Post on 18-Jan-2020
La biotecnologia y la diversidad genética de la papa nativa bajo el Tratado
Internacional en el CIPDavid Tay, Ph.D. (d.tay@cgiar.org)
Lider de la División de Conservación y Caracterizac ión de Recursos Genéticos
Centro Internacional de la papa (CIP)
ALAP 2010 – Cusco, PeruALAP 2010 – Cusco, Peru
Banco de Germaplasma en el CIP
CIP La MolinaLima, Peru
Misión
• Asegurar la conservación y distribución a nivel global de las colecciones de papa, camote, raíces y tubérculos andinos en custodia, en forma segura y con alta calidad
• Mejorar la utilización , mediante documentación on line de información pasaporte, caracterización y evaluaciones importantes completa.
• Asegurar la conservación y distribución a nivel global de las colecciones de papa, camote, raíces y tubérculos andinos en custodia, en forma segura y con alta calidad
• Mejorar la utilización , mediante documentación on line de información pasaporte, caracterización y evaluaciones importantes completa.
La conservación Global de papas nativas “en custodia” en el CIP
La conservación Global de papas nativas “en custodia” en el CIP
4,235 accesiones4,235 accesiones
Nueve especies cultivadas (Ochoa, 2003)Nueve especies cultivadas (Ochoa, 2003)
S. ajanhuiri (2x) 14S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36S. t. tuberosum (4x) 163S. t. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6
S. ajanhuiri (2x) 14S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36S. t. tuberosum (4x) 163S. t. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6
S. stenotomum (1-7); S. goniocalyx (8-12); S. phureja (14-15): S. x ajanhuiri (13); S. x juzepczukii (16-19); S. x chaucha (20-23); S. tuberosum ssp. andigenum (24-42); S. x curtilobum (43-44), S. tuberosum ssp. tuberosum (45)
Países donantes de la colección “en custodia”
5454 3232 3232 11 3737253253 361361
26942694
541541
206206 14314300
500500
10001000
15001500
20002000
25002500
30003000
PaísesPaíses
Acc
sA
ccs
Cv. criollosCv. criollos NativasNativas
Conservación de papa cultivada en el CIP
Bancos de genes* In vitro /Crio * Campo
* Semilla * Tubérculos
Ex situ In situ
* Habitad natural
* Parcelas campesinas
Conservación dinamica
Conservación de Papa In vitro y criopreservación
6-8°C(2 años)
18-22°C(1 año)
Banco – Criogénico(LTS)
Banco In Vitro(MTS)
CIP: El pionero en applicación de la
Biotecnologíaen banco de germaplasma
-196°C(¿100 años o mas?)
Biotecnología- En conservación y distribución de germoplasma
1973–1984: • Cultivo de tejidos para almacenamiento de papa y transferencia Internacional (Roca et al ., 1975, 1978,1979; Wescott et al ., 1977)
• 1975 - Criopreservación de papa (Grout et al.)• Eliminación de patógenos (Schilde & Roca, 1983; Lizarraga, et al., 1983)• Cultivo In vitro de papa por crecimiento lento (Estrada et al., 1983)• Tuberización in vitro de papa (Schilde et al., 1984)• 1977-79 - Eliminación de duplicados con electroforesis de proteínas e isoenzimas
1985–1993: • Multiplicación rápida de papa (Dodds, et al. 1992)• Prueba de virus (Jayashinge & Salazar, 1993)
1994–2000: • Técnicas de eliminación de patógenos mejoradas (Golmirzaie et al., 1997)• Criopreservación de papa (Golmirzaie & Panta, 2000)
Continuación…
2001–2007: • Código de barras para monitoreo de la colección de germoplasma In vitro (Rojas, et al., 2005)
• Método mejorado de criopreservación de papa (Panta, et al. 2006)• Métodos de eliminación de virus mejorados
2007 a la fecha:
• Copias de seguridad (Espinoza, et al., 2008)• Accreditación ISO 17025: Buenas prácticas para conservación y distribución in vitro
• Validación de métodos de conservación y criopreservación (colaboración con los Bancos de CGIAR )
• Estudios de estabilidad genética entre tubérculos, In vitro y accesiones criopreservadas.
Tipo de Material:
Germoplasma (G)
Investigación (R)Estado Sanitario:
HS0, HS1, HS2
Período de Almacenamiento:
Permanente, Transitorio
Papa: 9,643 acc.
Evaluación de sobrevivencia y recuperación (30 y 60
después de descongelamiento)
- 75% de acc. con ≥ de 20% de recuperación;
- 5% no sobreviven
Criocolección de papa (CIP)
* S. Dussert et al., 2003.
Cultivo in vitro (6°C) (3 semanas)
Aislamiento de ápices meristemáticos
Método de vitrificación de la “pequeña gota” de PVS2
Almacenamiento de 100 muestras por entrada (acc.
con 95% de probabilidad de recuperación)*
Monitoreo de viabilidad
Cultivares Nativas:800 acc criopreservadas
Protocolo de eliminación de virus en papa
Introducción de explantes
in vitro
(1 mes)
(1 mes)
Termoterapia 32-34°C5
(2-3 meses)
Cultivo
de meristemos
6
Evaluación y diagnóstico
(3 meses)
8
Plantas libres de patógenos
Siembra en macetas y
pruebas iniciales de
sanidad
(2 meses)
12
Multiplicación para
termoterapia
(1 mes)
4
Multiplicación para
pruebas virológicas
(1 mes)
7
Multiplicación inicial y
pruebas fitosanitarias3
(4 meses)
NASH: PSTVd y PVT
ELISA: 8 viruses
Plantas indicadoras (11sp.)
Inspección visual
NASH: PSTVd and PVT
ELISA (8 virus): PVS, PVY, PVX, APLV, PLRV, APMV, PYV, y AVB-OPlantas indicadoras (11 sp.):Inspección visual
B. Zea, G. Muller, C. Chuquillanqui, A. Panta, May 2010
In vitro Facilities Virology
OfficeSerology
LaboratoryThermotherapy
ADU
Virus testing greenhouse
Outside CIP& CIP
Medium Preparation
Area
GreenhouseQuarantine Active Collection
OfficeGADC In vitro Potato
Long term Collection Cleaning Transfer roomInternal QuarantineOffice
NashDas-Elisa
1 month (4 tubes)
Meristem excision and culture 6 meristemsCulture
2-3 months
Select the best 3 clones Multiplication
3 tubes
Select the 1 clone
Move to In vitro Bank as HS0 or HS1
If PSTVdPositive
Incinerate
If all clones are positive
NashDas-Elisa
Store Pathogen tested
clone HS2Host Range
Introduce in vivo material into in vitro according to the protocol for introduction to in vitro culture.
Host Range
Send request Evaluate request
Quarantine process according to the protocol for in vitro quarantine
Receive result
Send material
Introduction to In vitro
Receive notificationSend list material
Multiplication of mother plant
In vitro plantlets from outside CIP
In vitro plantlets from CIP genebank
Get samples HS0 – HS1
Culture
Select 1 clone
Bacteria TestingBacteriaelimination
HS0 (unknow HS) or HS1
Multiplication
Positive virus - select next clone
Bacteria TestingBacteriaelimination
Multiplication
Multiplication
Move to In vitro Bank as
HS2
Legend
TubersIn vitro plantlets from outside CIP In vitro plantlets from CIP genebank PositiveNegativeAll clones are positive
Identity verificationTrue type clone
Distribution
Review by A.panta and L.Rojas, Octubre 2009
Tubers
Bacteria TestingBacteriaelimination
Multiplication into 2 tubes
HS0 (virus positive)
If PSTVdPositive
Incinerate
HQU
Quarantine
Culture
Quarantine process according to SENASA
Proceso de eliminación de virus en papa
Estado Actual
• Protocolos y procedimientos estándarizados
- Desde 2008
- Auditorías internas y externas
• Acreditación ISO 17025
- Código de barra (100%)
- Base de Datos (Conección
inalámbrica) para el manejo de la
colección in vitro
• Flujos de Trabajo en gráficos (muchos)
• Documentación
Eliminación de Duplicados(1970s – 1990s)
17,300 accesiones
4,235 accesiones
Fuente: www.msu.edu/~douchesd/fingerprint.html
Nueva Generación de Marcadores Genéticos en
los Bancos de Germoplasma
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2010
Microsatélites(SSR)
SCAR
Isoenzimas
RAPD
RFLP
DArT
Año
AFLP
Evolución de los marcadores genéticos
SNP
Jonathan FengShuBaiXushu18
Jewel
Wagabolige
Yanshu1
Beauregard
I. trifidaparent 1
I. trifidaparent 2
Jonathan FengShuBaiXushu18
Jewel
Wagabolige
Yanshu1
Beauregard
Jonathan FengShuBaiXushu18
Jewel
Wagabolige
Yanshu1
Beauregard
I. trifida
I. trifida
Marcadores moleculares para la Caracterización de Bancos de germoplasma
Marcadores diseñados para:-Huella genética – “Carnet de identidad”
para accesiones del Banco-Análisis de Diversidad/ Colección ‘Core’-Estudios Taxonómicos-Selección de progenitores con alta
diversidad-Desarrollo de poblaciones
Asociación de marcadores a Caracteres(A través de QTLs o Análisis de segregantes en Bulk):
-Selección asistida por Marcadores -introducción de genes dentro de un pool genético deseable
-Piramidación de QTLs-Predicción de Fenotipos
(Fuente : Roland Schafleitner)
Kit de Identidad Genética de Papa (PGI): ESTANDARIZACION DEL PESO DE LOS
FRAGMENTOS PARA LA GEMOTIFIPICACION DE PAPA
•Ghislain et. al. (2009). Robust and highly informative microsatellite-based genetic identity kit for potato. Mol Breeding (2009) 23:377–388.
•Ghislain et. al. (2004). Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs) for genotyping of cultivated potato. Theor Appl Genet (2004) 108:881–890
Kit de identificación para papa basado en 24 marcadores SSR
Iniciadores AFLP seleccionados para la genotipificación de papa
Sistema LI-CORSTM1104
STI0014
E42_M49
•CIP (1997). Molecular Biology Laboratory Protocols: Plant Genotyping. Ghislain M, Zhang D, Herrera R (Eds.). Genetic Resources Department, training manual, CIP, Lima, Peru.
•Vos et. al. (1995) . AFLP A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research 23: 4407-4414
Evaluación Morfológica: Evaluación Molecular• 32 descriptores • SSR 24 primers
Verificación de integridad genética de colección tubérculos, in vitro y criopreservación
Microsatélites
Dodds (1962) Hawkes (1990)* Ochoa (1990, Huaman & Spo oner et al. 1999) Spooner (2002) (2007)
2x -------- S. ajanhuiri S. X ajanhuiri S. tuberosum S. ajanhuiriAjanhuiri Group
S. tuberosumGroup Stenotomum S. stenotomum S. stenotomum Stenotomum Gp S. tuberosumSubgroup Goniocalyx ssp. goniocalyx S. goniocalyx Andigenum Gp (2x)Subgroup Stenotomum ssp. stenotomum
Group Phureja S. phureja S. phureja Phureja Gp Subgroup AmarillaSubgroup Phureja
3x S. tuberosum S. chaucha S. X chaucha S. tuberosumGroup Chaucha Chaucha Gp Andigenum Gp (3x)
S. X juzepczukii S. juzepczukii S. X juzepczukii Juzepczukii Gp S. juzepczukii
4x S. tuberosum S. tuberosum S. tuberosum S. tuberosumGroup Andigena ssp. andigenum ssp. andigenum Andigenum Gp Andigenum Gp (4x)Group Tuberosum ssp. tuberosum ssp. tuberosum Chilotanum Gp Chilotanum Gp
S. hygrothermicum
5x S. X curtilobum S. curtilobum S. X curtilobum Curtilobum Gp S. curtilobum
La taxonomía de papas nativas
4,235 accesiones
S. ajanhuiri (2x) 14 14 S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36 36S. t. ssp. tuberosum (4x) 163S. t. Chilotanum Group 163S. t. Andigenum Group 3865S. t. spp. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6 6
S. ajanhuiri (2x) 14 14 S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36 36S. t. ssp. tuberosum (4x) 163S. t. Chilotanum Group 163S. t. Andigenum Group 3865S. t. spp. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6 6
Ochoa, 2003 Spooner et al, 2007
Implicación:
• S. phureja � Anexo 1 (IT)
adg
tbr
cha
Biotecnologia –Marcadores SSR (Spooner et al., 2007)
cha
cha
stnstn
stnstn
phu
cha
cha
¿Confirman la clasificación de Hawkes y
Ochoa?
Una necesidad de seguir estudiando…• Hawkes (1956) – 8 especies y 22 especies sinónimos• Bukasov (1971) – 21 especies• Ochoa (1990,1999) – 9 especies y 141 taxa infraespecíficos
Sistema taxonómico indígena +
Concepto de Grupo Cultivar (ICNCP)
(Incorporando datos morfológicos, geográficos, citológicos, FISH, mayor numero de
marcadores. Ej. DArt, SNP, cloroplastos, mitocondrial, secuencias, etc.)
Marcador DArTMuestras de clones diversos
Reducción de complejidad(Digestión con enzimas de restricción,
Selección de tamaños
Chip
Selección de
fragmentos
polimórficos
Representación de genoma
ADN
DArT
microarreglos
•Secuencias independientes
•Método de alto rendimiento y bajo costo
•Descubre ~1000 marcadores en un solo ensayo
Jonathan FengShuBaiXushu18
Jewel
Wagabolige
Yanshu1
Beauregard
I. trifidaparent 1
I. trifidaparent 2
Jonathan FengShuBaiXushu18
Jewel
Wagabolige
Yanshu1
Beauregard
Jonathan FengShuBaiXushu18
Jewel
Wagabolige
Yanshu1
Beauregard
I. trifida
I. trifida
(Fuente: A. Kilian)
4x trifida
6x batatas
4x tabascana
Localización de genes en el cromosoma
Estudiar las relaciones entre especies
Estudiar los cambios cromosomales durante la especiación
Estudiar la estructura del cromosoma
FISH nos permite:
Grupos genéticos del 18S (verde) y 5S (rojo) en camote y 2 posibles progenitores (Fuente: Jan Kreuze)
Uso y Beneficiosde la
Colección de papa nativa bajo el Tratado Internacional
• 17,617 muestras distribuídas a 143 países
• 3,600 muestras de más de 1,250 (30%)accesiones de papa nativa de alta calidad fueron repatriadas a 41 comunidades en los últimos 10 años
Distribución de papa cultivada:
Cultivares mejorados
Finalmente –Deseamos que la diversidad sea utilizada
Papas nativas
Beneficios: Programa de Mejoramiento del CIP
• 9,062 muestras distribuídas dentro del CIP
• 5.6% utilizado - 246 accesiones (de 4,354 nativas & cultivares criollos) usados en cruzamientos
•
• 30% de representación - 6,324 cruzes (de 20,922) con al menos una de 246 accesiones en el pedigree
Impacto en Peru
Canchan (22.4%), Perricholi (7.6%), Amarilis (7.1%), Unica (0.3%), Atahualpa (0.1%), Chata roja (0.1%)
Santa Ana, Maria Huanca, Wankita (INIA 308), Tahuaqueña, INIA 301, Kori-INIA, Haille, Costanera, Muru, Yana, UNALM GUISI, Chagllina-INIA, Puneñita (INIA 307), INIA 305, Colparina (INIA 308), Maria Tambeña, Reiche, Maria Bonita-INIA, Tacna, Desertica, Serranita INIA 309 , Primavera, Chucmarina, Puca Lliclla INIA 312, Pallay Poncho INIA 311, Chacasina, Molinera, Caxamarca, Molinera II, Amapola, San Juan
37 variedades liberadasCanchan
Impacto en América Latina
Bolivia: Chaposa, Jaspe, Runa Toralapa (Iscayachi), Potosina, PampeñaColombia: Zipa, NovaCosta Rica: Birris, Floresta, IDIAFRITEcuador: Fripapa 99, Margarita, Rosita, Santa Rita, BastidasGuatemala: Paquix, Xalapan, MercedesPanama: IDIAFRIT, IDIAP 92, PRECODEPAParaguay: Villa SerranaVenezuela: Andinita, Tibisay
24 variedades liberadas
Runa Toralapa (Iscayachi),
Estratégias para crea mas impacto
• Tratado Internacional• Cuarentena Internacional eficiente –
diagnóstico de enfermedades• Buena información de evaluación• Base de Datos en web• Colección núcleo (Core) / set de
referencia (GCP)
4,235 acc. – Tratado Internacional
• http://www.planttreaty.org/• Acuerdo de Transferencia de Material
Estándarizados (SMTA)• Firmado por: Argentina, Brazil (r), Chile, Colombia,
Costa Rica (r), Cuba (r), República Dominicana, Ecuador (a), El Salvador (r), Guatemala (r), Haiti, Honduras (a), Nicaragua (a), Panamá (a), Paraguay (ac), Perú (r), Uruguay (r), Venezuela (r)
Nueva Tecnología: Secuenciamiento detallado en la identificación y caracterización de virus
1 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000
MOVEMENT PROTEIN
COAT PROTEIN
REPLICASE
6222 nt
Fragmentos
del ARN viral
Genoma del virus ensamblado a partir de los fragmentos
Fuente: Wilmer Cuellar (Ver su poster para mas detalles)
Protocolos actuales – ~18 mesesNuevas tecnologías – ~3 meses
Evaluación después de 3 semanas de cultivo in vitro siguiendo tratamientos con Poli-etilene glicol (PEG)
Evaluación de respuesta de papas nativas a estrés hídrico*
•Altura de planta
•Longitud de raíz principal
•Número de raíces
0 10 20 40 80 100
PEG (g/L)
* Tesis de MSc, Elise Vendeuvre
Respuesta de papa al efecto de 8 niveles de NaCl en términos de altura relativa
0
10
20
30
40
50
60
70
0.04 0.06 0.08 0.12 0.16 0.20 0.28 0.40
Niveles de NaCl (mM)
Altu
ra r
elat
iva
(%) Desiree
Piñaza
Sierra Volcan
Tacna
Waca Corota
Wila Yari
(M)
* Tesis de MSc, Carmen Maza (Ver su presentación para mas detalles)
Análisis de asociación genética
Germoplasma panel
Genotipos con fenotipos tolerantes
a stress contrastables
Genotipificación Fenotipificación
QTLs para tolerancia a stress relacionado a
caracteres
Alelos para tolerancia a stress
Marcadores para alelos con tolerancia
a stress
Análisis de asociación genética
(Fuente : Roland Schafleitner)
Formación de Colección Núcleo – Un ejemplo
Huaman et al., 2000
Spooner et al., 2007Accesiones
Núcleo 306 251 (4x)
Común 136 136
Diferente 172 115
S. tuberosum ssp. andigenum10% de 3,148 accesiones = 315 accesiones
CIP Online Database
1
2
3
�Botany, Taxonomy, Geography, Population Genetics, Ecology, Seed Science & Technology, Logistics, etc.
Acquisition
Regeneration
Conservation
Characterization
Evaluation
Distribution
Utilization
Documentation
Genebanking StepsGenebanking Steps Scientific DisciplinesScientific Disciplines
�General Horticulture, Seed Production & Technology, Plant Pathology, Entomology, etc.
�Seed Science and Technology, Refrigeration Design & Engineering, Tissue Culture, Cryopreservation, etc.
�Morphology, Anatomy, Taxonomy, Genetics, Molecular Biology, Statistics, Physiology, etc.
�Statistics, Genetics, Physiology, Pathology, Entomology, Biochemistry, Pharmacology, etc.
�Pathology, Entomology, Seed Technology, Tissue Culture, Quarantine, etc.
�Germplasm Enhancement, Plant Breeding, Biotechnology, Nutra- & Pharmaceutical Uses, etc.
�Computer Science, GIS, Taxonomy, Statistics, etc.
Flow of germplasm materialsFlow of germplasm information
La Ruta Condor: Una red de conservación in situ de la agrobiodiversidad a lo largo de los Andes
Fuente mapa: Ricardo Espinosa, 2002. La Gran Ruta Inca.
Parque de la papaCusco Per
Oruro Bol
Potosi Bol
Chimborazo Ecu
Carchi Ecu
Huancavelica Per
Huanuco Per
Cajamarca Per
Jujuy Arg
Merida Ven
Gracias!