayos de RT-PCR in situ y RT-PCR cuantitativa en tiempo real

Gen Secuencia 5' → 3'

Tamaño del Producto de Amplificación

(pares de bases; pb) C-Myc Forward

Reverse aaaacgacaagaggcggacac gcttgtgctcgtctgcttgaa

183 pb

p21WAF1 Forward Reverse

ttcagagcccaggcaccatg gggacccagggctcaggtaga

262 pb

Bcl-2 Forward Reverse

tcctaacggagaagtaagag gaatctgtttgctctcatac

113 pb

Bax Forward Reverse

acaggggcctttttgctacag tgccacccggaagaagacctc

225 pb

HPRT Forward Reverse

gtaatgatcagtcaacgggggac ccagcaagcttgcaaccttaacca

174 pb

* Las condiciones de amplificación para RT-PCR in situ fueron: 94 °C, 30 seg; 60 °C, 30 seg; 72 °C, 30 seg; 18 ciclos.


40

7.10 Detección in situ de los productos de amplificación

Para la detección de los productos de PCR se utilizó un anticuerpo primario anti-DIG

(Anti-Digoxigenin Fab fragments; Roche, USA), conjugado a una fosfatasa alcalina.

Previamente se realizó un bloqueo con una solución de albúmina sérica bovina al 5 %

(BSA; Sigma, USA) durante 30 minutos. Después de eliminar la solución de bloqueo por

decantación, se añadió el anticuerpo anti-DIG diluido 1:200 en Tris-HCl 100mM pH 7.4 y

NaCl 150 mN (100 µl de solución por tejido) y se incubó durante 2 horas a temperatura

ambiente. Los controles negativos fueron incubados sin el anticuerpo primario. La

detección de la fosfatas alcalina fue llevada a cabo utilizando el sustrato NBT/BCIP

(Zymed, USA) durante 10 a 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Después

de la detección, las laminillas fueron lavadas dos veces en agua destilada estéril durante

5 minutos cada vez, se dejaron secar al aire antes de montarlas utilizando el medio de

montaje Permount (Fisher Scientific, USA).

7.11. Captura digital de imágenes, análisis y cuantificación de la señal

Se obtuvieron fotomicrografías utilizando un equipo digital DFC290 HD (Leica

Microsystems, USA). Se utilizó el siguiente método para realizar un análisis

semicuantitativo de los resultados obtenidos en ensayos de inmunohistoquímica, PCR in

situ y RT-PCR in situ: Después de la adquisición de imágenes, los archivos de resultados

experimentales fueron post-procesados utilizando el programa PhotoImpact (Ulead

PhotoImpact SE versión 3.02; Ulead Systems, USA). Durante este procesamiento se

obtuvo una señal más homogénea la cual nos permitió el análisis del tejido cervical. Las

regiones seleccionadas fueron analizadas digitalmente utilizando el programa Image-

ProPlus (versión 4.5.0.19; Media Cybernetics, Inc., USA). La cantidad de señal fue

cuantificada calculándola como una matriz de datos en pixels (el color contenido en un

píxel dentro de una imagen en una localización específica). Este procedimiento permitió

incluir pixels adyacentes de color similar con base al píxel índice. Todos los pixels

identificados dentro de los parámetros seleccionados fueron cuantificados y utilizados

para generar una gráfica. El archivo usado como control (cérvix de ratones silvestres) es

generado en forma similar. En el caso del análisis de los resultados para RT-PCR in situ,

los datos obtenidos de la detección de los niveles de expresión constitutiva del gen HPRT,


41

fueron utilizados para normalizar los resultados experimentales [Ocádiz-Delgado et al.,

2008; Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012].

7.12. Aislamiento y purificación de RNA total

El RNA total fue aislado y purificado a partir de tejido cervical murino utilizando el

reactivo TRIzol de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA). Los

tejidos fueron obtenidos de ratones hembra y almacenados a -80 °C hasta su

procesamiento. La calidad de los RNAs fue determinada mediante electroforesis en geles

de agarosa (2 %) desnaturalizantes, teñidos con bromuro de etidio, esto permitió la

visualización de las bandas correspondientes a las fracciones 18S y 28S del RNA a través

de un transiluminador de luz UV: Las concentraciones del RNA total fueron obtenidas

mediante espectrofotometría. Estas muestras se utilizaron para los ensayos de RT-PCR

cuantitativo en Tiempo Real (RTqPCR).

7.13. Síntesis de cDNA para el análisis cuantitativo por RT-PCR en Tiempo Real

(RTqPCR)

Para la síntesis de cDNA se utilizaron tres microgramos de RNA total en una reacción

de 20 µl (volumen final): La mezcla de reacción contenía buffer 5X para síntesis de la

primera cadena [Tris-HCl 250 mM (pH 8.3), KCl 375 mM, MgCl2 15 mM], dNTPs 0.5 mM,

ditiotreitol 5 mM, 15 U de inhibidor de RNasas (Invitrogen, USA), 2.5 µg de oligo(dT)12-18

y 100 U de la retrotrancriptasa SuperScript II. La reacción se llevó a cabo de acuerdo a

las especificaciones del fabricante con modificaciones menores (2 horas a 42°C;

Invitrogen, USA).

7.14. Cuantificación relativa del mRNA mediante RTqPCR

La cuantificación relativa de los RNAs seleccionados fue llevada a cabo mediante

RTqPCR utilizando un equipo 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA).

Todos los primers fueron diseñados para reconocer secuencias intrónicas y fueron

sintetizados por la empresa Invitrogen (USA) [Ocádiz-Delgado et al., 2008]. Las

secuencias fueron obtenidas a partir de la base de datos GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Previamente se habían establecido las

condiciones óptimas para la amplificación de cada secuencia utilizando el kit de


42

amplificación SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) [Ocádiz-Delgado et

al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2012; Tabla 1]. Las condiciones de reacción fueron

optimizadas con el propósito de obtener curvas de amplificación de un solo pico. En

forma adicional, los amplicones fueron analizados mediante electroforesis en geles de

agarosa para confirmar que se obtenía una sola banda del tamaño esperado. Las

reacciones de PCR incluyeron 40 ciclos cada uno de tres pasos: desnaturalización a 95 °C

durante 10 segundos, alineamiento de los primers a 60 °C durante 10 segundos y una

fase de elongación a 72 °C durante 10 segundos. Para una reacción de 25 µl se utilizaron

12.5 µl de la mezcla de SYBR Green la cual contenía: 1.25 U de Taq DNA polimerasa,

buffer de reacción, mezcla de dNTPS y MgCl2 1 mM (concentración final), colorante SYBR

Green, 0.5 mM de cada primer, 1 µg de templado y agua ultrapura. Todos los ensayos se

realizaron por duplicado en una sola corrida. Para normalizar las diferencias entre la

cantidad de cDNA añadido a las reacciones, se utilizaron los niveles de expresión del gen

constitutivo HPRT para normalizar los datos.


43

8 Resultados

8.1 Eliminación específica del receptor RXRα en epitelio cervical de ratones

triple transgénicos RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) tratados con Tamoxifén

(Tam-RTT)

Previamente se han desarrollado sistemas murinos en los cuales es posible deletar

en forma tejido específica secuencias de interés. Esta estrategia involucra el uso de la

expresión de la Cre recombinasa del bacteriófago P1, el cual escinde segmentos de DNA

flanqueados por sitios “Lox” (LoxP). En forma adicional, el control de la actividad de la

Cre recombinasa ha sido condicionada mediante su fusión con dominios de unión a

ligando mutados para receptores a esteroides [Feil et al., 1996; Kellendonk et al., 1999;

Schwenk et al., 1998; Tannour-Louet et al., 2002]. Por lo tanto, la expresión célula-

específica de tal fusión (Cre-ERT2), cuya actividad es inducida por el compuesto anti-

estrogénico Tamoxifén (Tam), ha permitido una mutagénesis espacio-temporal-específica

eficiente en ratones cuyo gen que codifica para el receptor RXRα es marcado con los

sitios “lox” mencionados anteriormente. La mutagénesis se ha logrado en diferentes

tejidos incluyendo el cérvix [Metzger et al., 2003; Ocádiz-Delgado et al., 2008]. Como se

mencionó previamente, en el laboratorio del Dr. Pierre Chambon se obtuvieron ratones

triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0), de color similar a la cepa CD-1, los

cuales desarrollaron alopecia severa después de ser tratados con Tam [RXRα (Cvx L-/L-

)/E6E7 (tg/0) (Figura 14). Con el propósito de confirmar los resultados obtenidos en los

ensayos de PCR in situ, se llevó a cabo la amplificación de las secuencias de interés

utilizando PCR tradicional en fase líquida. El DNA obtenido de un fragmento de la cola de

los ratones fue genotipificado de acuerdo a lo descrito en la sección de Materiales y

Métodos. Los productos de amplificación para RXRα o para E6E7 fueron analizados

mediante electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. La

recombinación dependiente de Cre produjo un alelo nulo (L-) en ratones condicionales

tratados con Tam [RXRα (Cvx L-/L-)] y en ratones triple transgénicos tratados con Tam

[RXRα (Cvx L-/L-) / E6E7 (tg/0); Tam-RTT] (Figura 16). Por otro lado, mediante ensayos

de PCR in situ se demostró que los alelos RXRαL2 fueron convertidos a alelos RXRαL- en el

epitelio cervical de estos ratones pero no en el estroma (Figura 17), lo que demuestra

que la deleción selectiva de la Cre-ERT2 fue eficiente después del tratamiento con Tam.


44

Figura 16. Tipificación molecular de la recombinación de los alelos “floxed” para RXRα (L-) después del tratamiento con Tamoxifén (Tam) y de la presencia del transgén E6E7 en cepas de ratones incluidas en este trabajo. Los productos de amplificación obtenidos mediante ensayos de PCR in vitro fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 2.5%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados en un transiluminador de luz UV. El gen p21WAF1 fue usado como control de amplificación para confirmar la integridad de las muestras de DNA genómico.


45

Figu

ra 1

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46

Esta conversión de alelos L2 a L-, no fue detectada en los ratones control sin

tratamiento con Tam o ratones sin sitios loxP (p. ej. Ratones silvestres o “Wild type” (Wt)

y ratones E6E7 (tg/0) (Figura 17). De acuerdo a lo esperado, el RNA mensajero

correspondiente a RXRα no fue detectado en los ratones RXRα (Cvx L-/L-) ni en los Tam-

RTT, en comparación con los ratones control (Figura 17, panel in situ). Los transcritos de

RXRα están presentes solamente en epitelios sin tratar con Tamoxifén.

8.2 El transgén E6E7 en el cérvix de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y

ratones Tam-RTT

Utilizando PCR in vitro, el transgén E6E7 pudo ser detectado solamente en ratones

transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones Tam-RTT (Figuras 16 y 17). Con el propósito de

demostrar la presencia del transgén y su correspondiente transcrito, se utilizaron las

técnicas de PCR in situ y RT-PCR in situ. De acuerdo a lo esperado, solamente se detectó

una intensa señal de amplificación, tanto para el transgén E6E7 como su transcrito, en el

epitelio cervical de los ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-RTT (Figura 17). No se

detectó señal de amplificación en el caso de tejido cervical de ratones silvestres o ratones

condicionales RXRα (Cvx L-/L-) (Figura 17).

8.3 Detección de la oncoproteína E6 del HPV-16 y de la expresión de p16INK4A

en tejido cervical de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT

Como se mencionó anteriormente, el transgén E6E7 y su correspondiente transcrito

fueron detectados eficientemente en tejido cervical de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT.

En forma adicional, se demostró la presencia de la proteína E6 del HPV-16 mediante

ensayos de inmunohistoquímica (Figura 18). Como una forma indirecta de demostrar la

actividad de la oncoproteína E7 del HPV-16, se determinaron los niveles de la proteína

p16INK4A, una proteína supresora de tumores, la cual es utilizada frecuentemente como un

biomarcador en cáncer cervical en humanos [Juric et al., 2010; Bergeron et al., 2010]. El

uso de software especializdo nos permitió analizar en forma semicuantitativa los niveles

relativos (índice de marcaje) de la proteína p16INK4A. La expresión de esta proteína se

detectó principalmente en algunas células de los estratos basales del epitelio cervical de

ratones silvestres (Figura 18). Se detectó un incremento en la expresión de p16INK4A en

los estratos suprabasales del cérvix de ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) siendo


47

Figu

ra 1

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48

más abundante en ratones Tam-RTT. Las muestras cervicales de ratones E6E7 (tg/0) y

Tam-RTT sobre-expresaron la proteína p16INK4A en comparación con muestras control

(Figura 18). Interesantemente, la deleción del receptor RXRα también indujo la sobre-

expresión de p16INK4A (Figura 18).

8.4 Cambios histológicos en cérvix de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-

RTT

Se analizaron muestras cervicales de las cepas de ratón mencionadas anteriormente.

Los ratones silvestres mostraron una zona de transformación (ZT) normal mostrando el

epitelio cilíndrico (columnar) simple con transición a epitelio estratificado (escamoso). El

cérvix de ratones condicionales RXRα tratados con Tam mostró el desarrollo de

metaplasia epidermoide (Figura 19). Los ratones hembras tenían de 27 a 29 semanas de

edad, en el caso de los ratones transgénicos E6E7 (tg/0) se incluyó un grupo de 44

animales. De manera interesante, estos ratones mostraron una baja frecuencia de

displasia moderada (2/44 ratones; 0.9%) o de displasia severa (3/44 ratones; 1.4%)

(Figura 19; Tabla 2) no observándose casos de carcinoma in situ y/o carcinoma invasor.

Además, con el propósito de establecer si existía una posible cooperación entre la

ausencia del receptor RXRα y la presencia de E6E7 en la carcinogénesis cervical murina,

en el estudio histopatológico se incluyeron muestras de Tam-RTT. El análisis reveló que,

después del tratamiento con Tam, el cérvix de la cepa Tam-RTT mostró un 11% de

displasia moderada y 17% de displasia severa. Además, tanto los ratones E6E7 (tg/0)

como los ratones Tam-RTT mostraron células indiferenciadas e hiperproliferación de los

epitelios. Un hallazgo interesante, a diferencia de lo observado en la cepa E6E7 (tg/0),

fue el encontrar el desarrollo de carcinoma in situ y carcinoma invasor en un 61%

(11/18) y un 11% (2/18) respectivamente, de los animales Tam-RTT (Figura 19; Tabla

2). Es importante mencionar que no se observaron alteraciones histopatológicas en tejido

cervical obtenido de ratones silvestres RXRα (L2/L2 no Cre) o ratones silvestres tratados

con Tamoxifén.


49

Figu

ra 1

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Tabla 2 Análisis histológico de tejido cervical1

_______________________________________________________________ Genotipo Diagnóstico histopatológico % _______________________________________________________________ Epitelio Normal 84 RXRα (L2/L2) Epitelio queratinizado 8 (n=12) Displasia moderada 8 _______________________________________________________________ Metaplasia epidermoide 47 RXRα (Cvx L-/L-)* Displasia moderada 40 (n=15) Cervicitis 13 _______________________________________________________ E6E7 (tg/0)** Displasia moderada 0.9 (n=44) Displasia severa 1.4 _______________________________________________________

TTM Cancer Invasor 11 RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) Carcinoma in situ 61 (n=18) Displasia severa 17 Displasia moderada 11 _______________________________________________________ 1 Todos los ratones fueron tratados con 0.1 mg de Tamoxifén por día durante cinco días consecutivos. *Los ratones RXRα (Cvx L-/L-) mostraron atrofia cervical en el 60 % (9/15) de los casos. ** En este estudio se muestran resultados de aquellos animales transgénicos E6E7 (tg/0) que mostraron alteraciones cervicales histopatológicas.


51

8.5 Incremento de los niveles de proliferación celular e inhibición de la

apoptosis en ratones Tam-RTT

En un reporte previo, demostramos que la deleción del gen RXRα induce el aumento

tanto en los niveles de proliferación celular como en los niveles de apoptosis [Ocádiz-

Delgado et al., 2008]. De acuerdo a esto, fue necesario determinar el efecto de la

deleción de RXRα y la presencia de E6 y E7 sobre estos mismos eventos celulares. Se

analizaron tejidos cervicales de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT determinándose que los

niveles de PCNA (Figura 19B) y Ki-67 (Figura 20), dos importantes marcadores de

proliferación celular, estaban aumentados en comparación con las otras cepas murinas.

Estos niveles se incrementaron 5.6 y 5.9 veces en ratones Tam-RTT, respectivamente, en

comparación con los ratones control (Figuras 19 y 20). Normalmente, este tipo de señal

se detecta en forma restringida a la capa basal de los epitelios, sin embargo, tanto la

ausencia del receptor RXRα como la expresión de los oncogenes E6 y E7 inducen la

expresión de estos marcadores en las capas suprabasales del epitelio. Aun más, en

algunas muestras de ratones Tam-RTT se detectó la expresión de PCNA o de Ki-67 en el

100% de los estratos, sugiriendo un comportamiento similar al observado en muestras

clínicas diagnosticadas como carcinoma in situ. Se observa además, que existe una

correlación entre el incremento en la proliferación celular y la severidad de la lesión.

Utilizando la determinación de TUNEL y la detección de Caspasa 9 activada,

determinamos los niveles apoptosis o muerte celular programada en el cérvix de las

diferentes cepas murinas. El análisis digital de las imágenes obtenidas de los niveles de

apoptosis en muestras cervicales de ratones (índice de marcaje definido como el

porcentaje de células positivas para TUNEL o Caspasa 9 Activada), nos permitió observar

que tanto los ratones E6E7 (tg/0) como los ratones Tam-RTT mostraron los niveles más

bajos de apoptosis en comparación con las otras cepas incluidas en este estudio. En

general, los niveles más bajos de apoptosis los mostraron los ratones Tam-RTT (Figura

21).


52

Figu

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54

8.6 Determinación de los niveles de expresión de los genes C-Myc, Bax, Bcl-2 y

p21WAF1 en ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-RTT

De acuerdo a los hallazgos relacionados con los niveles de proliferación celular y

apoptosis, se determinaron los niveles de expresión de genes relacionados a estos

procesos (Figura 22). Los resultados mostraron que el incremento en la expresión de C-

Myc se correlaciona directamente con el genotipo de cada cepa. La ausencia del receptor

RXRα en los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) indujo un aumento de la expresión

de este proto-oncogén. De manera similar, la expresión de E6 y de E7 aumentó aun más

la expresión de este gen. En el caso de los ratones Tam-RTT, los resultados sugieren que

ambas condiciones cooperaron para la sobre-expresión de C-Myc (Figura 22). Es

importante mencionar que en los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) la expresión de

Bcl-2 y p21WAF1 estaba disminuida, sugiriendo que la ausencia de RXRα puede conducir

tanto a un incremento en la proliferación celular como en la apoptosis en tejido cervical,

esto explicaría, al menos en parte, tanto la hiperproliferación del tejido cervical como la

presencia de atrofia en algunos ratones. También fue interesante el hecho de encontrar

un incremento en el mRNA de p21WAF1 en los ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT; a pesar

de esta sobre-expresión, en estos ratones se observaron niveles disminuidos de

apoptosis.


55

Figura 22. Expresión relativa (RTqPCR) de genes involucrados en los procesos de proliferación celular y apoptosis en cérvix murino. El nivel de transcripción de un panel de genes seleccionados (C-Myc, p21WAF1, Bcl-2 y Bax) fue determinado utilizando primers específicos. RXRα (L2/L2): Ratones silvestres (Wild type); RXRα(Cvx L-/L-): ratones condicionales para RXRα tratados con Tam; E6E7 (tg/0): ratones transgénicos para E6E7/HPV16; RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-RTT. * : Estadísticamente significativo (P <0.05). Todos los datos fueron normalizados utilizando la expresión constitutiva del gen HPRT.


56

9 Discusión

Los retinoides son reguladores poderosos de la diferenciación epitelial y son

esenciales para su mantenimiento [French et al., 2000]. El epitelio cervical contiene dos

fenotipos epiteliales denominados: escamoso estratificado y columnar simple, los cuales

se unen en la zona denominada escamocolumnar o zona de transformación [Darwiche et

al., 1994]. Se han estudiado los niveles de expresión de los diferentes receptores al ácido

retinoico en epitelios cervicales, encontrándose que los receptores RXRα y RARβ son los

receptores que se expresan principalmente en este tejido [Darwiche et al., 1994]. A nivel

celular, los receptores RAR se expresan principalmente en las capas basales y

suprabasales mientras que los receptores RXR lo hacen en las células basales. Las

proteínas RXR son proteínas auxiliares que interaccionan con una amplia variedad de

receptores nucleares formando heterodímeros, por ejemplo con los receptores RAR

[Darwiche et al., 1994; Celli et al., 1996]. El hecho de que los RXR están localizados

principalmente en células basales y células columnares del cérvix, sugiere que estos

receptores juegan un papel central en la homeostasis epitelial, regulando, mediante

interacciones heterodiméricas, la diversidad generada en estas células que proliferan

rápidamente in vivo. Anteriormente, se ha reportado que la deficiencia de Vitamina A en

la dieta puede conducir a alteraciones en la homeostasis de los epitelios incluyendo el

cérvix. Existen modelos animales en los que se ha demostrado que la deficiencia de

Vitamina A puede inducir la aparición de metaplasia cervical, una condición que

usualmente precede a una neoplasia cervical [La Vecchia et al., 1988; Schneidar et al.,

1989; Slattery et al., 1990; Darwiche et al., 1993; Darwiche et al., 1994]. También se ha

reportado, por ejemplo, que la deficiencia en retinol puede contribuir al desarrollo de

lesiones intraepiteliales cervicales en mujeres inmuno-comprometidas [French et al.,

2000]. En conclusión, el estatus de los niveles de Vitamina A o de los receptores para sus

derivados, juega un papel central en el mantenimiento de las características del epitelio

cervical y glandular, y como tal, este estado de deficiencia puede considerarse como un

factor importante para el desarrollo de cáncer cervical.


57

9.1. La deleción del receptor RXRα incrementa los niveles de apoptosis en el

cérvix de ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-)

Previamente, habíamos reportado al realizar los estudios histológicos del cérvix de

ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-), que el epitelio cervical era más delgado que el

epitelio del cérvix de los ratones control, sugiriendo una condición similar a la atrofia

[Ocádiz-Delgado et al., 2008]. Aunque la deleción de RXRα incrementó los niveles de

proliferación celular (Figuras 13, 19 y 20) [Ocádiz-Delgado et al., 2008]), observamos un

incremento en la activación de la Caspasa 9 (Figura 21). Se ha demostrado que la

activación de la Caspasa 9 es un elemento clave durante la inducción de la apoptosis

mediante la vía intrínseca [Lagunas et al., 2010; Simoni y Tolomeo, 2001]. Estos

resultados sugieren que los niveles altos de apoptosis observados bajo esta condición,

evitan la hiperproliferación epitelial debido a una disminución en el número de capas

subrabasales, conduciendo a un fenotipo similar a la atrofia (Figuras 19-21) [Moss et al.,

1996; Zamolo et al., 2005; Zekarias et al., 2005; Simanainen et al., 2009; Shen y Toser,

2009].

9.2. La expresión de las oncoproteínas E6 y E7 del HPV-16 disminuyen los

niveles de apoptosis en cérvix de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-RTT

Diversos grupos han propuesto que p21WAF1 es un supresor de tumores y se ha

confirmado que la inactivación de esta proteínas mediada por E7 contribuye en forma

importante a la carcinogénesis cervical, al eliminar diversas señales reguladoras negativas

para el crecimiento celular [Funk et al., 1997; Jones et al., 1997; Shin et al., 2009].

Además, como ya se mencionó anteriormente la oncoproteína E6 tiene la capacidad de

inducir la degradación de p53 y de interferir con proteínas pro-apoptóticas como Bak,

FADD y procaspasa 8 [Ganguly y Parihar, 2009; Lagunas et al., 2010]. En conlusión, las

oncoproteínas E6 y E7 pueden inhibir o interferir en los mecanismos de regulación de la

muerte celular programada. Consistente con estas observaciones, en este trabajo

encontramos que la expresión de las oncoproteínas E6 y E7 inhiben los niveles de

apoptosis en el cérvix tanto de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones triple

transgénicos tratados con Tamoxifén (Tam-RTT), sugiriendo que los mecanismos de

muerte celular programada se encuentran inhibidos en tejido cervical de estos ratones

(Figura 21). Por lo tanto, esta inhibición de la apoptosis pudiera estar cooperando con el


58

incremento en la proliferación celular inducida por la ausencia de RXRα en el cérvix de los

ratones Tam-RTT. Como se mencionó anteriormente, la proteína Bcl-2 promueve la

sobrevivencia celular, mientras que Bax promueve la muerte celular [Adams y Cory,

1998], de tal manera que la relación de expresión entre Bcl-2/Bax determina la

sobrevivencia o muerte después de un estímulo apoptótico [Liu et al., 2006]. Con base en

esto, la disminución en la relación Bcl-2/Bax observada después de la deleción de RXRα

podría incrementar en forma importante la muerte celular en los ratones condicionales

RXRα. Por otro lado, en ratones E6E7 (tg/0) se observó un aumento en la expresión de

Bcl-2 (antiapoptótico) lo que es acorde con los niveles de apoptosis disminuidos (Figura

22). A pesar de que la ausencia de RXRα induce una disminución de Bcl-2,

sorprendentemente, la expresión de E6 y de E7 fue suficiente para lograr un aumento en

el transcrito de este gen, disminuyendo drásticamente los niveles de muerte celular

programada, como se observa en los ratones Tam-RTT (Figura 22). En contraste, la

relación Bcl-2/Bax se incrementó en los ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT, lo que explicaría,

al menos en parte, la disminución en los niveles de apoptosis, ya que este incremento fue

solamente del doble en comparación con los ratones RXRα mutantes, lo que difícilmente

explicaría la disminución tan marcada de los índices de apoptosis (Figura 21). Con base

en lo anterior, no es posible obtener una conclusión definitiva debido a que los niveles de

expresión de las proteínas Bcl-2 y Bax pudieran no correlacionar con lo niveles de los

respectivos mRNAs debido a la acción de las oncoproteínas E6 o E7 [Lagunas et al.,

2010; Liu et al., 2008]. En otras palabras, sería necesario establecer si los niveles de

expresión del RNA mensajero correlacionan positivamente con los niveles de las proteínas

Bcl-2 y Bax.

La inactivación de p53 mediada por E6 podría resultar en la sobre-expresión de Bcl-

2 y la regulación negativa de la expresión de Bax and Bak [Aguilar-Lemarroy et al., 2002;

Chakrabarti y Krishna, 2003; Magal et al., 2005; Asadurian et al., 2007; Graupner et al.,

2011; Lagunas et al., 2010;] (Figura 23), contribuyendo de esta manera a la proliferación

celular en el cérvix de los ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT. Además de promover la

inactivación de p53, la oncoproteína E6 tiene la capacidad de bloquear la citólisis mediada

por TNF en fibroblastos de ratón [Duerksen-Hughes et al., 1999]. Por lo tanto, la

presencia continua de E6 es importante para la viabilidad de células tumorales HPV-

positivas. Por otra parte, la proteína E6 expresada ectópicamente ha sido asociada con la


59

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60

inhibición de un amplio rango de diferentes reguladores pro-apoptóticos que pertenecen

tanto a la vía extrínseca (p. ej. CD95 o FADD) como a la vía intrínseca mitocondrial (p. ej.

Bax o Bak). También existe la posibilidad de que E6 active moléculas anti-apoptóticas

comunes a ambas vías como son las proteínas c-IAP2 y Bcl-2 [Lagunas et al., 2010; Vogt

et al., 2006; Filippova et al., 2004; Yuan et al., 2005] (Figura 23).

9.3. Los niveles de proliferación celular están incrementados en el epitelio

cervical de los ratones triple transgénicos Tam-RTT

El análisis de la proliferación celular mediante la detección del marcador PCNA,

reveló la presencia abundante de células en proliferación en todas las capas del epitelio

cervical estratificado de los ratones Tam-RTT, mientras que en los ratones silvestres la

señal sólo se detectó en la capa basal. En contraste, se observó un modesto incremento

en el índice de proliferación del tejido cervical de ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-)

mientras que sólo algunos ratones E6E7 (tg/0) mostraron un incremento en estos niveles

de proliferación (Figuras 19 y 20). Esta observación es consistente con los niveles altos

de expresión de PCNA reportados en queratinocitos que expresaban la proteína E7 [Jones

et al., 1997] así como también en muestras cervicales de pacientes positivas para HR-

HPVs [Branca et al., 2007]. Nuestros resultados sugieren que en los ratones Tam-RTT, la

deleción de RXRα y la expresión de E6 y E7 contribuyen en forma sinergística para

aumentar la proliferación celular y posiblemente alterar los mecanismos de diferenciación

terminal del epitelio cervical (Figura 23).

9.4. El biomarcador tumoral p16INK4A está incrementado en ratones

condicionales RXRα (Cvx L-/L-) y ratones Tam-RTT

La sobre-expresión del supresor tumoral p16INK4A está asociada con lesiones

precancerosas de alto grado así como con carcinomas del cérvix, también ha sido

demostrado que la evaluación inmunohistoquímica de esta proteína puede ser útil como

un biomarcador para identificar lesiones de alto grado infectadas con HR-HPVs

[Samarawardana et al., 2010]. La proteína p16INK4A bloquea la fosforilación de pRb

mediada por cdk4 y cdk6, resultando en la inhibición de la transcripción dependiente de

E2F y la progresión del ciclo celular en el punto de chequeo G1 a S [Samarawardana et

al., 2010; Zhang et al., 1999]. Durante la carcinogénesis cervical existe una activación de


61

E2F y la progresión del ciclo celular debido a la inactivación de pRb por E7 [Zhang et al.,

1999] (Figura 23). En este caso, es posible que la liberación de E2F induzca la activación

del promotor de p16INK4A. Interesantemente, la deleción del gen RXRα en el cérvix de los

ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) indujo la sobre-expresión de la proteína p16INK4A

(Figura 18). Esto sugiere que la pérdida de este receptor podría estar incrementando la

liberación del factor de transcripción E2F y en consecuencia activando el promotor de

p16INK4A [McLaughlin-Drubin et al., 2008] o induciendo la reprogramación epigenética del

mismo [McLaughlin-Drubin et al., 2008; McLaughlin-Drubin et al., 2011] (Figura 23). Es

bien conocido que en la mayoría de los carcinomas cervicales, la sobre-expresión de

p16INK4A indica de manera indirecta una infección persistente con HR-HPV. De relevancia

en este contexto es la observación del aumento de la expresión de p16INK4A en las

lesiones cervicales presentes en los ratones Tam-RTT (Figura 19), lo cual sugiere que

esta cepa se comporta de manera similar a las infecciones persistentes con HR-HPV en

humanos. Se ha descrito que E7 se asocia e inactiva a E2F6 y Bmi1 (miembros del grupo

de represores transcripcionales “polycomb”), las cuales son represores transcripcionales

de p16INK4A [Trimarchi et al., 2001; Kim et al., 2007; Shin et al., 2009; McLaughlin-Drubin

et al., 2008; McLaughlin-Drubin et al., 2011]; las marcas represoras trimetilo en la lisina

27 de la histona 3 (H3), las cuales son necesarias para la unión del grupo represor

“polycomb”, están disminuidas en células que expresan E7 del HPV-16 y en lesiones

cervicales positivas al HPV. Esta disminución en la metilación de H3K27 es causada por la

inducción transcripcional de la desmetilasa KDM6B específica para H3-lisina-27. Esta

inducción de la expresión de p16INK4A es independiente de la inactivación de pRb y es

mediada por KDM6B [McLaughlin-Drubin et al., 2011]. Esto plantea la interesante

posibilidad de que la deleción de RXRα conduce a la inducción transcripcional de la

desmetilasa KDMB6, cooperando con la sobre-expresión de p16INK4A inducida por E7

(Figura 23).

9.5. Modificación de los niveles de expresión de un grupo de genes asociados

con carcinogénesis cervical

En el presente estudio, analizamos los niveles de expresión a nivel de mRNA de un

grupo de genes que están expresados diferencialmente durante los procesos de

proliferación celular y/o apoptosis, los cuales han sido asociados a la carcinogénesis


62

cervical. Por ejemplo, se observó un incremento en la expresión de C-Myc en el cérvix de

los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-), E6E7 (tg/0) y Tam-RTT al compararlos con

los ratones silvestres (Figura 22). Ha sido reportado que los retinoides convierten a E2F

en un supresor transcripcional inhibiendo la transcripción de diferentes genes blanco

incluyendo a C-Myc [Lee et al., 1998] (Figura 23). Luego entonces, el incremento en los

niveles del mRNA de C-Myc mRNA después de la deleción de RXRα en epitelio cervical

puede ser parcialmente debido a la pérdida de la actividad represora de E2F y esto estar

asociado con una proliferación celular descontrolada principalmente en los ratones Tam-

RTT (Figura 23) [Baudino et al., 2003; Pelengaris y Khan, 2003; Secombe et al., 2004;

O’Donell et al., 2005].

Por otro lado, se ha demostrado que la proteína p21WAF1 induce el arresto celular

en G1 mediante la inhibición de cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) y se ha

identificado como uno de los genes normalmente activados por la proteína p53 [el-Deiry

et al., 1993; Li et al., 1994]. La represión transcripcional de p21WAF1 observada después

de la eliminación de RXRα (Figura 22), puede explicar al menos en parte el incremento

de la proliferación celular en los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-), sugiriendo que

la señalización de RXRα es crucial para la regulación negativa del ciclo celular y por lo

tanto para mantener la homeostasis cervical. La oncoproteína E7 puede anular la

inhibición mediada por p21WAF1 de la actividad de CDKs y la síntesis de DNA

dependiente de PCNA [Funk et al., 1997; Shin et al., 2009]. La relación entre E7 y

p21WAF1 es paradójica ya que E7 causa un incremento en los niveles de la proteína

p21WAF1 en humanos y en tejidos/células de ratón [Jones et al., 1997; Balsitis et al.,

2005; Shin et al., 2009] y al mismo tiempo E7 puede inactivar a p21WAF1 [Funk et al.,

1997; Jones et al., 1997; Shin et al., 2009]. Acorde con esto, p21WAF1 está sobre-

expresado en los ratones Tam-RTT debido probablemente a la expresión de la

oncoproteína E7. Estos resultados sugieren que, en el modelo de ratones triple

transgénicos tratados con Tamoxifén, la deleción de RXRα junto con la expresión de E6 y

E7 cooperativamente incrementan la frecuencia de lesiones pre-malignas y malignas

inactivando la función supresora de tumor de p21WAF1 e induciendo la carcinogénesis

cervical (Figura 23).


63

9.6 Posible mecanismo molecular de la carcinogénesis cervical en ratones

triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)

Con base en los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo, proponemos el siguiente

mecanismo molecular simplificado de la carcinogénesis cervical en ratones triple

transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0) (Figura 24):

a) La deleción del receptor RXRα incrementa la liberación del factor de transcripción E2F

y en consecuencia se activa el promotor de p16INK4A , además, probablemente induce la

reprogramación epigenética del mismo; por ejemplo, la deleción de RXRα conduce a la

inducción transcripcional de la desmetilasa KDMB6 así como la sobreexpresión de las

Ciclinas D1, E/A y de cdc2. Por otro lado, la ausencia de este receptor induce la pérdida

de la actividad represora de E2F y a su vez, se incrementa la expresión de C-Myc, un

proto-oncogén que tiene la capacidad de inhibir la función de p21WAF1 y por lo tanto

está fuertemente relacionado con la proliferación celular descontrolada y el desarrollo de

cáncer cervicouterino. Además, la deleción de RXRa permite la liberación del complejo

represor que incluye a histona-desacetilasas (HDAC) lo que permite que permanezca la

acetilación de histonas y el reclutamiento de la maquinaria de transcripción de cientos de

genes (Figura 24).

b) La oncoproteína E6 promueve la destrucción de p53 lo que resulta en la sobre-

expresión de Bcl-2 (anti-apoptótica) y la regulación negativa de la expresión de Bax and

Bak (pro-apoptótica). Además, E6 promueve la inhibición de un amplio rango de

diferentes reguladores pro-apoptóticos que pertenecen a la vía extrínseca como TRAIL,

CD95 o FADD como a la vía intrínseca mitocondrial (p. ej. Bax o Bak). E6 también activa

moléculas anti-apoptóticas comunes a ambas vías como son las proteínas c-IAP2 y

Survivina las cuales inhiben a su vez la formación del apoptosoma (compuesto por Apaf-1

y Caspasa 9 activada). Además, E6 tiene la capacidad de bloquear la citólisis mediada por

TNF. Todo lo anterior conduce a la disminución o inhibición de los mecanismos de

apoptosis; por lo tanto, la presencia continua de E6 es importante para la viabilidad de

células tumorales HPV-positivas (Figura 24).


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c) La oncoproteína E7 activa al factor de transcripción E2F y promueve la progresión del

ciclo celular debido a la inactivación de pRb. La liberación de E2F induce la activación del

promotor de p16INK4A. Además, la oncoproteína E7 puede anular la inhibición mediada por

p21WAF1 de la actividad de CDKs y la síntesis de DNA dependiente de PCNA. E7 tiene la

capacidad de disminuir la inducción transcripcional de la desmetilasa KDM6B específica

para H3-lisina-27, las cuales son necesarias para la unión del grupo represor “polycomb”.

Esto promueve un aumento de la expresión de p16INK4A en forma independiente de la

inactivación de pRb. Finalmente, E7 tiene la capacidad de incrementar la actividad de

Histona-acetil-transferasas lo que promueve un incremento en la expresión de genes

relacionados con la proliferación celular.

d) Finalmente, la deleción de RXRα y la expresión de E6 y E7 contribuyen en forma

sinergística para aumentar la proliferación celular y posiblemente alterar los mecanismos

de diferenciación terminal del epitelio cervical, esto conduce a un incremento en la

frecuencia de lesiones pre-malignas y malignas en el tejido cervical de ratones RXRα (Cvx

L2/L2)/E6E7 (tg/0) (Figuras 23 y 24).


66

9.7 Consideraciones finales

El estudio del ratón Tam-RTT nos ha permitido proponer un mecanismo molecular de la

carcinogénesis cervical en ratones triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0). Una

vez que los oncogenes E6 y E7 son expresados y el receptor RXRα es deletado, los

subsecuentes eventos que pueden suceder son: 1) La deleción de RXRα induce la

proliferación celular del epitelio cervical, bloquea los mecanismos de diferenciación y

facilita la transformación celular; 2) Las oncoproteínas E6 y E7 pueden cooperar en la

inducción e incremento de la supervivencia celular y el aumento en los niveles de

proliferación celular (Figura 24). En resumen, se propone que el desarrollo de lesiones

malignas cervicales en ratones Tam-RTT es inducido por la alteración de diferentes

mecanismos de control celular. Finalmente, este modelo murino será útil para el estudio

molecular del Cáncer Cervicouterino.


67

10 CONCLUSIONES

• El principal hallazgo de este trabajo fue la detección de carcinoma in situ (61%) e

invasor (11%) en el cérvix de los ratones Tam-RTT, sugiriendo que la ausencia del

receptor RXRα acoplada con la expresión de las oncoproteínas virales E6 y E7 están

contribuyendo a la carcinogénesis.

• Este modelo será útil para identificar cofactores involucrados en la génesis del cáncer

cervical.

• El uso de ratones condicionales para el receptor a retinoides que expresan E6E7 del

HPV16 puede ayudar a identificar biomarcadores tumorales tempranos para el

diagnóstico molecular del Cáncer Cervicouterino.

• Nuestros hallazgos sugieren que la inducción de cáncer cervical en los ratones RTT

tratados con Tam puede ser un modelo valioso para el estudio del cáncer

cervicouterino.


68

11 PERSPECTIVAS

En este estudio hemos demostrado que la deleción de RXRα y la expresión de E6 y

E7 contribuyen en forma sinergística en el desarrollo de lesiones pre-malignas y malignas

en el tejido cervical de ratones RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0). Además, pudimos

establecer los niveles de muerte celular programada (apoptosis) en el cérvix de estos

ratones, así como estudiar la expresión de algunos genes relacionados con proliferación

celular y apoptosis.

Dado que este modelo murino presenta diversas caracterísiticas similares a lo

descrito en pacientes con CaCu y con el propósito de caracterizar en forma más completa

los modelos murinos incluidos en este estudio, sería interesante:

a) Confirmar si la deleción del receptor RXRα induce la reprogramación epigenética del

ratón triple transgénico; por ejemplo, determinar si los patrones de metilación de

ciertos promotores han sido alterados.

b) Determinar los niveles de actividad de desmetilasas de histonas, de acetil-

transferasas de histonas y desacetilasas de histonas.

c) Confirmar si la vía extrínseca de la apoptosis se encuentra alterada.

Este modelo murino triple transgénico podría ser útil para el estudio de la

carcinogénesis cervical lo que permitirá, entre otras cosas, establecer a nivel molecular el

papel de los oncogenes virales durante etapas tempranas de la carcinogénesis cervical.

Además, permitirá la identificación de moléculas blanco de estas proteínas y establecer

patrones y/o vías de señalización relacionadas con la transformación maligna celular así

como estudios relacionados con la inestabilidad genómica. Este modelo también ofrece la

oportunidad de estudiar la inmunobiología del cáncer lo que permitirá desarrollar

estrategias y vacunas terapéuticas.


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12 BIBLIOGRAFÍA

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13 PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DERIVADA DE ESTE TRABAJO

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RXRa deletion and E6E7 oncogene expression are sufficient to induce cervicalmalignant lesions in vivo

Rodolfo Ocadiz-Delgado a,b, Eduardo Castañeda-Saucedo c,1, Arup K. Indra c,g,2, Rogelio Hernandez-Pando d,Pedro Flores-Guizar a, Jose Luis Cruz-Colin a, Felix Recillas-Targa e, Guillermo Perez-Ishiwara b,Luis Covarrubias f, Patricio Gariglio a,⇑a Dept. of Genetics & Molecular Biology, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados del IPN (CINVESTAV-IPN). Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco, 07360. Mexico, DF, Mexicob Molecular Biomedicine, PIBioM, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatia-IPN. Guillermo Massieu Helguera 239 Fracc. La Escalera-Ticoman. Mexico, DF, Mexicoc Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale(INSERM), Université Louis Pasteur, Illkirch-Cedex, Strasbourg, Franced Dept. of Pathology, Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricion Salvador Zubiran (INCMNSZ). Vasco de Quiroga 15, Col. Seccion XVI, Tlalpan, 14000. Mexico, D.F., Mexicoe Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexicof Institute of Biotechnology, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexicog Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, Portland, OR 97239, USA

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 13 July 2011Received in revised form 23 November 2011Accepted 23 November 2011

Keywords:E6E7HPVRetinoid receptorCervical cancerMurine models

a b s t r a c t

Cervical cancer is the second leading cause of cancer deaths among women worldwide. High-Risk-HumanPapillomaviruses (HR-HPVs) play an important etiologic role in the development of carcinoma of theuterine cervix. However, host factors are important in determining the outcome of genital HPV infectionas most cervical precancerous lesions containing HR-HPVs do not progress to invasive carcinomas. Ret-inoids, acting through nuclear receptors (RARs, RXRs), play a crucial role in cervix development andhomeostasis regulating growth and differentiation of a wide variety of cell types; indeed, they can inhibitcell proliferation, and induce cell differentiation or apoptotic cell death. Here we introduce a mousemodel that develops spontaneously malignant cervical lesions allowing the study of the cooperativeeffect between HPV16E6E7 expression and the lack of RXRa in cervical cancer development. This modelcould be useful to study multistep carcinogenesis of uterine cervix tissue and might improve chemopre-ventive and chemotherapeutic strategies for this neoplasia.

� 2011 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Cancer development commonly takes decades to arise, and fol-lows a progressive histopathological pattern that involves acquisi-tion of multiple genetic and epigenetic changes, which are relatedto alterations in gene expression profiles. In addition, external fac-tors such as viral infection can cooperate in the development ofcancer. A subset of anogenital human papillomaviruses (HPVs),the high-risk HPVs (HR-HPVs), is associated with malignant

tumors, including the majority of cervical cancers [1–3]. Cervicalcancer is the second most common type of malignant lesion amongwomen, with elevated mortality rates despite the increasedscreening efforts [4]. Prevention has recently been performed byprophylactic vaccines against the most abundant mucosal HR-and low-risk HPV types. However, the potential clinical benefit ofprophylactic vaccines will not be apparent for several decades. Inaddition, due to their high cost, these vaccines have not beenwidely used in countries with the highest incidence of HR-HPVs-associated cancers. On the other hand, no HR-HPV specific antiviraltreatments or therapeutic vaccines are currently available [5].

HR-HPV-associated cervical carcinogenesis is a multistep pro-cess, in which persistently infected cells develop first into precan-cerous lesions known as cervical intraepithelial neoplasia (CIN) [4].A small percentage of these lesions (approximately 3%) progress tocervical carcinomas with more than half of them attributed toinfection with HPV16 [3,6,7]. In HR-HPV associated cancers, E6and E7 oncogenes target critical regulators of several cellular pro-cesses, resulting in alterations such as acquisition of unlimited pro-liferative potential, growth factor independence, evasion of

0304-3835/$ - see front matter � 2011 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.canlet.2011.11.031

⇑ Corresponding author. Address: Department of Genetics and Molecular Biology,Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Av. IPN 2508. Colonia SanPedro Zacatenco, CP 07360, Mexico DF, Mexico. Tel.: +52 55 57 47 3337; fax: +52 5557 47 3931.

E-mail addresses: [email protected], [email protected] (P. Gariglio).1 Present address: Cancer Cell Biology Laboratory, UACQB, Chilpancingo, Gro.,

Mexico.2 Present address: Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,

OSU; Member, Environmental Health Science Center, OSU, Corvallis, OR 97331; Dept.of Dermatology, OHSU; Member, Knight Cancer Institute, OHSU, Portland, OR 97239,USA.

Cancer Letters 317 (2012) 226–236

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Cancer Letters

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apoptosis, lack of sensitivity to cytostatic signals, induction ofinvasive and metastatic properties, and sustained angiogenesis[8–14]. It has been demonstrated that the E6 and E7 oncoproteinsact as potent mitotic mutators, thereby increasing the probabilityof acquiring cellular mutations that contribute to carcinogenic pro-gression during each round of cell division [5]. E6 proteins fromHR-HPVs target the tumor suppressor p53 for degradation, pre-venting cell growth inhibition in both undifferentiated and differ-entiated cells. HPV E7 protein binds to Rb family members andtargets them for degradation. This results in the release and activa-tion of E2F transcription factors that drive expression of S phasegenes [2,5,15–19]. In addition, the in vivo properties of HR-HPVE6 and E7 oncoproteins have been evaluated through the genera-tion and characterization of HPV transgenic mice strains [20–25].

Most cervical precancerous lesions containing HR-HPVs do notprogress to invasive carcinomas, implicating that both genetic (cel-lular oncogenes or tumor suppressor gene mutations) and environ-mental cofactors (low dietary micronutrients such as vitamin A,chronic estrogen intake or other epigenetic regulators) could coop-erate in those cases where cancer progression occurs [2,26–29].

Retinoid-induced differentiation is a cellular response that maybe crucial for protection against cancer development. However,investigation of this process has so far been restricted to culturedcells [30–33] or to a few murine models that have been manipu-lated to conditionally delete RXRa in epidermal keratinocytesof adult mice [34,35]. In this conditional mouse model [RXRa(L-/L-)], temporally controlled epithelia-specific somatic mutagen-esis of RXRa alleles results in severe skin abnormalities includingalopecia, hyperproliferation, skin inflammatory reaction and aber-rant terminal differentiation [36,37]. Moreover, in the same model,RXRa ablation was also demonstrated in cervical epithelial cells ofadult mice, resulting in a simultaneous increase of cell prolifera-tion and apoptosis levels accompanied by alteration in the expres-sion of genes involved in both processes [38].

In order to investigate the role of HR-HPV oncogene expressionin early cervical lesions in vivo, we produced a transgenic mouseexpressing HPV16 E6 and E7 oncogenes from the promoter of thebovine keratin 6 gene [E6E7 (tg/0)]. These transgenic mice displaya fur phenotype characterized by lower hair density and the abilityto regenerate hair much faster than wild-type mice due to theinability to establish a resting telogen phase of hair follicle growthcycle [39], as well as tongue focal epithelial hyperplasia [40]. Thesemice also show a significantly higher number of putative epider-mal stem cells as compared to wild-type mice, contributing to afaster wound re-epithelization [20]. Interestingly, these E6E7(tg/0) mice showed low frequency of moderate and severe dyspla-sia (manuscript in preparation).

To study the possible cooperative effect between RXRa ablationand E6E7 expression to induce cervical malignant lesions, we pro-duced a Triple Transgenic Mouse [TTM: RXRa-null conditional,expressing HPV16 E6E7 oncogenes; RXRa (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)]. Here we introduce a mouse model that, after RXRa ablation[RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)], develops spontaneously malignantcervical lesions allowing the study of the cooperative effectbetween HPV16E6E7 expression and the lack of RXRa in cervicalcancer development.

2. Materials and methods

2.1. Generation of Tam-treated RXRa (L2/L2) [RXRa (Cvx L-/L-)], RXRa (Cvx L2/L2)/E6E7(tg/0) mice (TTM) and Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) mice (Tam-TTM)

To carry out the conditional disruption of the RXRa gene in mouse cervical epi-thelia, the RXRa (L2/L2) conditional mouse line was constructed [35], in which theexon 4 is loxP-flanked (floxed) [36]. The generation of this floxed RXRa mouse lineand genotyping using tail DNA have been described previously [35,41–43]. RXRa(L2/L2) conditional mice were Tam-treated as described previously [38] in order

to generate RXRa (L-L-) mice. Three breeding pairs of RXRa (Cvx L2/L2) (C57BL/6xSJL strain) [44] and E6E7 (tg/0) (CD-1 strain) [39,40] mice were bred to producemultiple breeding pairs of RXRa (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0) (TTM) mice. The geneticbackground of the line was mainly CD-1 strain (Fig. 1A). Mice were weaned at21 days of age and fed with a fixed formula-autoclavable diet designed to supportgestation, lactation, and growth of rodents (Teklad Global 18% Protein Rodent Diet;Harlan Teklad, Indianapolis, IN, USA). Animals were singly housed and kept under

Fig. 1. (A) Representative images of untreated (-Tam) and Tam-treated (+Tam)RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) (Tam-TTM) mice. Tam-treated TTM showed smallersize and severe alopecia in comparison with untreated mice. (B) Evidence of floxedRXRa allele recombination (L-) after Tam treatment and presence of E6E7 transgenein mice strains included in this study. In order to confirm in situ analyses, we haveperformed traditional liquid phase PCR. Tail DNA was genotyped by PCR asdescribed in Materials and Methods. The specific amplification products for RXRa orE6/E7 genes were separated by agarose gel electrophoresis and visualized byethidium bromide staining. Cre-dependent recombination produces a null allele(L-) in Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-) and Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)(Tam-TTM) mice. As expected, E6E7 transgene was detected only in E6E7 (tg0) andTam-TTM mice. p21/WAF1: gene was used as amplification control to ensure theintegrity of genomic DNA samples. (C) Tissue-specific RXRa gene ablation andefficient E6E7 oncogene expression. RXRa (PCR) panel: Detection of RXRa deletionby in situ PCR. Arrows indicate intense nuclear signal only in normal cervicalepithelium (Open arrows) and stroma (Solid arrows) as indicated under Materialsand Methods section. RXRa (RT-PCR) panel: Abrogation of RXRa mRNA productionafter RXRa gene ablation in cervix of mutant mice demonstrated by in situ RT-PCR.RXRa transcripts are present only in Tam-untreated epithelial cells (open arrows).As expected, no signal was detected for either RXRa gene (in situ PCR) or transcript(in situ RT-PCR) in epithelium of Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-) and Tam-TTM mice.E6E7 (PCR) panel: in situ PCR for the detection of the E6E7 transgene. Open arrowsindicate intense nuclear signal in E6E7 (tg/0) animals. E6E7 (RT-PCR) panel: E6E7mRNA detection in cervix of transgenic mice and Tam-TTM demonstrated by in situRT-PCR. E6E7 transgene and corresponding mRNA was detected only in cervix ofE6E7 (tg/0) and Tam-TTM mice. BM: Basal Membrane. Magnification: 40X. Insets:80 X. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRaconditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-TTM. Scale bar, 50 lm.

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constant day-night (lights on 0630-1830) conditions. Four to six weeks-old micewere i.p.-injected with either vehicle (ethanol) or 0.1 mg Tamoxifen (Tam) perday for five consecutive days [35,38]. RXRa conditional animals without Tam treat-ment or Tam-treated Wild Type [RXRa (L2/L2); no Cre] animals were used as con-trols. Animals were sacrificed at least 21–23 weeks after Tam-treatment. All animalexperiments were performed in compliance with the relevant laws and institu-tional guidelines and were approved by local animal ethics committee (UPEAL-CINVESTAV-IPN, Mexico; NOM-062-ZOO-1999).

2.2. Genotyping of the RXRa alleles

Genomic DNA was isolated as described [44]. To identify the recombined RXRaalleles, PCR was performed with primer ZO243 (50-TCCTTCACCAAGCACATCTG-30)(located in intron 3) and 30-primer ZO244 (50-TGCAGCCCTCACAACTGTAT-30)(located in exon 4). These primers amplified Wild type (Wt) and L2 alleles(650 bp and 700 bp fragments, respectively [38]. UD196 primer (50-CAACCTGGACTTGTCACTTAG-30 is located in the intron 4 between Exon 4 and 5; thisallele was used as in situ PCR amplification control [38] and for liquid phase PCR(Fig. 1B). To verify the excision efficiency of floxed RXRa alleles in cervical epithe-lium, PCR amplification was carried out in a buffer containing 10 mM Tris–HCl (pH8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.25 lM of each primer, and 2 unitsof Taq polymerase (Invitrogen, USA) using 1 lg of genomic DNA as template. After35 cycles (30 s at 94 �C, 30 s at 59 �C and 30 s at 72 �C) the products were analyzedon ethidium bromide-stained 2.5% agarose gels [38]. In all genotyping experimentsit was included the amplification of a constitutive DNA sequence to ensure theintegrity of genomic DNA samples (e.g. p21/WAF1 gene).

2.3. Genotyping of the E6E7 alleles

To identify the E6E7 alleles, both, liquid-phase PCR and in situ PCR were per-formed using E6E7 specific primers as previously described [40,45] (Fig. 1B).

2.4. Cervical tissue samples

Cervical tissue from mutant and control mice was dissected, fixed and paraffin-embedded as described elsewhere [46,47]. Briefly, mice were anesthetized with2.5% Avertin and perfused through the aorta with 3.75% paraformaldehyde. Theentire reproductive tract including parametrial, retroperitoneal soft tissue andlymph nodes were dissected, placed in an embedding cassette (Fisher, USA) withone sponge for compression, and postfixed in 3.75% paraformaldehyde overnightat 4 �C. In-cassette postfixation produced a linear reproductive tract facilitating

subsequent sectioning of the entire organ in one plane [47]. The posterior vaginalwall was removed leaving an intact rim of vulvar tissue, and a 3–5 mm end pieceof plastic pipette tip was inserted into the vagina to keep it open during subsequentprocessing steps. Tissues were washed in 1X PBS, and dehydrated through gradedalcohols and xylene. After pipette tip removal, the reproductive tract was embed-ded with the cut vaginal wall surface oriented downward. The entire reproductivetract was serially sectioned (5 lm/section), and 10–15 sections were collected at75 lm intervals for Hematoxylin staining, immunohistochemistry, in situ PCR andin situ RT-PCR. Five-micrometers-thick longitudinal sections were mounted oncharged slides. All female mice were synchronized by exposure to the odor of amale, or to its urine (‘‘Whitten effect’’) [48]. Animals were sacrificed in estrousphase.

2.5. Histological analysis

For each specimen, 5-micron-thick histological sections were obtained to pre-pare distinct slides for light microscopy. The specimens stained with hematoxylinwere evaluated by a pathologist. The histological criteria determined by the WHOwere strictly followed in the analysis of the murine uterine cervix. The samplesanalyzed were obtained from: Wild type mice RXRa (L2/L2); Tam-treated RXRaconditional mice [RXRa (Cvx L-/L-)]; E6E7/HPV16 transgenic mice [E6E7 (tg/0)]and Tam-treated TTM [RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0); Tam-TTM]. No defects ormolecular alterations were observed in Wild type animals that received Tamoxifenor in Tam-untreated RXRa (L2/L2) animals.

2.6. Immunohistochemistry

Sections were deparaffinized and rehydrated as described previously [38,46].Protein detection was performed using the Mouse/Rabbit PolyDetector HRP/DABDetection System (Bio SB, USA). Briefly, tissues were rinsed in PBS and epitoperetrieval was performed in a pressure cooker (121 �C, 20 lb of pressure) using theImmunoRetriever Citrate Solution (Bio SB, USA) during 15 min. Slides were cooledat room temperature (30 min) and tissues were treated for 1 min with PolyDetectorPeroxidase Block quenching buffer (Bio SB, USA). After three washes in PBS, sectionswere incubated 12–16 h at 4 �C with following primary antibodies: PCNA (cell pro-liferation marker) or HPV16 E6/HPV18 E6 (C1P5), mouse monoclonal antibody orp16INK4A (Santa Cruz Biotechnology, USA) or Cleaved Caspase 9 (apoptosis marker;Cell Signaling, USA) following manufacturer’s recommended protocol. Followingfour washes in PBS, slides were incubated for 30 min with a secondary antibody(PolyDetector HRP label; Bio SB, USA). After three washes in PBS, sections were

Fig. 1 (continued)

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incubated with appropriate substrate (PolyDetector DAB chromogen; Bio SB, USA),counterstained with hematoxylin and mounted in GVA-mount reagent (Zymed,USA). Negative controls included omission of primary antibody.

2.7. Apoptosis detection (TUNEL)

DNA fragmentation was assessed by TUNEL [49] according to the specificationsof the manufacturer (Roche, USA). Briefly, paraffin tissue sections mounted oncharged slides (5 lm thick) were deparaffinized with xylol, rehydrated and thendeproteinated for 15 min (0.5 lg/mL Proteinase K in PBS), washed and dehydratedagain. To avoid artificial DNA fragmentation, only nuclease-free solutions were usedduring the whole procedure. The labeling of 30-OH ends of fragmented DNA wasperformed by incubation with fluorescein-dUTP using 12.5 U terminal deoxynu-cleotidyl transferase (TdT) for 1 h at 37 �C in a humidified chamber. As positive con-trol, normal cervical tissue pre-treated with DNase I (4 U/tissue, 10 min at roomtemperature; Roche, USA) displayed nuclear positive reactivity in the majority ofcells, demonstrating the incorporation of the fluorescent nucleotide at 30-OH endsto the fragmented DNA. To estimate non-specific binding and autofluorescence,negative controls were included in all assays where tissue sections were incubatedwithout the TdT enzyme. Slides were analyzed by fluorescence microscopy with awide-band excitation barrier filter suitable for analyzing green (fluorescein labeledfragmented DNA) fluorescence. Three independent observers selected differentoptical fields in a random manner to determine the percentage of TUNEL positivestaining in at least 500 cells for each sample. In addition, immunohistochemicaldetection of Cleaved Caspase 9 was performed as an apoptosis marker (see abovein Section 2.6).

2.8. In situ PCR

In order to demonstrate: first, that RXRa gene, as well as the correspondingtranscript, was ablated specifically in cervical epithelia of Tam-treated RXRa (CvxL-/L-) mice and Tam-TTM and, second, that E6E7 transgene was present and thecorresponding transcript was expressed in cervical epithelial cells of E6E7 (tg/0)mice and Tam-TTM, we decided to use both in situ PCR and in situ RT-PCR. Thesetechniques combine the extreme sensitivity of PCR with the cell localizing abilitysimilar to in situ hybridization and allow comparing epithelia with stroma. Directin situ PCR was performed as previously described with some modifications[38,40,50]. Briefly, dried dewaxed sections on sylanecoated slides were incubatedwith protein lysis buffer (0.1 M Tris–HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0) containing0.5 lg/ml Proteinase K for 30 min at room temperature. After thoroughly washingwith DEPC-treated water, 50 ll of the PCR master mix solution containing digoxi-genin-11-(20-deoxy-uridine-50)-triphosphate (DIG-11-dUTP; Roche, USA), wereadded. To reduce primer-dimer formation the PCR solution was heated to 70 �Cfor 10 min before Taq DNA polymerase (5 U per reaction) was added. Negative con-trols were made without primers or Taq. In situ PCR was performed using the sys-tem provided by Perkin Elmer (USA). The slides were preheated to 70 �C on theassembly tool included in the in situ Perkin Elmer equipment, 50 ll PCR mastermix was added to each sample and the reaction was sealed using AmpliCover discsand clips (Perkin Elmer, USA). After assembly, slides were placed at 70 �C in theGeneAmp In situ PCR system 1000 (Perkin Elmer, USA) until running was started.PCR amplification was performed running 18 cycles as described previously[38,40]. Same primers were used for in situ amplification and Real Time analysis.After cycling was completed, the temperature was kept at 4 �C until disassembly.Clips were removed and AmpliCover discs were very carefully lifted from the slideswithout moving them sideways and slides were washed for 5 min in PBS followedby 5 min in 100% EtOH before they were air dried.

2.9. In situ RT-PCR

After Proteinase K digestion (see above), tissues were treated with 1 U/sampleof DNase I, RNase-free (Roche, USA) during 48 h at room temperature. After thor-oughly washing with DEPC-treated water, reverse transcription was performedusing the SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen, USA), following the man-ufacturer’s specifications. In brief, 70 ll DEPC-treated water containing 2.5 lg oli-go(dT)12-18, 10 mM dNTP mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutralpH), 5X first-strand buffer, 0.1 M DTT, recombinant ribonuclease inhibitor (40 U/ll) and reverse transcriptase (100 U/section) (Invitrogen, USA) were added to eachsection. Slides were incubated at 42 �C for 1 h in a sealed humidified chamber. Afterthorough washes, direct in situ PCR was performed using specific primers as de-scribed previously [38,40]. Negative controls included substituting one of the prim-ers by H2O in the PCR reaction or omission of the reverse transcription reaction.

2.10. Detection of in situ PCR products

An indirect immunolabeling method using a primary Anti-Digoxigenin antibody(Fab fragments; Roche, USA) conjugated to alkaline phosphatase was chosen todetect the PCR product. Briefly, blocking was carried out in 5% BSA (Sigma, USA)in PBS for 30 min. Slides were then drained and an Anti-DIG antibody diluted1:200 in 100 mM Tris–HCl pH 7.4 and 150 mM NaCl, was applied (100 ll per

sample) for 2 h at room temperature. As a negative control the primary antibodywas omitted. Detection of alkaline phosphatase was carried out for 10–30 minusing NBT/BCIP kit (Zymed, USA). After detection, slides were rinsed in distilledwater for 5 min and air dried before mounting in Permount histological mountingmedium (Fisher Scientific, USA).

2.11. Digital image capture, analysis and quantification

All photomicrographs were obtained using a DFC290 HD digital camera (LeicaMicrosystems, USA). The following method of quantification was used for immuno-histochemical analyses. After acquisition of digital images, the experimental imagefiles were opened in the PhotoImpact software (Ulead PhotoImpact SE version 3.02;Ulead Systems, USA). The images were digitally processed in order to obtain thebetter and homogeneous signal and then selected for analysis of relevant regions(cervical epithelium). The selected regions were then digitally analyzed using theImage-ProPlus Analysis Software (Ver 4.5.0.19, Media Cybernetics, Inc., USA). Theamount of signal staining was quantified by calculating it as a pixel matrix data(the color contained within a pixel inside an image at specific location). Therefore,chromogen quantity was determined by calculating the norm of the matrix file forthat image. This allows pixels of similar ‘‘color’’ immediately adjacent to the indexpixel to be included for analysis. All pixels falling within the threshold parametersselected were quantified, recorded and used to generate a graphic. The file for thecontrol image is generated similarly: the control slide is acquired and treated iden-tically as the experimental slide except that negative controls were included (seeabove).

2.12. RNA isolation

Total RNA was isolated from cervical tissue obtained from mutant and controlmice using TRIzol reagent according to the manufacturer’s instructions (Invitrogen,USA). Tissues were obtained from female mice and stored at �80 �C. The quality ofthe total RNAs was examined by denaturing agarose gel electrophoresis and stain-ing with ethidium bromide, and the 18S and 28S RNA bands were visualized by UVillumination. The concentrations of total RNA were quantified spectrophotometri-cally. The RNA preparations were used for quantitative Real-Time PCR (RTqPCR).

2.13. Preparation of cDNA for quantitative Real-Time PCR (RTqPCR)

Three micrograms of total RNA were reverse transcribed in a 20 ll reaction. Thereaction mixture consisted of 5X first strand buffer [250 mM Tris–HCl (pH 8.3),375 mM KCl, and 15 mM MgCl2], 0.5 mM dNTPs, 5 mM dithiothreitol, 15 U RNaseInhibitor (Invitrogen, USA), 2.5 lg oligo(dT)12-18, and 100 U SuperScript II ReverseTranscriptase, following the manufacturer’s specifications (Invitrogen, USA).

2.14. Relative mRNA quantification by RTqPCR

The relative quantification of the investigated mRNAs by RTqPCR was per-formed using a 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Oligonucleo-tide primers were designed to be intron spanning and were purchased fromInvitrogen, USA [38]. Sequences were obtained from the GenBank database. Opti-mal PCR reaction for all investigated genes was established using the SYBR GreenPCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) according to the manufacturer’s instruc-tions; annealing temperatures and MgCl2 concentrations were optimized to create aone-peak melting curve. Additionally, the amplicons were checked by agarose gelelectrophoresis for a single band of the expected size. PCRs were processed through40 cycles of a 3-step PCR, including 10 s of denaturation at 95 �C, a 10-s primerdependent annealing phase (60 �C), and a 10 s template-dependent elongation at72 �C. A 25 ll reaction consisted of 12.5 ll SYBR Green PCR Master Mix containing:Taq DNA polymerase, reaction buffer, dNTP mix and 1 mM MgCl2 (final concentra-tion), SYBR Green I dye, 0.5 lM of each primer, 1 ll template (1000 ng per reaction)and ultrapure water. The amplification of each template was performed in duplicatein one PCR run. To normalize for differences in the amount of cDNA added to thereactions, quantification of the housekeeping HPRT mRNA was performed as anendogenous control. The differential expression of the investigated genes was cal-culated as the ratio normalized to HPRT mRNA.

2.15. Statistical analysis

Data were compiled as mean ± S.D. For statistical analysis of differences be-tween the groups, an unpaired Student’s t test was performed. p values < 0.05 wereconsidered to indicate significant differences between data sets.



3. Results

3.1. Efficient ablation of RXRa in the cervical epithelium of Tam-treated RXRa (Cvx L-/L)/E6E7 (tg/0) Triple Transgenic Mice (Tam-TTM)

Previously, spatially controlled targeted somatic mutagenesissystems have been developed in mice by cell-specific expressionof the bacteriophage P1 Cre recombinase, which excises LoxP-flanked (floxed) DNA segments. Additionally, temporal controlof Cre activity was obtained with conditional Cre recombinasesresulting from fusions with mutated ligand binding domains ofsteroid receptors [44,51–53]. Thus, cell-specific expression ofsuch fusion proteins between Cre and mutated ligand bindingdomains of the human estrogen receptor (Cre-ERT2), whose activ-ity is induced by the anti-estrogen Tamoxifen (Tam), has allowedefficient spatiotemporally controlled somatic mutagenesis of flo-xed target genes as RXRa in various cell types and tissues includ-ing cervical tissue [35,38]. We have obtained triple transgenicmice with CD1-like coat color, which developed severe alopeciaafter Tam-treatment (Fig. 1A). In order to detect both the RXRarecombined allele and the tissue-specific RXRa ablation in cervi-cal epithelia we performed liquid phase PCR and in situ PCR anal-yses, respectively. Genotyping analyses showed that RXRa genewas efficiently deleted in RXRa (Cvx L-/L-) conditional miceand Tam-TTM (Fig. 1B). In addition, we demonstrated thatRXRaL2 alleles were converted into RXRaL- alleles in cervical epi-thelium but not in stroma of TTM (Fig. 1C), demonstrating theefficiency of Cre-ERT2 for mediating the selective somatic muta-

tion of floxed RXRa in epithelia after Tam treatment. No L2 toL- allele conversion occurred in controls without Tam treatmentor without loxP sites (e.g. Wild type and E6E7 (tg/0) mice; Fig. 1).As expected, we found that RXRa messenger RNA is absent inTam-TTM in comparison with control mice (Fig. 1C, in situ RT-PCR panel).

3.2. The E6E7 transgene is expressed in cervix of E6E7 (tg/0) transgenicand Tam-TTM

Using liquid phase PCR, E6E7 transgene can be detected only inE6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM (Fig. 1B). In order todemonstrate the presence of both the E6E7 transgene and its cor-respondent transcript in cervical tissue, we have used in situ PCR orin situ RT-PCR. As expected, intense amplification signal wasdetected only in epithelia of the cervix obtained from E6E7 (tg/0)transgenic mice and Tam-TTM (Fig. 1C). No evidence of E6E7sequences was obtained in cervical tissue from wild type or Tam-treated RXRa Cvx L-/L- mice (Fig. 1C).

3.3. HPV-16 E6 oncoprotein detection and p16INK4A expression incervical tissue of E6E7 (tg/0) and TTM

As mentioned above, the E6E7 transgene and correspondingtranscript was efficiently demonstrated in cervical tissue of E6E7(tg/0) and Tam-TTM. In addition, HPV16-E6 protein expressionwas demonstrated in cervical tissue using immunohistochemicalassays (Fig. 2). As indirect evidence of HPV16-E7 oncoprotein activ-

Fig. 2. E6 protein is expressed and p16INK4A protein levels were increased in E6E7 murine cervix. (A) Immunohistochemical detection of E6 oncoprotein and p16INK4A incervical tissue. Open arrows indicate a nuclear HPV E6 or p16INK4A strong positive signal. As expected, neither Tam-treated Wild type nor Tam-treated [RXRa (Cvx L-/L-)]conditional mice showed E6 expression, in comparison with Tam-treated TTM. (B) Relative expression (labeling index) of p16INK4A in cervix of Wild type, Tam-treated mutantmice, E6E7 (tg/0) transgenic mice or Tam-treated TTM. Interestingly, p16INK4A expression increased in Tam-treated RXRa conditional mice and was more abundant in TTM.BM: Basal Membrane. Magnification: 40X. Insets in E6HPV panel: 80X. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0):E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. �: Statistically significant (P < 0.05). Scale bar, 50 lm.



ity, we determined the levels of p16INK4A, a tumor suppressor pro-tein currently employed as a biomarker in human cervical cancer[54,55]. Cervical samples from E6E7 (tg/0) and Tam-treated TTMoverexpressed p16INK4A as compared to cervical samples from Wildtype control mice (Fig. 2B). Interestingly, RXRa ablation alsoinduced p16INK4A protein overexpression in suprabasal layers(Fig. 2A and B).

3.4. Pathological changes in cervix of E6E7 (tg/0) transgenic mice andTam-TTM

In order to determine histopathological changes associated withE6E7 expression, we performed analyses of cervical tissue obtainedfrom middle age (27–29 weeks old) E6E7 (tg/0) transgenic mice.Interestingly, these mice showed a low frequency of moderate(2/44 mice; 0.9%) or severe (3/44 mice; 1.4%) dysplasia (Fig. 3Aand Table 1). In addition, in order to determine whether RXRaablation and the presence E6E7 played a role in the pathogenesisof cervical cancer, we performed similar histopathological evalua-tion of cervical tissue from Tam-TTM. Histological examinationrevealed that, after Tam treatment, cervix isolated from youngTTM displayed moderate (11%) and severe (17%) dysplasia. Ofinterest, 61% (11/18) and 11% (2/18) of young Tam-TTM developed

in situ carcinoma and invasive carcinoma, respectively (Fig. 3;Table 1).

3.5. Increase of cell proliferation levels and inhibition of apoptosis afterRXRa ablation and E6E7 expression in the cervix of Tam-TTM

Previously, it was demonstrated that RXRa gene ablation in-duces both cell proliferation and apoptosis in cervical tissue [38].Therefore, it was investigated the effect of both RXRa ablationand the presence of HPV E7/E7 on cell proliferation and apoptosislevels in cervix of Tam-TTM. Cell proliferation levels as determinedby PCNA (Fig. 3B) and Ki-67 (not shown) nuclear cell counting, washigher for Tam-TTM than for untreated mice, RXRa (Cvx L-/L-) orE6E7 (tg/0) mice (PCNA and Ki67 levels were increased 5.6 and5.9-fold in Tam-TTM, respectively as compared with Wild typecontrols; Fig. 3, B and D). As described previously, RXRa ablationincreased the label index of apoptotic cells as determined byTUNEL and cleaved-Caspase 9 detection [38] (9.75 and 6.1-fold inRXRa (Cvx L-/L-) mice, respectively, as compared with Wild typecontrols; Fig. 4). Using the same strategy, Tam-TTM displayed thelowest apoptotic label index as compared to Wild type, RXRaTam-treated conditional or E6E7 (tg/0) mice (Fig. 4).

Fig. 3. Histological and proliferative alterations in cervical tissue after RXRa gene ablation and E6E7 viral oncoprotein expression. (A) Hematoxylin-Eosin (H&E) staining ofcervical tissue from Wild Type, RXRa conditional, E6E7 (tg/0) transgenic and Tam-TTM. Wild Type mice [RXRa (L2/L2)] showed normal transformation zone (TZ) includingcylindrical (columnar) single epithelium with transition to stratified (squamous) epithelium. Cervical tissue of Tam-treated RXRa mutant mice showed moderate epidermoidmetaplasia (solid arrows). Interestingly, both E6E7 (tg/0) and Tam-treated TTM showed undifferentiated cells and hyperproliferation of the epithelia. (B) Immunohisto-chemical detection of PCNA as cell proliferation marker in cervix of Wild type, Tam-treated conditional and Tam-treated 7 month-old TTM. Cell proliferation levels wereincreased in RXRa (Cvx L-/L-), E6E7 (tg/0) transgenic and Tam-TTM as compared with controls. (C) Tam-treated TTM showed in situ carcinomas in 56% (10/18) of cervicalsamples and the development of frequent koilocyte-like cells (not shown). In addition, these Tam-treated TTM developed cervical invasive carcinoma after RXRa ablation in11% (2/18) of the samples (red lined-yellow filled arrows). Open arrows: PCNA nuclear signal. BM: Basal Membrane. Magnification: 40X. Insets: magnification 80X. (D) Digitalanalysis of proliferation levels from murine cervical samples. After PCNA immunohistochemical detection, selected regions were digitally analyzed as described in Methods.(I) Relationship between labeling index (defined as percent of PCNA-positive cells) and histopathological diagnosis. It can be observed that there exists a correlation betweenincreases in cell proliferation (that is, labeling index) and severity of the cervical lesions. Interestingly, in (II) we observed that the increase in cell proliferation depends onthe genotype of the mice strain. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (CvxL-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. Scale bar, 50 lm.



3.6. The levels of c-myc, Bax, Bcl-2 and p21WAF1 mRNA in E6E7 (tg/0)transgenic and Tam-TTM

According to the findings related to cell proliferation and apop-tosis, we investigated the expression levels of selected genes byquantitative Real Time PCR (RTqPCR; Fig. 5). We found thatc-myc, p21/WAF1 and Bcl-2 mRNA levels were increased mainlyin Tam-TTM as compared to Tam-treated Wild type, RXRa (CvxL-/L-) or E6E7 (tg/0) mice. In addition, in Tam-treated RXRa condi-tional mice, Bcl-2 and p21WAF1 expression were diminished, sug-gesting that RXRa absence can mediate both a proliferative andapoptotic effect in cervical tissue. Thus, despite the increased levelsof p21/WAF1 expression, the presence of E6 and E7 oncoproteins inE6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM not only increased theproliferative effect in cervical tissue, but also diminished the apop-totic levels. Strikingly, E6E7 oncogene expression was sufficient toabolish the effects of the RXRa ablation, drastically bringing downthe apoptotic levels in Tam-TTM.

4. Discussion

4.1. RXRa gene ablation increases the apoptotic levels in the cervix ofRXRa (Cvx L-/L-) mice

Histological analyses, after Tam induced ablation of RXRa genein cervical epithelia [thereafter RXRa (Cvx L-/L-) mice] revealedthat the cervical epithelium from RXRa mutant mice was thinnerthan control epithelium (atrophy). Although the ablation of RXRagene increases cervical cell proliferation (see later), we haveobserved an increase in the activation of Caspase 9 in cervical epi-thelium of RXRa mutant mice compared with control mice (Fig. 4).It is known that Caspase 9 activation is a key event during theinduction of apoptosis through the intrinsic pathway [17,56].These results suggest that high apoptosis levels observed underthis condition are probably preventing tissue hyperproliferationdue to a decrease in the number of suprabasal layers and leadingto an atrophy-like phenotype (Figs. 3 and 4).

4.2. HPV E6 and E7 expression decrease the apoptotic levels in cervix ofE6E7 transgenic mice and Tam-TTM

Consistent with previous observations [18,57,58], in this workwe found that E6 and E7 expression inhibit apoptosis levels inthe cervix of both E6E7 transgenic mice and Tam-TTM, suggestingthat death programming is abrogated in cervical tissue of Tam-

TTM mice (Fig. 4). Thus, apoptosis inhibition might cooperate withthe increase in cervical cell proliferation induced by RXRa ablationin Tam-TTM. It is well known that Bcl-2 promotes cell survival,whereas Bax promotes cell death [59] and that the ratio of Bcl-2/Bax determines survival or death following an apoptotic stimulus[60]. Thus, decrease of Bcl-2/Bax ratio observed after RXRa abla-tion should dramatically increase cell death in RXRa mutant mice.In contrast, the Bcl-2/Bax ratio was increased in both E6E7 (tg/0)transgenic and Tam-TTM in comparison with Wild type animals.It is noteworthy that in the cervix of E6E7 (tg/0) mice and Tam-TTM, only a twofold increase in Bcl-2/Bax ratio (in comparisonwith RXRa mutant mice) was observed that could hardly explainthe dramatic decrease in cell death. This situation probably con-tributes to the reduction in apoptotic index observed in cervicaltissues from both E6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM(Fig. 5 and 6). It is important to mention that no definitive conclu-sion can be attained since levels of Bcl-2 and Bax proteins may notcorrelate with the mRNA levels due to the effects of E6 or E7 on therespective proteins [17,61].

E6 inactivation of p53 protein might result in overexpression ofBcl-2 and down regulation of Bax and Bak [17,62–67,68–74], con-tributing to continuous cell accumulation in cervix of E6E7 (tg/0)mice and Tam-TTM. In addition, HPV16 E6 blocks TNF-mediatedcytolysis in mouse fibroblasts [75]. Thus, continuous presence ofE6 is important for the viability of HPV-positive cancer cells, defin-ing E6 as a promising target for therapeutic intervention. More-over, ectopically expressed E6 has been associated with theinhibition of a wide range of different proapoptotic regulators thatbelong to the extrinsic death-receptor pathway (e.g. CD95 orFADD) and to the intrinsic mitochondrial pathway (e.g. Bax orBak). It is also possible that E6 activates antiapoptotic moleculescommon to both pathways, such as the c-IAP2 and Bcl-2 proteins[17,74,76,77] (Fig. 6).

4.3. Cell proliferation levels are increased in cervical epithelium ofRXRa (Cvx L-/L-) and Tam-TTM mice

Analyses of cell proliferation levels (PCNA expression) revealedpresence of abundant proliferative cells in all layers of the strati-fied cervical epithelia from Tam-TTM, whereas the signal wasfound essentially in the basal layer of Wild type mice. In contrast,a modest increase in proliferative index was observed in cervicaltissue from RXRa (Cvx L-/L-) mice while only few E6E7 (tg/0) miceshowed an increase in cell proliferation levels (Fig. 3). This obser-vation is consistent with higher levels of PCNA expression reportedin E7-expressing keratinocytes compared to wild-type keratino-cytes [58] and also in HR-HPV positive human cervical samples[78]. Our results suggest that in Tam-TTM, RXRa ablation and E6/E7 expression cooperatively contribute to increased proliferationactivity and possibly to altered terminal differentiation of the cer-vical epithelium (Fig. 3 and 6).

4.4. p16INK4A cervical cancer biomarker is increased in RXRa(Cvx L-/L-) mice and Tam-TTM

Overexpression of tumor suppressor p16INK4A is associated withhigh-grade precancerous lesions and cervical carcinomas, and ithas been demonstrated that immunohistochemical evaluation ofthis protein might be useful biomarker for identifying HR-HPV in-fected high-grade lesions [79]. The p16INK4A protein blocks cdk4and cdk6-mediated pRb phosphorylation, resulting in inhibitionof both E2F dependent transcription and cell cycle progression atthe G1 to S checkpoint [79,80]. During cervical carcinogenesisthere is an activation of both E2F and cell cycle progression sinceE7 inactivates pRb [80]. In this case it seems that the release ofE2F activates the p16INK4A promoter. Interestingly, ablation of

Table 1Histological analysis of cervical tissuesa.

Genotype Histopathological diagnosis %

Normal epithelia 84RXRa (L2/L2) Keratinized epithelia 8(n = 12) Mild dysplasia 8

Epidermoid metaplasia 47RXRa (Cvx L-/L-)b Moderate dysplasia 40(n = 15) Cervicitis 13

E6E7 (tg/0)c Moderate dysplasia 0.9(n = 44) Severe dysplasia 1.4

TTM Invasive cancer 11RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) in situ carcinoma 61(n = 18) Severe dysplasia 17

Moderate dysplasia 11

a All mice were treated with 0.1 mg Tam per day for five consecutive days.b RXRa (Cvx L-/L-) mice showed cervical atrophy in 60% (9/15) of the samples.c For this study it was included only the group of E6E7 (tg/0) transgenic mice that

showed histopathological cervical alterations.



RXRa gene in cervix of RXRa (Cvx L-/L-) induced p16INK4A proteinoverexpression (Fig. 2), This suggests that the lack of this retinoidreceptor could increase the release of E2F transcription factor acti-vating the p16INK4A promoter [81] or induce epigenetic reprogram-ming of the p16INK4A promoter [81,82]. It is well known that inmost cervical carcinomas, overexpression of p16INK4A indicatespersistent infection with HR-HPV. Of relevance in this context isthe observation that p16INK4A induction was elevated in cervical le-sions arising in Tam-TTM (Fig. 2), which suggests that TTM strainmight resemble persistent HR-HPV infection in humans. It has

been described that E7 associates and inactivates E2F6 and Bmi1(member of the polycomb group transcription repressors), bothproteins being transcriptional repressors of p16INK4A [18,81–84];repressive trimethyl marks on lysine 27 of histone 3 (H3), whichare necessary for binding of polycomb repressive complexes, aredecreased in HPV16 E7-expressing cells and HPV16-positive cervi-cal lesions. This depletion of H3K27 methylation is caused by tran-scriptional induction of the KDM6B H3 lysine 27-specificdemethylase. In addition, it was shown that E7-mediated p16INK4A

induction is independent of pRb inactivation and is mediated by

Fig. 4. Apoptotic levels in cervix of RXRa mutant mice were strongly reduced by E6E7 oncoprotein expression. (A) Apoptotic levels were measured in cervix of Wild type,RXRa (Cvx L-/L-), E6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM, using TUNEL analysis and immunohistochemical detection of Cleaved Caspase 9. As images show, low apoptosislevels were detected in E6E7 (tg/0) and Tam-TTM as compared with either Wild type or RXRa mutant mice. TUNEL Panel: Solid arrows: non-apoptotic cells; Open arrows:apoptotic cells. Cleaved Caspase 9 Panel: Solid arrows: apoptotic cells. BM: Basal Membrane. Magnification 40X. (B) Digital analysis of apoptotic levels in cervical samplesfrom Fig. 4A. After apoptosis determination assays, selected representative regions were digitally analyzed and reported as labeling index (defined as percent of TUNEL orCleaved Caspase 9-positive cells). Diminished apoptosis levels in cervix resected from E6E7 (tg/0) and Tam-TTM were clearly observed; Tam-TTM showed the lowestpercentage of TUNEL and Cleaved Caspase 9 positive cells. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. ⁄: Statistically significant (P < 0.05). Scale bar, 50 lm.



KDM6B [82]. This raises the interesting possibility that RXRa abla-tion causes the transcriptional induction of the KDMB6 demethyl-ase, cooperating with E7-induced overexpression of p16INK4A.

4.5. Gene expression levels of a set of genes associated with cervicalcarcinogenesis

In the present study, we analyzed the expression of a set ofgenes that are differentially expressed during cell proliferationand/or apoptosis and have a known association with cervical carci-nogenesis [38]. For example, increased C-Myc expression wasobserved in RXRa (Cvx L-/L-) conditional, E6E7 (tg/0) transgenicand Tam-TTM when compared with expression in the wild typemice (Fig. 5). It has been reported that retinoids convert E2F intoa transcriptional suppressor inhibiting the transcription of several

target genes including C-Myc [85]. Increased levels of C-Myc mRNAafter RXRa ablation in cervical epithelia could be partially due tothe lack of E2F repressive activity and can be associated withuncontrolled cellular proliferation in Tam-TTM (Fig. 6) [86–89].p21/WAF1, which has been shown to induce G1 arrest by inhibi-tion of cyclin-dependent kinases, has been identified as one ofthe wild-type p53-activated genes [90,91]. The repression of p21/WAF1 mRNA expression observed after RXRa ablation (Fig. 5),may partially explain the increase in cervical cell proliferation inRXRa (Cvx L-/L-) mice, suggesting that RXRa signaling is crucialfor the negative regulation of the cell cycle and for cervical homeo-stasis. The E7 oncoprotein can override p21/WAF1 inhibition ofboth CDK activity and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-dependent DNA synthesis [18,57]. The relationship between E7and p21WAF1 is paradoxical because E7 causes an increased level

Fig. 5. Relative expression (RTqPCR) of genes involved in cell proliferation and apoptosis, in cervix of mice models. The level of selected transcripts involved in cellproliferation and/or apoptosis (c-myc, p21/WAF1, Bcl-2 and Bax) was assessed by RTqPCR using specific primers. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. �: Statistically significant (P < 0.05).

Fig. 6. Model for the concerted action of HPV E6/E7 oncogene expression and RXRa ablation in Triple Transgenic Mice. RXRa deletion induces cervical cell proliferation andblocks differentiation mechanisms cooperating with cellular transformation. E6 and E7 oncoproteins can cooperatively induce an increase of cell survival and cellproliferation levels. In sum, it is proposed that the development of in situ carcinoma and invasive cervical cancer in middle age Tam-TTM is induced by alteration of severalcell control mechanisms. For details see Discussion. Up arrows: indicate overexpression or activated pathway. Down arrows: indicate underexpression. �: Molecules orcellular processes analyzed in this work. HAT: Histone acetyltransferase. HDM: Histone demethylase.



of p21/WAF1 protein in human and mouse cells/tissues [18,58,92]and at the same time E7 can inactivate p21/WAF1 [18,57,58].Accordingly, p21/WAF1 was overexpressed in Tam-TTM cervix ascompared to normal cervical tissue probably due to E7 oncoproteinexpression. These data suggest that, in the Tam-TTM model, RXRaablation and E6 together with E7 expression cooperatively in-creased the frequency of pre-malignant or malignant cervical le-sions inactivating the tumor suppressor function of p21/WAF1and inducing cervical carcinogenesis.

The main finding of this work was the detection of in situ carci-noma (61%) and invasive carcinoma (11%) in the cervix of middleage Tam-treated TTM, suggesting that lack of RXRa retinoid recep-tor coupled with expression of HPV16 E6 and E7 oncoproteins maycontribute to carcinogenesis. Our findings suggest that induction ofcervical cancer in Tam-treated TTM could prove a valuable modelfor the diagnosis and prognosis of cancer. The TTM model can befurther utilized to identify cofactors involved in cervical carcino-genesis. The use of a conditionally expressed retinoid receptor inmice that express HR-HPV16 E6E7 oncoproteins, may improvefuture studies by allowing the identification of early tumoral bio-markers during the development of cervical cancer.

Acknowledgements

We are grateful to Dr. Pierre Chambon and Dr. Daniel Metzger(IGBMC, CNRS, INSERM, Université Louis Pasteur, Illkirch-Cedex,Strasbourg, France) for the kind gift of their invaluable RXRa con-ditional mouse model and for helpful discussions. We would like tothank Dr. Diana Escalante-Alcalde (IBT-UNAM), Biol. ElizabethAlvarez, Biol. Enrique García and Mr. Lauro Macías (CINVESTAV-IPN, Mexico) for technical support. This work was supported byCONACyT (Mexico) and ICGEB, CRP Programme, Trieste, Italy. PGwas supported by a UICC Translational Cancer Research Fellow-ship, funded by Novartis (Switzerland). ECS was supported by thescholarship ‘‘Ligue Contre le Cancer comité de Bas-Rhin’’.

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