DETERMINACION DE LA BIOMASA

I. INTRODUCCION

En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el número de

microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en

estudio de curvas de crecimiento, análisis de alimentos, preparaciones de inóculos para

fermentación, etc. (Aquiahuati, 2004).

Un parámetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de

tratamiento de efluentes líquidos es la concentración de biomasa. Biomasa es un término

general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas

maneras de medir la concentración de biomasa, como por ejemplo masa, volumen,

extensión linear de filamentos, dispersión de luz, conteo de células u organelas.

Existen diferentes métodos para cuantificar el número de microorganismos o peso

(biomasa) de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e

indirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinación de peso seco y el

recuento de células en cámara de Neubauer (Aquiahuati, 2004).

La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utilizado en cultivos

de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a

varios procesos (filtración, lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de

biomasa y errores en la cuantificación. El método de cuenta directa en cámara tiene la

ventaja de ser muy rápido y económico, aunque no se pueden distinguir las células viables

y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una muentra a partir del

volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo,

tiene el inconveniente de que la observación y cuantificación de dificultan en células muy

pequeñas (1 – 5 µm) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de

muestra que se utiliza (0.1 – 0.2 mm3) (Aquiahuati, 2004).

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II. OBJETIVOS

Dominar el uso y lectura en la Cámara de Neubauer por método de conteo directo.

Conocer las técnicas para aplicar las fórmulas de conteo.

Determinar la concentración de microorganismos (levaduras) a través del

microscopio, utilizando la cámara de Neubauer.

III. FUNDAMENTO TEORICO

Cámara de Neubauer

La Cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en cultivo celular para realizar conteo

de células en un medio de cultivo líquido. Consta de dos placas de vidrio, entre las cuales

se puede alojar un volumen conocido de líquido. Una de las placas posee una grilla de

dimensiones conocidas y que es visible al microscopio óptico.

Para contar las células de un cultivo líquido, se agrega una gota de este entre estas dos

placas y observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un campo

determinado de la grilla.

Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que

admite el campo de la grilla, se calcula la concentración de células por unidad de volumen

de la solución de medio de cultivo inicial.

Figura 1. Cámara de Neubauer.

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La imagen simula el campo que está viendo al microscopio con un objetivo de 45x. Solo

es visible el centro de la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de derecha-

izquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Muy

importante: Cuando la muestra observada se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la

izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de

las líneas inferior y/o de la derecha.

Figura 2. Forma de manipulación de la cámara de Neubauer.

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro

o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el

fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que

se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas

consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1

milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a

la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie

marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos

es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

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Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las

cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: concentración en la

suspensión (células / mL) = 10000 (x/4).

Conteo en cámara de Neubauer

Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.

• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.

• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, este debe quedar

centrada.

• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución

de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya

que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.

• La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de

llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es

de líquido abundante en las terminaciones del recuadro.

Conteo: Lleve la cámara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de

4X.

Figura 3. Representación de la cuadrícula de la cámara de Neubauer con el ocular

de 4X.

Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc.,

ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X.

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Figura 4. Representación de la cuadrícula de la cámara de Neubauer con el ocular

de 10X.

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes

en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que

garantiza un conteo aleatorio

Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los

campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en

todos los cuadros.

El conteo en estos campos de la cámara de conocer como AP (alto poder). Con el lente de

40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:

Figura 5. Representación de la cuadrícula de la cámara de Neubauer con el ocular

de 40X.

Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el

conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no

se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el

cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células

son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la

segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen.

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Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X

son las que no se deben contar.

Figura 6. Orientación que se debe seguir para el conteo de microorganismos usando la

cámara de Neubauer.

Figura 7. Conteo de células en cuadrados terciarios.

Después de contar las células se procede a calcular la el número de células por unidad de

volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido en

el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y

la laminilla de cuarzo.

• Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo, se multiplica

por el factor de dilución y por un factor F igual a 106 si se contó el cuadro central o 104 si

se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor X.

1ml del preinoculo ________________ X esporas

? ________________ Esporas a inocular

Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a

desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.

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IV. MATERIALES Y METODOLOGIA

A. MATERIALES

Pipetas Pasteur

Lámina cubre objeto

Levadura instantánea (Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae)

Agua destilada

B. EQUIPOS

Microscopio

Cámara de Neubauer

Balanza analítica Sartorius CPA224S, Max 220g, d=0.1mg.

C. METODOLOGIA

En 50 ml de agua destilada se agregó 0.5 gr de levadura, se homogenizó la

muestra para que así no forme grumos.

Se limpió con papel toalla la cámara de Neubauer.

Se colocó el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones

laterales de la cámara, donde se aprecia una zona cuadriculada.

Con ayuda de una pipeta Pasteur, se obtuvo una pequeña de muestra del tubo de

ensayo, y se colocó en el borde del cubreobjetos. Se dejó que la solución ingrese a

la cámara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales.

Luego que la muestra ingresó por la cámara de Neubauer, se dejó reposar, y

posteriormente, se colocó en el microscopio.

Se realizó la cuantificación de células en las zonas de los cuadrados más pequeños

de 0.05 mm., tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma célula

u omitir alguna.

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Luego de calcular las células en los cuadrados intermedios, extremos y los

determinados al azar, se calculó la media de células por cuadrado, y por medio de

la siguiente fórmula, se determinó el número de células por mililitro.

Nºlevaduras

ml= x

superficie deconteo (mm2) × profundidad de lacamara (mm )× dilu cion

Figura 1. Fórmula recuento (Levaduras/mL) en cámara de Neubauer

V. RESULTADOS

Tabla 1. Número de levaduras contabilizadas

LISTAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 6 12 11 11 28 11 13 10 12 9 17 82 13 14 16 9 7 10 8 11 16 17 7 113 9 12 10 25 9 18 14 25 17 20 9 174 9 5 5 11 12 7 5 9 11 8 7 115 10 18 9 6 12 15 12 5 16 9 10 106 8 8 10 13 5 18 6 8 17 8 12 57 16 21 13 10 6 10 13 15 16 12 19 208 6 11 18 15 11 16 24 4 17 11 22 119 18 10 13 16 27 13 10 8 12 8 25 810 20 6 10 14 15 7 12 17 15 12 12 1011 13 10 7 4 12 15 12 23 12 12 9 1712 15 15 21 10 10 20 15 13 11 14 4 1113 12 10 12 16 8 17 9 18 11 20 9 714 11 13 13 11 10 9 8 7 13 5 16 2015 10 8 8 16 16 22 19 17 6 12 13 616 19 24 7 12 21 7 9 7 5 9 12 23

Sumas 195 197 183 199 209 215 189 197 207 186 203 195Promedio 12.19 12.31 11.44 12.44 13.06 13.44 11.81 12.31 12.94 11.63 12.69 12.19

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13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2511 11 6 10 18 10 8 8 10 13 19 10 1415 12 25 7 16 10 10 12 24 11 12 15 914 9 14 12 11 21 17 10 21 10 17 6 920 8 11 6 6 12 13 21 9 13 11 5 108 8 12 12 11 9 14 13 14 18 14 18 1610 14 6 5 10 10 10 14 6 6 6 13 1815 13 26 7 21 15 8 9 22 6 11 21 2015 13 5 16 16 9 6 8 6 11 10 10 1313 12 5 14 14 10 12 10 6 10 13 21 810 18 24 8 8 11 22 9 24 14 10 10 129 21 13 19 12 7 10 17 15 20 21 24 516 10 15 11 17 8 5 9 17 18 13 16 1411 7 6 23 10 12 15 7 7 15 14 18 44 14 7 20 7 8 12 13 8 18 11 6 2311 5 9 11 16 15 8 16 4 19 17 5 269 9 22 8 11 21 13 16 20 10 6 17 11

191 184 206 189 204 188 183 192 213 212 205 215 21211.94 11.50 12.88 11.81 12.75 11.75 11.44 12.00 13.31 13.25 12.81 13.44 13.25

Tabla 2. Promedios finales después del conteo de levaduras.

Promedio Final 12.42Desviación Promedio 0.6646976Coef. Variabilidad 0.8152899

A. Cálculo de las levaduras / ml:

Nºlevaduras

ml= 12 levaduras

0.05 mm2 x0.05 mm2 x 0.1mm

Nºlevaduras

ml=48 x 106 levaduras/ml

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VI. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

Se pudo determinar el promedio de levaduras (s. cerevisiae) contadas en la muestra de 12,

por el método de conteo directo, usando la cámara de Neubauer, que constituye un

método eficaz para el conteo de dichas levaduras.

Madigan et al (1998), utiliza el método de conteo directo en cámara de Neubauer. Para

dicho método utiliza la fórmula expresada en Figura 2, mostrando diferencia a la utilizada

para el recuento de levaduras en laboratorio (Figura 1.).

Figura 2. Fórmula recuento (Levaduras/mL) en cámara de Neubauer.

Fuente (Madigan et al, 1998).

Por otra parte, la concentración de levaduras (levaduras/mL) encontradas, por el método de

conteo directo en la cámara de Neubauer fue de 48 x 106 levaduras/ml.

Los datos encontrados después del conteo nos arrojan valores promedios de levaduras, con

una desviación estándar de 0.67, por consiguiente un coeficiente de variación de 0.82. De

los datos anteriores nos podemos dar cuenta que el coeficiente de variación es mayor al

30%. Esta diferencia se pudo deber a la no homogeneidad de la muestra de levadura

analizada.

VII.RECOMENDACIONES

Se recomienda agitar la muestra antes de utilizarla, para obtener una muestra homogenea.

Realizar el llenado correcto de la muestra en la cámara, sin que esta caiga en la lámina

cubreobjeto. Luego de su uso limpiar la cámara de Neubauer con agua tibia

Utilizar el zoom adecuado, con la finalidad de observar de manera más clara las levaduras

con el fin de facilitar el conteo.

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VIII. BIBLIOGRAFIA

UNAM, (1986); “Biología Celular”, Manual de Prácticas. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad autóctona de México. Pág. 20 – 28.

AQUIAHUATI M. (2004), Manual de Prácticas: Laboratorio de Microbiología Celular, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnología, 1era Edición, Pág. 63-68.

MADIGAN M. et al (1998). Brock Biología de los microorganismos Octava Edición, Prentice Hall, España, P. 155 – 156.

Manual de Pràcticas de Microbiología Básica. Hernano Valencia. Universidad Nacional de Colombia. 2001.

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ANEXOS

Entre las ventajas y desventajas de este método se tiene lo siguiente:

VENTAJAS DESVENTAJAS

-Es rápido -La cantidad de muestra analizada es poca

-Los frotis se pueden guardar -Provoca cansancio del operador

-Las exigencias de equipo son mínimas-Sólo sirve para muestras con cargas

superiores a 10.000 por ml

-Se pueden observar las diferentes

morfologías de los microorganismos.

-Es difícil distinguir los microorganismos de

las partículas de muestra

-Se observan tanto los microorganismos

viables como los no viables

-Una inadecuada distribución de la muestra

sobre la superficie del portaobjetos puede

ocasionar serios errores.

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