TRABAJO FIN DE MÁSTERTRABAJO FIN DE MÁSTERTRABAJO FIN DE MÁSTERTRABAJO FIN DE MÁSTER presentado por

Natalia Serrano Morillas

CENTRO DE GENÉTICA CENTRO DE GENÉTICA CENTRO DE GENÉTICA CENTRO DE GENÉTICA

CARDIOVASCULARCARDIOVASCULARCARDIOVASCULARCARDIOVASCULAR INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN

BIOMÉDICA DE GIRONA

DIRECTORESDIRECTORESDIRECTORESDIRECTORES

Dra. Fabiana Scórnik Dr. Guillermo Pérez

EL PAPEL DEL DOMINIO EL PAPEL DEL DOMINIO EL PAPEL DEL DOMINIO EL PAPEL DEL DOMINIO

CENTRALCENTRALCENTRALCENTRAL DEL DEL DEL DEL

CANAL BKCANAL BKCANAL BKCANAL BKCaCaCaCa

...EN LA TRANSDUCCIÓN…

…INTRAMOLECULAR DE SU…

…MODULACIÓN…..

El Doctor Guillermo Pérez y la Doctora Fabiana Scórnik, profesores lectores de la

Universitat de Girona y responsables de la unidad de Electrofisiología del Centro de

Genética Cardiovascular (GENCARDIO), IDIBGi.

CERTIFICAN:

Que Natalia Serrano Morillas ha realizado las prácticas correspondientes al Módulo

Práctico y al Trabajo Final del Máster de Biología Molecular y Biomedicina en la unidad

de Electrofisiología del Centro de Genética Cardiovascular (GENCARDIO); las cuales,

le han servido para la redacción de esta memoria titulada “El Papel del Dominio

Central del Canal BKCa en la transducción molecular de su modulación”.

Girona, 27 de Junio del 2014

Natalia Serrano Morillas Dr. Guillermo Pérez Dra. Fabiana Scórnik

ABSTRACT

The large conductance calcium-activated potassium channel (BKCa) is widely expressed in a

variety of tissues, and plays an important role in numerous physiological processes. A salient

feature of this channel is its regulation by both voltage and calcium. The channel presents a

modular structure that includes a transmembrane domain (core) containing the voltage sensor

and the pore, and a cytosolic domain (CTD), containing the calcium binding sites. An area of

interest in the study of this channel includes the functional properties of the core and the

allosteric interactions between the core and the CTD. In addition, the role of each of these

domains in the modulation of the channel by various activators and inhibitors is not completely

understood.

The central hypothesis of the present work is that the previously described DiBAC4 (3)-induced

activation of the BKCa channel, and the influence of the β1 subunit on this activation occurs

directly on the core, independently of the CTD.

To investigate this hypothesis the BKCa-core channel (without CTD) was subcloned into the

pcDNA3.1 (+) plasmid for its expression in mammalian cells (CHO-K1 and HEK293). The

resulting current was characterized electrophysiologically in both cell lines. It was observed that

BKCa-core currents exhibit pharmacological characteristics similar to the canonical BKCa

channel. Immunofluorescence experiments indicated that the BKCal-core channel is located at

the plasma membrane of HEK293 cells. These preliminary results are promising for further

studies since they demonstrate, for the first time, the possibility to express the core domain of

the BKCa channel in a mammalian cell model.

RESUMEN

El canal de potasio activado por calcio de gran conductancia (BKCa) está ampliamente

expresado en diversos tejidos y juega un importante papel en numerosos procesos

fisiológicos. Una de sus características salientes es su regulación tanto por voltaje como por

calcio. La estructura modular del canal incluye un dominio transmembranal (core) que contiene

al sensor de voltaje y al poro, y un dominio citosólico (CTD) que contiene sitios de unión a

calcio. Un área de interés sobre los canales BKCa es el estudio de las propiedades funcionales

del core y las interacciones alostéricas entre el core y el CTD, así como el papel de cada uno

de estos dominios en la modulación del canal por diversos activadores e inhibidores.

La hipótesis central de este trabajo es que la activación canal BKCa por el colorante DiBAC4(3)

y la influencia de la subunidad β1 sobre ésta ocurre sobre el core del canal,

independientemente del CTD.

Para investigar esta hipótesis se subclonó el canal BKca-core (sin el CTD) en el plásmido

pcDNA3.1(+), para expresarlo en células de mamífero (CHO-K1 y HEK293) y se caracterizó

electrofisiológicamente la corriente producida en ambas líneas celulares. Se observó que las

corrientes del canal truncado BKCa core presentan características farmacológicas similares al

canal BKCa canónico. Experimentos de inmunofluorescencia indicaron que el canal BKCa-core se

localiza en la membrana de las células HEK293. Estos resultados preliminares son promisorios

para posteriores estudios al demostrar la posibilidad, por primera vez, de expresar el dominio

core del canal BKCa en un modelo celular de mamífero.

RESUM

El canal de potassi activat per calci de gran conductància (BKCa) està àmpliament expressat en

diferents teixits i juga un important paper en nombrosos processos fisiològics. Una de les

característiques destacades és la seva regulació tant per voltatge com per calci. L’estructura

modular del canal inclou un domini transmembrana (core) que conté el sensor de voltatge i el

porus, i un domini citosòlic (CTD) que conté llocs d’unió a calci. Una àrea d’interès sobre els

BKCa és l’estudi de les propietats funcionals del core i les interaccions al·lostèriques entre el

core i el CTD, així com el paper de cada un d’aquests dominis en la modulació del canal per

diversos activadors i inhibidors.

La hipòtesis central d’aquest treball és que l’activació del canal BKCa pel colorant DiBAC4(3) i la

influència de la subunitat β1 sobre aquesta, ocórrer sobre el core del canal independentment

del CTD.

Per investigar aquesta hipòtesis es va subclonar el canal BKCa-core (sense el CTD) en el

plàsmid pcDNA3.1(+), per expressar-lo en cèl·lules de mamífer (CHO-K1 i HEK 293) i es va

caracteritzar electrofisiològicament la corrent produïda en ambdues línies cel·lulars. Es va

observar que les corrents del canal truncat BKCa-core presenten característiques

farmacològiques similars al canal BKCa canònic. Experiments d’inmunofluorescència van indicar

que el canal BKCa-core es localitza a la membrana de les cèl·lules HEK 293. Aquests resultats

preliminars són promissoris per a posteriors estudis al demostrar la possibilitat, per primera

vegada, d’expressar el domini central del canal BKCa en un model cel·lular de mamífer.

ABSTRACT / RESUMEN / RESUM

1. INTRODUCCIÓN 3

1.1. El movimiento iónico a través de una membrana biológica. 3

1.2. Canales iónicos y su papel en la fisiología celular. 4 1.2.1. Clasificación de los Canales de Potasio. 5 1.2.2. La Familia de Canales Slo. 6

1.3. El canal de potasio dependiente de calcio de gran conductancia (BKCa) 7 1.3.1. Papel fisiológico del canal BKCa 7 1.3.2. Estructura del canal BKCa y subunidades reguladoras. 8 1.3.3. El Modelo Alostérico (HA) del canal BKCa. 10 1.3.4. La Farmacología del Canal BKCa junto con la subunidad β1 en el Modelo HA. 12

2. HIPOTESIS Y OBJETIVOS 13

3. MATERIAL Y MÉTODOS 14

3.1. Subclonaje del canal BKca core. 14 3.1.1. Transformación de células E. coli competentes, selección de clones positivos y purificación del constructo. 14 3.1.2. Digestión control y secuenciación del plásmido enviado. 15 3.1.3. Traspaso de la secuencia del gen BKcore-tail del plásmido pBluescript-KS(-) al plásmido pcDNA3.1(+). 16 3.1.4. Verificación final del producto de subclonaje. 19

3.2. Mantenimiento de cultivos de HEK 293 y CHO-K1. 21

3.3. Transfección transitória. 22

3.4. Protocolo para el estudio electrofisiológico del canal BKca core. 23 3.4.1. Aparatos y montaje para los estudios electrofisiológicos. 24

3.5. Inmunofluorescencia. 27

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 29

Caracterización de las corrientes macroscópicas del canal BKca core en las líneas

celulares HEK 293 y CHO-K1. 29

5. CONCLUSIONES 37

Consideraciones para la continuación del estudio. 37

6. REFERENCIAS 39

3

1.1.1.1. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

1.1.1.1.1.1.1.1. El movimiento iónico a través de una membrana biológica.El movimiento iónico a través de una membrana biológica.El movimiento iónico a través de una membrana biológica.El movimiento iónico a través de una membrana biológica.

En todas las células en general, existe una diferencia de potencial eléctrico más o menos

constante llamada potencial de membrana o de reposo (Vm o Vr) siendo:

Vm = Ve – Vi; donde Vi es el potencial intracelular y Ve el potencial extracelular, por

convención igual a 0.

Este potencial de membrana está dado por la distribución asimétrica de iones, siendo los más

influyentes: el potasio, el sodio y el cloro, la cual se debe a que los iones no difusibles obligan a

la distribución de los iones difusibles para lograr la electroneutralidad. El mantenimiento de esta

separación transmembranal de cargas es posible gracias a la existencia de diferentes

mecanismos que pueden ser a favor de gradiente (pasivos) o contragradiente (activos).

En el caso de las partículas hidrofílicas, como los iones, el transporte pasivo involucra a los

canales iónicos. En reposo, estos iones difusibles son el potasio y el cloro y establecen el

equilibrio de Donnan.

Los mecanismos activos implican el consumo de energía celular en forma de ATP, como por

ejemplo, la bomba Na+/K+ ATPasa, que extruye tres iones de sodio e introduce dos de potasio

al interior de la célula, manteniendo así el gradiente electroquímico de estos iones.

El movimiento de iones depende, por un lado, de que tengan una vía por donde atravesar la

membrana; y por otro lado, de la fuerza impulsora, la cual está dada por la diferencia entre el

Vm y el potencial de equilibrio electroquímico de cada ion (Eeq). Este potencial está dado

por el equilibrio entre la fuerza de difusión, debida a la diferencia de concentraciones de un

determinado ion, y la fuerza eléctrica que estos mismos iones generan al moverse y que se

opone a la fuerza dada por el gradiente químico. El equilibrio electroquímico se sostiene

dinámicamente y se calcula por la ecuación de Nernst:

E = RT/zF ln ([X]e/[X]i; por lo tanto, de acuerdo con la ecuación, el potencial de

equilibrio para el ión varía linealmente con la temperatura absoluta (RT/zF) y

logarítmicamente con la relación de la concentración iónica extracelular e

intracelular ([X]e y [X]i, respectivamente).

4

En particular en las células excitables (musculares, excretoras y neuronas), son fundamentales

los cambios en el potencial de membrana debidos a la actividad de canales iónicos

particulares.

Es importante recalcar que el movimiento de solo un pequeño número de iones genera una

diferencia de potencial perceptible a través de la membrana. Este movimiento de cargas se

puede registrar mediante la técnica conocida como patch clamp.

Si la membrana fuera únicamente permeable a una especie iónica, el potencial de reposo sería

idéntico al potencial de equilibrio para esa especie. No obstante, dado que la membrana es

permeable a más de un ión, el potencial de reposo se acerca al potencial de equilibrio del ion

para el cual, el producto de la permeabilidad por su potencial de equilibrio es mayor, según lo

indica la ecuación de Goldman-Hodking-Katz:

En una membrana biológica, pese a ser permeable a más de una especie iónica, el ión que

presenta más movilidad, en reposo, es el potasio. Por lo tanto, el potencial de membrana en

reposo generalmente tiene un valor muy cercano al potencial de equilibrio del potasio.

1.2.1.2.1.2.1.2. Canales iónicos y su papel en la fisiología celular.Canales iónicos y su papel en la fisiología celular.Canales iónicos y su papel en la fisiología celular.Canales iónicos y su papel en la fisiología celular.

Entender la función que ejercen los distintos canales iónicos sobre la fisiología de las células

es, sin duda, un reto para la comprensión de muchas patologías. Estas proteínas que

atraviesan la membrana plasmática formando un poro que permite el paso de iones, se

expresan en todas las células, pero su densidad y distribución depende de cada tipo celular.

El pasaje de iones ocurre cuando el canal se encuentra en un estado conformacional

específico (estado abierto) generalmente en respuesta a estímulos eléctricos, químicos o

mecánicos. Los cambios conformacionales de apertura y cierre se conocen como gating. La

actividad de los canales iónicos es altamente modulable. Éstos pueden ser dianas de muchas

toxinas y numerosos agentes farmacológicos utilizados tanto en la investigación como en la

clínica.

5

Los defectos en los canales iónicos (canalopatías) que modifiquen su distribución o

funcionamiento, pueden acarrear diversas patologías. Una diversidad de enfermedades

fundamentalmente cardiovasculares, neurológicas y neuromusculares, así como también, el

Síndrome de Batter, la retinitis pigmentosa, la fibrosis quística, la hipertermia maligna o la

eritomelalgia entre otras, son canalopatías que tienen como origen mutaciones de genes que

codifican para canales iónicos (Kim 2014). Estas mutaciones pueden afectar la correcta

expresión y estructura del canal, el transporte proteico hacia membranas, la predisposición a

modificaciones post-traduccionales y las propiedades biofísicas del canal.

Las propiedades de los canales iónicos se han utilizado para establecer su clasificación.

Concretamente, son tres características las que marcan los ejes principales de la organización:

la selectividad, la mayoría de canales iónicos son más selectivos para una especie iónica que

para el resto (canles de sodio, calcio, potasio o cloro); el tipo de estímulo que modifica el

gating, que principalmente será el voltaje de membrana, fuerzas mecánicas o la unión de

ligando; y la estructura, que hace referencia normalmente al número de fragmentos

transmembrana que atraviesan la bicapa lipídica o a la cantidad de dominios formadores del

poro del canal.

Los canales de potasio son los más abundantes en diversidad y expresión en las células

eucariotas, muy por encima de los canales de sodio, calcio y cloro.

1.2.1. 1.2.1. 1.2.1. 1.2.1. Clasificación de lClasificación de lClasificación de lClasificación de los os os os Canales de Potasio. Canales de Potasio. Canales de Potasio. Canales de Potasio.

Los canales de potasio se agrupan de la siguiente manera (González et al. 2012) [Figura 1]:

· Canales de 2 Segmentos Transmembrana – 1 Dominio formador del poro [2TMS-1P].

Cada subunidad posee dos regiones transmembrana (S5-S6 para los canales activados por

voltaje y M1-M2 para el resto) que se ensamblan como tetrámeros conectadas por un dominio

formador del poro. En este grupo se encuentran los canales rectificadores internos (KIR).

· Canales de 4 Segmentos Transmembrana – 2 Dominios formadores del poro [4TMS-2P].

Los canales se forman como un dímero a diferencia del resto de canales. No son dependientes

de voltaje y no son sensibles a los bloqueantes clásicos de los canales de potasio. Reúnen un

conjunto de propiedades que han hecho que se les designen como “canales de fuga” y su

actividad se asocia al mantenimiento del potencial de reposo. Este grupo está formado por la

familia de canales K2P.

· Canales de 6 Segmentos Transmembrana – 1 Dominio formador del poro [6TMS-1P].

Es el grupo más numeroso de canales de potasio en el que se incluyen a tres familias: los

canales de potasio operados por voltaje (KV), en los cuales el segmento S4 actúa como sensor

del voltaje y presenta cuatro aminoácidos cargados positivamente; los canales de potasio de

6

baja conductancia sensibles a la concentración de calcio intracelular e independientes del

voltaje (SKCa) y por último, los canales de potasio de alta conductancia sensibles a la

concentración intracelular de iones (Ca2+, Na+ o H+) y al cambio de voltaje (Slo). Dentro de esta

subfamilia se encuentra el canal Slo1 (también llamado BKCa) que aún reúne otro atributo que

lo diferencia del resto de canales de la misma subfamilia y que es presentar un dominio

transmembrana más (siendo 7TM).

1.21.21.21.2.2.2.2.2. La Familia de Canales Slo. . La Familia de Canales Slo. . La Familia de Canales Slo. . La Familia de Canales Slo.

El canal BKCa, sobre el cual se basa el presente estudio, es el miembro más estudiado de esta

subfamilia y tiene importancia tanto desde el punto de vista fisiopatológico como biofísico. La

primera particularidad de esta familia de canales de potasio es presentar una gran

conductancia al ión. La segunda característica que presentan, comentada con anterioridad, es

que se activan principalmente por dos estímulos: por cambios en el potencial de membrana y

por variaciones en la concentración de calcio intracelular (revisado por Salkoff et al. 2006).

Como en el resto de los canales activados por voltaje, estos canales presentan un sensor de

voltaje que traduce los cambios en el potencial de membrana a cambios en la conformación del

canal (abierto o cerrado). Es el propio movimiento del sensor de voltaje el que interacciona

alostéricamente con el dominio que conforma el poro haciendo que algunos aminoácidos se

desplacen unos pocos amstrongs y dejen de obstruir la cavidad del poro (Gonzalez et al. 2012).

A potenciales hiperpolarizados estos canales se encuentran en estado cerrado y a potenciales

cada vez más despolarizados, se abren dejando pasar los iones.

Figura 1: Clasificación de los canales de potasio de acuerdo con la estructura de la subunidad alfa

(Gonzalez et al. 2012).

7

Por otra parte, la dependencia de la concentración de calcio, se debe a que la unión del ion

Ca2+ a sitios dentro del dominio citosólico provoca cambios conformacionales que ejercen una

influencia alostérica en el poro del canal.

Son cuatro los genes que codifican para estos canales en mamíferos: Slo1 (en humanos,

KCNMA1), Slo2 que codifica para dos ortólogos Slo2.1 (KCNT2, también “Slick”) y Slo2.2

(KCNT1, también “Slack”) y Slo3 (KCNU1). Como se menciona en la sección anterior, los

canales de esta familia presentan la característica de ser sensibles a los cambios de

concentración iónica intracelular (H+, Na+ y Ca+), lo cual los hace únicos para enlazar el

metabolismo de la célula y la conductancia de la membrana (González et al. 2012).

El primer miembro de este grupo se clonó de un mutante de Drosophila llamado “slowpoke” (en

castellano “torpe”) (Atkinson et al. 1991). Estas moscas tenían un vuelo alterado como

consecuencia de la mutación del canal, de ahí el nombre que recibe la familia. Este primer

canal clonado fue el Slo1 (también llamado BKCa, BK, MaxiK, o KCa1.1).

1.3.1.3.1.3.1.3. El canal de potasio El canal de potasio El canal de potasio El canal de potasio dependientdependientdependientdependiente de calcio de gran conductanciae de calcio de gran conductanciae de calcio de gran conductanciae de calcio de gran conductancia

(BK(BK(BK(BKCaCaCaCa))))

1.3.1.3.1.3.1.3.1111. Papel fisiológico del canal BK. Papel fisiológico del canal BK. Papel fisiológico del canal BK. Papel fisiológico del canal BKCaCaCaCa

Se han descrito numerosos eventos celulares en los que participa el canal BKCa (Hou et al.

2009). En neuronas del hipocampo, los canales BKCa son responsables de la hiperpolarización

rápida, regulando los disparos de potenciales de acción y la liberación de neurotransmisores

(Brenner et al. 2005). En las células del músculo liso, la apertura de los BKCa promueve la

relajación muscular, (Brayden & Nelson 1992) (Nelson & Bonev 2004). También se encuentran

canales BKCa en astrocitos dentro del sistema neurovascular, cuya actividad es responsable de

la vasodilatación arteriolar del cerebro inducida por la actividad neuronal (Filosa et al. 2006). En

células endocrinas y exocrinas, la secreción hormonal está en parte regulada por este canal

(King et al. 2006). También están involucrados en el fenómeno de fatiga del músculo

esquelético (Kristensen et al. 2006) (Tricarico et al. 2005), en la regulación del ritmo cardíaco

(Imlach et al. 2010), en la tolerancia del etanol (Davies et al. 2003) (Cowmeadow et al. 2006) y

en la nocicepción (Chen et al. 2009). Así como, son esenciales en los procesos de filtración

renal (Pluznick et al. 2005) y funcionamiento del sistema inmune (Ahluwalia et al. 2004). Por

último, cabe destacar que muy recientemente se ha descubierto una nueva función del canal

BKCa relacionándolo con la hiperactivación espermática en humanos (Mannowetz et al. 2013)

8

1.3.1.3.1.3.1.3.2222. Estructura del canal BK. Estructura del canal BK. Estructura del canal BK. Estructura del canal BKCaCaCaCa y subunidades regy subunidades regy subunidades regy subunidades reguladorasuladorasuladorasuladoras. . . .

La secuencia del gen Slo1 codifica a la subunidad α (formadora del poro del canal). El canal

está formado por la tetramerización de cuatro subunidades α. Cada subunidad α está dividida

en dos regiones principales: la región transmembrana o “segmentos del core que atraviesan 7

veces la membrana; 7TM” (S0-S6) y la región citosólica equivalente a 2/3 de todo el canal, está

formada por 827 aminoácidos por subunidad, y termina en el extremo C-terminal (Budelli &

Geng 2013a) [Figura 2].

Desde un punto de vista funcional, la subunidad α presenta una estructura modular que puede

estar subdividida en tres dominios: El dominio sensor de voltaje (VSD, Voltage sensing domain)

que se localiza en la región del core y es sensible al potencial de membrana, el dominio del

poro (PGD, Pore gate domain) ubicado en la región que comprenden los segmentos S5 y S6, y

el dominio citosólico (CTD, Cytosolic domain o gating ring), que contiene al sensor de calcio

(Lee & Cui 2010) (Hoshi et al. 2013). Este gran dominio citosólico tiene múltiple heterogeneidad

funcional al permitir variedad de splicing alternativo, polimorfismos, fosforilación, unión de

ligandos e interacciones con otras proteínas moduladoras del canal.

Asimismo, tal y como se observa en la Figura 2, esta estructura tetramérica se puede

complementar con subunidades reguladoras. En mamíferos, las subunidades β1-β4 (Contreras

et al. 2012) y las recientemente descubiertas γ1-γ4 (Yan & Aldrich 2012) (Yan & Aldrich 2010),

Figura 2: Esquema de la subunidad alfa del canal BKCa donde se señalan los tres subdominios (VSD,

PGD y CTD) así como los residuos aminoacídicos involucrados en la unión de mensajeros secundarios

(Moduladores inhibidores (-) y moduladores estimuladores (+)) involucrados en la modulación del canal.

También se representa esquematizada la subunidad beta 1. [Modificada de (Hou et al. 2009)].

9

modifican de manera importante el comportamiento del canal, tanto en su cinética de apertura

frente a la concentración de calcio o al voltaje, así como la sensibilidad a agentes

farmacológicos.

Por ejemplo, se ha demostrado que la subunidad β4 convierte al canal resistente a la

Iberioxina, cuya acción es el bloqueo del canal; la subunidad γ1 (también llamada LRRC26)

evita la activación por medio de la Mallotoxina; la subunidad β2 mantiene al canal inactivo con

el tiempo (Wallner et al. 1999); la subunidad β3b hace que el canal tenga una inactivación muy

rápida (Xia et al. 2000); la subunidad β1, una de las más estudiadas (Dworetzky et al. 1996)

(McManus et al. 1995), incrementa la sensibilidad al calcio cuando la concentración intracelular

de calcio se sitúa por encima de 1µM (la concentración de calcio intracelular ronda los 200nM)

y al igual que β2, enlentece la cinética de activación del canal (Orio et al. 2002).

El canal BKCa junto con la subunidad β1 se encuentran expresados en las células del músculo

liso y su activación promueve la relajación muscular. En un modelo murino, se ha demostrado

que las mutaciones genéticas en BKCa + β1 provocan múltiples patologías entre las que se

incluye la hipertensión (Amberg & Santana 2003) (Yang et al. 2013) o la sobreactivación de la

vejiga (Meredith et al. 2004). También en humanos, se han asociado polimorfismos de la

subunidad β1 a alteraciones del tono vascular (Gong et al. 2007) y asma (Semenov et al.

2006).

Estructuralmente, estas subunidades beta contienen dos segmentos transmembrana (TM1 y

TM2) conectados por un enlace extracelular, dejando el extremo N y C terminal en el interior

celular. Aunque se conoce, mediante estudios de proteómica, cuáles son los segmentos del

canal que interaccionan con las subunidades beta (es sabido que el TM1 se acopla entre los

sensores de voltaje y que TM2 queda próximo al segmento S0) (Liu et al. 2010), no se tiene

verdadera certeza de si otros dominios de la subunidad α, como pudiera ser el CTD, están

igualmente afectando esta interacción [Figura 3].

Este punto requiere aún un estudio exhaustivo de cómo la misma subunidad α puede

autoregular sus enlaces con subunidades moduladoras o incluso agentes farmacológicos en lo

que sería un modelo alostérico de regulación.

10

1.3.1.3.1.3.1.3.3333. El Modelo Alostérico (HA) del canal BK. El Modelo Alostérico (HA) del canal BK. El Modelo Alostérico (HA) del canal BK. El Modelo Alostérico (HA) del canal BKCa. Ca. Ca. Ca.

Paradójicamente, mientras se demuestra que el canal se activa por voltaje, éste también se

puede activar cuando los sensores de voltaje no están activados, y por lo contrario, el canal

puede permanecer cerrado cuando los sensores de voltaje están activos.

Horrigan & Aldrich (1999) demostraron que el canal BKCa sufría aperturas espontáneas sin que

la proteína estuviera influenciada por ninguno de los dos estímulos (ni cambio en el voltaje ni

unión de calcio en el sensor). Estos resultados hicieron que diversos investigadores

convergieran en la idea de postular un modelo que justificara el comportamiento del canal: el

Modelo HA (Horrigan & Aldrich 2002) (Latorre et al. 2010)

Este modelo es complejo y se basa en la definición de distintos factores alostéricos y distintas

posiciones en equilibrio: Si tenemos una representación de la subunidad α del canal [Figura 4]

podemos ver que ésta puede someterse a una transición directa desde el estado cerrado al

abierto, una transición que en el modelo la determina la constante de equilibrio L, y que hace

referencia a las aperturas espontáneas de Horrigan & Aldrich. Por otra parte, cuando una

despolarización de la membrana activa el sensor de voltaje, el pasaje de una configuración

cerrada a la abierta, va a estar regida por LD, donde D es un factor alostérico directamente

relacionado con J, que define si la membrana está en reposo (R) o despolarizada (A).

Figura 3: Modelo del acoplamiento entre las

subunidades alfa y las subunidades β1 del canal

BK (Liu et al. 2010)

11

Asimismo, cuando el calcio se une a su sensor en el dominio citosólico, esta transición está

mediada por LC, donde C es un segundo factor alostérico, que estará influenciado por K, otra

constante, que en este caso, determina la unión de calcio al sensor. Por lo tanto cuando los

dos sensores, de calcio y voltaje, están activos, la apertura del canal se rige por LDC.

Por lo tanto, el punto clave de este modelo es que el gating del poro del canal está influenciado

tanto por la posición del sensor del voltaje (en el VSD) como por la posición del sensor de

calcio (en el CTD). Por una parte, el movimiento del sensor de voltaje en respuesta a la

despolarización de la membrana aumenta la probabilidad de apertura del poro, pero también y

de forma recíproca, la apertura del poro facilitará el movimiento del sensor de voltaje durante la

despolarización. Por otra parte, de manera muy similar, la unión de calcio en el sensor de

calcio aumenta la probabilidad de apertura del poro y la misma apertura del poro aumenta la

afinidad entre el calcio y el sensor.

Pero, se deja claro que ni el voltaje ni la unión de calcio, por si solos, están estrictamente

asociados a la apertura del canal, sino que los tres posibles procesos están en un equilibrio

independiente e interaccionan alostéricamente entre ellos.

Figura 4: Modelo alostérico para la activación por cambios en el voltaje y concentración intracelular

de calcio del canal BKCa. (Latorre et al. 2010)

12

1.3.1.3.1.3.1.3.4444. La Farmacología del Canal BK. La Farmacología del Canal BK. La Farmacología del Canal BK. La Farmacología del Canal BKCaCaCaCa junto con la subunidad junto con la subunidad junto con la subunidad junto con la subunidad β1 en el Modelo HA. 1 en el Modelo HA. 1 en el Modelo HA. 1 en el Modelo HA.

En un estudio reciente del Centro de Genética Cardiovascular, donde se registraron los canales

nativos BKCa de músculo liso arterial, se ha podido demostrar que el compuesto DiBAC4(3) es

capaz de activar a los canales en ausencia de la subunidad β1 o β4 (Scornik et al, 2013).

También se ha podido ver que los canales BKCa recombinantes se activan por DiBAC4(3) en

ausencia de las subunidades auxiliares, señalando que posiblemente haya un sitio de unión

para el colorante DiBAC4(3) en la subunidad α, para la cual la subunidad beta 1 juega un rol

modulador. Según los resultados obtenidos, el colorante provoca un aumento de la corriente

debido a una desactivación más lenta de la misma (Bosch et al. 2014).

El potencial de un compuesto con especificidad para determinadas subunidades resulta muy

atractivo para la fisiología cardiovascular donde la subunidad β1 se expresa con predominancia

y tiene un papel fundamental en la vasoregulación. Dada la naturaleza modular de los canales

BKCa, aún queda por dilucidar cuáles módulos intervienen en los mecanismos de activación del

DiBAC4(3) y de la subunidad β1.

Recientemente, Budelli et al., (2013) lograron la expresión funcional de la región central (core)

del canal, equivalente al VSG y PGD, aislada de la región citosólica, y consiguieron registrar

corrientes producidas por esta región (core) del canal.

Este estudio sirve como base de la hipótesis y objetivos propuestos en el presente trabajo.

13

2222. . . . HIPOTESIS HIPOTESIS HIPOTESIS HIPOTESIS YYYY OBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOS

Uno de los proyectos del laboratorio de electrofisiología del Centro de Genética Cardiovascular

en el que se incluye el presente trabajo, se centra sobre la hipótesis de que la acción del

DiBAC4(3) sobre el canal BKCa y la influencia de la subunidad β1 sobre esta modulación ocurre

directamente sobre el dominio central del canal, de manera independiente del dominio

citosólico.

A continuación se exponen los objetivos específicos diseñados para este trabajo en relación a

esta hipótesis:

Objetivo 1: Subclonar el canal BKca core en el plásmido pcDNA3.1(+) que permite la expresión

de la proteína en células de mamífero.

Objetivo 2: Seleccionar un sistema de expresión celular (ej.: HEK 293, CHO1) adecuado para

caracterizar funcionalmente al canal BKca core.

Objetivo 3: Caracterizar farmacológicamente (TEA, Paxillina) las corrientes obtenidas por la

transfección del plásmido pcDNA3.1(+) BKca core.

Objetivo 4: Caracterizar las corrientes macroscópicas del canal BKca core coexpresando la

subunidad β1.

Objetivo 5: Caracterizar las corrientes macroscópicas del canal BKca core, sólo o

cotransfectado con la subunidad β1, en presencia y en ausencia de DiBAC4(3).

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3.3.3.3. MATERIAL MATERIAL MATERIAL MATERIAL Y Y Y Y MÉTODOSMÉTODOSMÉTODOSMÉTODOS

3.13.13.13.1.... SubclonajeSubclonajeSubclonajeSubclonaje del canaldel canaldel canaldel canal BKcBKcBKcBKca a a a core. core. core. core.

Se partió de un cDNA que codificaba únicamente para el dominio central del canal BKCa y para

una pequeña secuencia aminoacídica final (tail) necesaria para su expresión.

Este cDNA fue cedido por el Dr. Lawrence Salkoff (Washington University, St. Louis, MO),

quien recientemente publicó estudios electrofisiológicos con el constructo transfectando oócitos

de Xenopus spp. Por ese motivo, la secuencia del BKcore-tail enviada también estaba

flanqueada por una secuencia “Xen” que le permitía expresar el canal en oócitos. El cDNA

recibido estaba incluido en el plásmido pBluescrip-KS(-) como vector.

El proceso de subclonación consistió en traspasar la secuencia de interés (BKcore-tail) del

plásmido pBluescrip-KS(-) a un plásmido que permite la expresión en células de mamífero, el

pcDNA3.1(+).

Para ello, el primer paso fue transformar células competentes de E. coli DH5α con el objetivo

de multiplicar el plásmido de interés para disponer de una cantidad suficiente de ADN.

3333.1.1.1.1.1.1.1.1. Transformación de células . Transformación de células . Transformación de células . Transformación de células E. coliE. coliE. coliE. coli competentes, selección de clones positivos y competentes, selección de clones positivos y competentes, selección de clones positivos y competentes, selección de clones positivos y

purificación del constructo.purificación del constructo.purificación del constructo.purificación del constructo.

Las células E. coli DH5α son oportunas para la replicación de plásmidos. Se mantienen en

glicerina a -80ºC. El estado “competente” de estas células consiste en someterlas a un choque

térmico al pasar de 0ºC (hielo) a 42ºC y de nuevo a 0ºC. Este cambio brusco de temperatura

induce un aumento de la porosidad de la membrana celular, lo que permite la asimilación del

ADN foráneo.

Una vez transformadas, las bacterias se incuban durante una hora a 37ºC, en agitación a 220

rpm en medio de cultivo LB Broth [Sigma] y finalmente se centrifugan a 4000 rpm durante 3

minutos.

La selección de los transformantes se da mediante la adquisición de resistencia a la ampicilina,

antibiótico que se añade en las placas de cultivo donde se siembran las células recogidas de la

centrifugación. El plásmido pBluescript-KS(-) expresa el gen de resistencia a la ampicilina (bla),

por lo cual, las células que hayan sido transformadas con éxito serán las únicas que pueden

crecer en el medio selectivo.

15

Tras una incubación de toda la noche (overnight) de la placa a 37ºC se pican las colonias

crecidas y se prosigue con un “cultivo de día” (equivalente a 5-6 horas, a 37ºC y 220 rpm) en

3ml medio LB Broth suplementado con ampicilina 1:1000. Una vez han crecido, se les facilita

aún más la replicación con un cultivo overnigth con las mismas condiciones pero aumentando

el volumen de medio LB Broth a 200ml.

Por último, se purifica el plásmido con el kit EndoFree® Plasmid Maxi [Qiagen] y se cuantifica

el producto mediante el sistema NanoDrop [Thermo Scientific].

Para verificar que el constructo enviado y por lo tanto, el producto de la transformación, fuera

la secuencia BKcore-tail, se llevó a cabo una confirmación de dos formas: mediante una

digestión con enzimas de restricción (donde se observó si el producto estaba contaminado) y

mediante la secuenciación del gen (para descartar que tuvieran mutaciones o incluso que no

fuera el gen de interés). Estos procesos se describen a continuación.

3.3.3.3.1.2. Digestión control y secuenciación del 1.2. Digestión control y secuenciación del 1.2. Digestión control y secuenciación del 1.2. Digestión control y secuenciación del plásmido enviado.plásmido enviado.plásmido enviado.plásmido enviado.

Para la digestión control se probó la enzima de restricción HindIII que, en el plásmido utilizado,

solamente tiene una diana de corte y por lo tanto, sirve para linealizar el vector e informar sobre

su tamaño; y por otra parte, se probaron las enzimas de restricción NotI y Acc651 que tienen

sus dianas de restricción justo a 5’ y 3’, respectivamente, de las secuencias Xen.

El producto de digestión se separó en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron las bandas

mediante el lector automático ChemiDoc MP System [Bio-Rad].

Por otro lado, la secuenciación del gen se llevó a cabo por el método Sanger. Se siguió el

protocolo estandarizado que comprende tres fases: una primera fase de amplificación del gen

mediante el kit de BigDye [Life Technologies], una fase de precipitación con la se descartan

todos los ddNTPs que no forman parte de ninguna cadena nucleotídica y una fase de

secuenciación (Secuenciadora: AB applied Biosystems HITACHI 3130x/Genetic Analyzer;

Software: Sequencing Analysis 5.3.1).

Los primers empleados para la fase de amplificación fueron los siguientes [Tabla 1]:

Tabla 1: Secuencia de los primers para la secuenciación control.

Primer Secuencia

MDALI_sense 5’ ATGGATGCGCTCATCATACC 3’

MDALI_antisense 5’TATGTGGAACTGATGTGTGA 3’

El resultado de la secuenciación se analizó mediante el programa Clustal W, se obtuvo la

secuencia del canal BKCa core esperada.

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3.3.3.3.1.3. Traspaso de la secuencia del gen BKcore1.3. Traspaso de la secuencia del gen BKcore1.3. Traspaso de la secuencia del gen BKcore1.3. Traspaso de la secuencia del gen BKcore----tailtailtailtail del plásmido pBluescriptdel plásmido pBluescriptdel plásmido pBluescriptdel plásmido pBluescript----KS(KS(KS(KS(----) al ) al ) al ) al

plásmido pcDNA3.1(+). plásmido pcDNA3.1(+). plásmido pcDNA3.1(+). plásmido pcDNA3.1(+).

3.1.3.1 DigestiónDigestiónDigestiónDigestión

Se eligió, de entre las enzimas de restricción, las que tuvieran diana en el plásmido aceptor

(pcDNA3.1+).

Estas enzimas fueron, por una parte, HindIII para cortar el gen por el extremo 3’ (diana

compartida en los dos plásmidos pBlue-scriptKS(-) y pcDNA3.1(+)) y por otra parte, NheI, cuya

diana solamente se encontraba en el plásmido aceptor.

De este modo, hubo que amplificar mediante una reacción de PCR la secuencia del plásmido

donador (pBluescriptKS(-)), introduciéndole la secuencia diana para NheI.

Con ese fin, se diseñó la siguiente pareja de primers [Tabla 2] que no solo sirvieron para

introducir dicha diana, sino que también, permitieron, a posteriori, aislar la secuencia BKcore-

tail de las secuencias Xen que lo rodeaban.

Tabla 2: Secuencia de los primers diseñados.

Primer Secuencia

NheI_sense 5’ AATTGCTAGCGCCACCATGGATGCGCTCATCATACC 3’

HindIII_antisense 5’ TATAAAGCTTTTATCACACATCAGTTCCACATA 3’

El producto de PCR se purificó mediante el kit DNA, RNA and protein purification [Macherey-

nagel] y se cuantificó por el sistema Nanodrop.

Una vez insertada la secuencia diana para NheI en el plásmido pBluescript se siguió con la

digestión. En ésta, se digirió el producto de la PCR anterior y el plásmido pcDNA3.1(+) con las

enzimas NheI y HindIII, de forma que al correr los productos respectivos en un gel de agarosa,

se obtuvo un patrón de bandas que se recortaron y purificaron recogiendo de cada digestión la

secuencia siguiente [Figura 5; bandas señaladas]: del producto de PCR se aisló la secuencia

BKcore-tail y del plásmido pcDNA3.1(+), el fragmento de mayor tamaño correspondiente a casi

toda la secuencia del plásmido. Para la purificación de las bandas se utilizó el kit DNA

extraction from agarosa gel [Qiagen]. También se optó por añadir CIP en la digestión del

plásmido pcDNA3.1(+). CIP es una fosfatasa que elimina el fosfato del último nucleótido de

manera que no se puede volver a crear un enlace fosfodiéster que una los extremos de la

cadena. Paralelamente a esta digestión también se procesó de la misma manera otro

constructo que estaba formado por la secuencia de la subunidad α del canal BKCa (BKα)

clonado en el plásmido pcDNA3.1(+). De manera que se digirió con NheI y HindIII obteniendo

dos productos: la secuencia BKα y el resto del vector.

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Figura 5: Gel de agarosa donde se observan los productos de la digestión de distintos plásmidos (se

anotan los pares de bases correspondientes): Marcadores de peso molecular (carril M); pcDNA3.1(+)

linealizado con HindIII (A, carril1); pcDNA3.1(+) digerido con HindIII/NheI (B, carriles 2 y 3); producto de

PCR BKcore-tail digerido con HindIII/NheI (C, carriles 4 y 5) y pcDNA3.1(+)_BKα digerido con

HindIII/NheI (D, carriles 6 y 7). Obsérvese que las bandas de bajo peso molecular de las digestiones

respectivas a los carriles 2, 3, 4 y 5 no son perceptibles en el gel. Se señalan con recuadros las bandas

que se recortaron y se purificaron.

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3.1.3.2 LigaciónLigaciónLigaciónLigación

Una vez obtenidos el DNA vector (pcDNA3.1+) y los ADN pasajeros (BKcore-tail y BKα) se

procedió a la ligación de los diferentes constructos: el constructo de interés

(pcDNA3.1(+)_BKcore; Figura 6) y los constructos controles (pcDNA3.1(+)_BKα como control

positivo y solamente pcDNA3.1(+) como control negativo). El control positivo informó sobre la

eficiencia en el proceso de ligación ya que se partía de un ADN íntegramente conocido y que

no sufrió ningún proceso previo al subclonaje; y por otra parte, el control negativo proporcionó

información sobre la efectividad de las enzimas de restricción, ya que si dichas enzimas

funcionan, el vector se corta y gracias a CIP, no puede volver a recircularizarse, disminuyendo

la probabilidad de transformación de la células bacterianas.

Figura 6: Esquema de los fragmentos que formaron el constructo de interés. Se destacan los elementos

para los que el vector codifica: la secuencia SV40, equivalente a una secuencia de localización nuclear

para que el plásmido se dirija al núcleo y pueda ser transcrito; el gen de resistencia a la ampicilina para la

selección de células procariotas (AmpR) y el gen de resistencia a la neomicina para la selección de

células eucariotas (NeoR).

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Para la reacción de ligación se probaron las proporciones 1:1, 1:3 y 1:5 (vector/ADN pasajero),

y se incubó durante una hora a temperatura ambiente.

Tras la reacción, se transformaron células E. coli DH5α siguiendo el mismo protocolo

comentado con anterioridad (incubándose toda la noche, a 37ºC, en placas de agar

suplementado con ampicilina 1:1000). No obstante, durante la transformación de células

competentes, se añadió un segundo control positivo transformando E. coli DH5α directamente

con el constructo pcDNA3.1(+)_BKα sin pasar por el proceso de digestión ni ligación. Este

segundo control positivo sirvió para saber la eficacia del proceso de transformación de las

células competentes.

3.3.3.3.1.4. Verificación final del producto de 1.4. Verificación final del producto de 1.4. Verificación final del producto de 1.4. Verificación final del producto de subclonajesubclonajesubclonajesubclonaje....

Los clones positivos que codifican para el canal BKcore crecidos en las placas de agar pasaron

de nuevo por un cultivo diurno y nocturno en LB Broth y por una purificación del plásmido

mediante el kit EndoFree® Plasmid Maxi [Qiagen]. Además se conservó una muestra de estos

clones glicerinados a -80ºC para poder recuperar el plásmido de interés cuando se requiera.

El producto purificado se cuantificó de nuevo por el sistema NanoDrop y se repitió el análisis de

comprobación a partir de una digestión control con las enzimas NheI y HindIII [Figura 7].

Figura 7: Gel de agarosa donde se observan los productos de la digestión control de los distintos

plásmidos de interés (se anotan los pares de bases correspondientes): Marcadores de peso molecular

(carril M); pcDNA3.1(+)_BKα digerido con HindIII/NheI (carril 1 y 2); pcDNA3.1(+)_BKcore digerido con

HindIII/NheI, producto de una primera purificación (carriles 3 y 4) y pcDNA3.1(+)_BKcore digerido con

HindIII/NheI, producto de una segunda purificación (carriles 5 y 6). La digestión del plásmido

pcDNA3.1(+)_BKα se utilizó en este gel como control de las enzimas de restricción. Nótese que obtienen el

patrón de bandas esperado para cada secuencia, que se puede comparar con los de la Figura 6.

20

Finalmente, se secuenció el plásmido, de nuevo por Sanger, con múltiples primers para cubrir

toda la secuencia BKcore-tail [Tabla 3].

El resultado de la secuenciación no mostró ninguna alteración en la secuencia del canal (no

se muestran los resultados del blast), dando por bueno el proceso de subclonación.

No obstante los resultados positivos obtenidos en la subclonación del plásmido

pcDNA3.1(+)_BKcore, cabe decir que el rendimiento de las dos purificaciones sucesivas fue

bajo. Teniendo en cuenta que cualitativamente, se obtuvo la preparación esperada del

pcDNA3.1(+)_BKcore tal como lo muestran los controles de digestión enzimática y la

secuenciación, se continuó con los pasos experimentales dirigidos al registro de corrientes

BKcore-tail, de manera de comprobar si el plásmido obtenido era capaz de expresar corrientes

BK en células de mamífero, lo cual no había sido demostrado anteriormente.

Tabla 3: Primers para la secuenciación del canal BKcore-tail.

Primer Secuencia

Mslo1_core1_sense 5’ GCTGGATGACATCTGTGAAGG 3’

Mslo1_core2_sense 5’ TTGGCTTGAGATTTTTAAGAGCC 3’

Mslo1_core3_sense 5’ ACTTGGACGCCTCTTCATGG 3’

21

3.2.3.2.3.2.3.2. Mantenimiento de cultivos de Mantenimiento de cultivos de Mantenimiento de cultivos de Mantenimiento de cultivos de HEK 293HEK 293HEK 293HEK 293 y y y y CHOCHOCHOCHO----K1K1K1K1. . . .

La elección de la línea celular para la transfección de un canal iónico es críticamente

dependiente del tipo de canales iónicos así como subunidades auxiliares que la célula exprese

de manera endógena y de la influencia que estos puedan llegar a tener en los registros

electrofisiológicos posteriores, una vez que las células expresen el canal sujeto a estudio.

Normalmente, las células mamíferas como HEK 293 y CHO-K1 resultan ser buenas candidatas

para ser usadas en este tipo de transfección heteróloga por la poca expresión de canales

iónicos endógenos [Figura 8]. No obstante, se ha demostrado que ambas líneas presentan

ciertas corrientes endógenas (Yu & Kerchner 1998) (Skryma et al. 1994) que podrían interferir

en los registros electrofisiológicos del canal de interés. Por ese motivo, analizar dichas

corrientes endógenas ha sido un requerimiento previo a la selección de la línea celular,

manteniendo ambos cultivos hasta los primeros ensayos de patch-clamp.

Las células HEK 293 y las células CHO-K1 se mantienen en frascos de 25cm2 (7-8 ml aprox)

con los medios DMEM y F12 [Tabla 4], respectivamente, hasta alcanzar una confluencia

aproximada al 90%. Una vez llegado a este punto, se tripsinizan y se vuelven a sembrar en una

menor densidad. Para ello, se aspira el medio de cultivo, se realiza un lavado con 5ml de

DPBS+ y se incuban las células a 37ºC con 1ml de tripsina/EDTA durante 3 minutos. La

tripsina/EDTA actúa permitiendo el desprendimiento de las células del frasco de cultivo y

desagregando células entre si, por medio de su propiedad proteolítica sobre las proteínas

intercelulares.

Figura 8: Fotografías con microscopio óptico de las líneas celulares HEK 293 (derecha) y

CHO-K1 (izquierda) en un alto porcentaje de confluencia.

22

Finalmente se añaden 5ml de medio a un nuevo frasco y se traspasa la densidad deseada de

células del frasco antiguo al nuevo. Las células se mantienen en el incubador a una atmósfera

de 5% de CO2 a 37ºC.

Este procedimiento se realiza dos veces por semana, ya que ambas líneas celulares llegan al

90% de confluencia a los 4 días del pasaje anterior.

Tabla 4: Medios de cultivo utilizados para el crecimiento de HEK 293, CHO-K1.

Medio Composición

DMEM

[Sigma] Suplementado con: FBS al 10%, Glutamina al 1% y Penicilina y Streptomicina al 1%.

F12 + GlutaMAX

[Gibco] Suplementado con: FBS al 10% y Penicilina y Streptomicina al 1%.

3.3.3.3.3.3.3.3. Transfección transitória. Transfección transitória. Transfección transitória. Transfección transitória.

Se realizaron transfecciones transitórias tanto para los estudios electrofisiológicos como para el

ensayo de inmunofluorescencia.

El día antes de la transfección se preparan los cubres con poli-L-Lisina. La poli-L-Lisina crea

una matriz que asegura una mayor adherencia a las células. Las células deben estar alrededor

de un 60-70% de confluencia para la transfección, ya que muchas no superan este proceso con

éxito y se pierden.

Para este protocolo se han utilizado indistintamente los reactivos Lipofectamine [Invitrogen] y

GeneCellin [Bio Cell Challenge]. Ambos protocolos consisten en crear nanopartículas de

naturaleza lipídica que se envuelven por afinidad con las moléculas de ácidos nucléicos y que

la propia célula se encarga de endocitar.

Se siguieron los pasos recomendados por el fabricante. Cabe destacar que para los ensayos

de electrofisiología (y no para el ensayo de inmunofluorescencia) se cotrasfectaron las células

con un plásmido que codificaba para la proteína GFP, gracias a la cual se pudo estimar la

eficiencia de transfección y seleccionar las células transfectadas mediante una lámpara de

fluorescencia en el microscopio.

23

3.43.43.43.4.... Protocolo para el estudio electrofisiológico del canal BKcProtocolo para el estudio electrofisiológico del canal BKcProtocolo para el estudio electrofisiológico del canal BKcProtocolo para el estudio electrofisiológico del canal BKca a a a core. core. core. core.

La técnica de patch clamp permite registrar la actividad eléctrica de regiones muy pequeñas de

la membrana celular, o bien, de toda una célula aislada. El amplificador que se utiliza para

estos registros permite, según el modo en el que se utilice, medir corrientes iónicas

transmembrana manteniendo un potencial de membrana fijo (voltage-clamp), o bien lo

contrario, fijar un estímulo de corriente y medir la variación del potencial de membrana ante

dicho estímulo (current-clamp). La Figura 8 muestra un esquema del sistema de registro eléctrico y las distintas

configuraciones de la técnica de patch clamp. El primer paso en los registros de patch clamp

es crear el sello de alta resistencia entre la punta de la micropipeta y la célula seleccionada, de

manera que cuando el electrodo situado en el interior de la micropipeta registre corriente, la

única corriente que se detecte será la que esté ocurriendo en esta región concreta de la

membrana. Esta configuración se llama cell-attached y sirve para analizar registros de canales

únicos.

Si una vez que se ha llegado a esta configuración, se aplica una succión suave desde la

micropipeta, se rompe la porción de membrana que estaba delimitada por la punta de la

micropipeta y el electrodo queda en contacto con el interior celular, con lo cual, se puede

registrar la actividad eléctrica de toda la célula. Esta configuración se conoce como whole.-cell

y permite estudiar las corrientes macroscópicas (de todos los canales de la célula, mediante

voltage-clamp). Las restantes configuraciones mostradas en la Figura 9, son las llamadas

excised patch que permiten el estudio de un canal o unos pocos canales aislados de la célula,

teniendo la parte interna (inside‐out) o externa (outside‐out) de estos canales en el baño.

Figura 9: Esquema de las cuatro configuraciones posibles que se pueden realizar para registrar

electrofisiológicamente una célula.

24

En el presente trabajo, todos los registros del canal BKCa se hicieron en voltage-clamp, en la

configuración whole-cell, en la cual se observa la corriente generada a través de los canales de

toda la célula. La Figura 10 muestra el protocolo de pulsos utilizado para generar las corrientes

de potasio.

3.43.43.43.4.1. Aparatos.1. Aparatos.1. Aparatos.1. Aparatos y monty monty monty montajeajeajeaje para los estudios electrofisiológicos.para los estudios electrofisiológicos.para los estudios electrofisiológicos.para los estudios electrofisiológicos.

Para realizar los estudios electrofisiológicos se parte de un cultivo celular de baja densidad

para tener células aisladas crecidas sobre un cubre de 12mm de diámetro. Este cubre se

coloca en una cámara de registro rectangular que permite la disposición de los siguientes

elementos: sistema de perfusión, aspirador y electrodo de referencia o “tierra”.

A continuación se describe cada uno de los aparatos y soluciones necesarias para establecer

dicho protocolo [Figura 11].

3.4.1.1. Amplificador [Axopatch 200B Integrating Patch Clamp]:

El amplificador fija el potencial de membrana a un valor determinado y registra la corriente que

se genere a través de la membrana. También permite compensar las corrientes capacitivas de

la pipeta y de la célula y las resistencias en serie cuando se trabaja en la configuración “Whole-

cell”.

Figura 10: La imagen muestra los diferentes pulsos utilizados para generar las corrientes de

potasio. Se aplicó un primer pulso de -80 mV durante 50 ms, luego del cual se aplicaron

diferentes pulsos de potencial, comenzando con un pulso de -20 mV e incrementando cada

pulso sucesivo en 5 mV, con lo cual el último pulso utilizado fue de 200 mV. Tras 20 ms a

este potencial, se aplicó un pulso a 0 mV durante 50 ms, para luego regresar a la condición

inicial de -80 mV.

25

3.4.1.2. Interfase Digidata [1440A Axon CNS Molecular Devises]:

El convertidor digital-analógico de la interfase convierte los pulsos de potencial generados en

un ordenador a analógicos. Por otra parte, las corrientes generadas por las células se

convierten en potenciales al pasar por el amplificador y se digitalizan mediante el conversor

analógico-digital.

3.4.1.3. Software Clampex 10.2:

Desde el ordenador, utilizando este software se controlan los protocolos de estimulación y se

almacenan los registros de cada ensayo.

3.4.1.4. Microscopio Invertido [Nikon Eclipse Ti] y Micromanipulador [MP-285 Sutter

Instrument Company]:

Para la realización de un sello de alta resistencia entre la punta de la pipeta y la célula, se debe

posicionar la pipeta de registro cerca de la célula seleccionada e ir aproximándola con

movimientos cada vez más finos. El aparato que permite estos movimientos tan precisos en los

tres ejes espaciales es el micromanipulador que permite el control remoto de los movimientos

de la pipeta. Así mismo, todo este equipo debe estar apoyado sobre una mesa antivibratoria

que evita que los movimientos externos repercutan en la punta de la pipeta.

3.4.1.5. Micropipetas:

En el presente trabajo se utilizó el vidrio [Sutter Instrument. Borosilicate Glass with filament.

O.D.: 1.5mm, I.D.: 1.17mm. Length: 10cm] para la fabricación de las micropipetas con las que

se sellan las células. Este vidrio se estira mediante un estirador de pipetas vertical [Narishige

Model PC-10] que provoca dos calentamientos succesivos y un pulidir [Narishige Micro Forge

MF-830] para afinar más aun la punta de la pipeta. Para los estudios de configuración “Whole-

cell” se fabricaron micropipetas de resistencia 2~4Ω.

3.4.1.6. Sistema de Perfusión [cFlow Controller CF-8VS Valve Assembly]: El sistema de

perfusión permite perfundir las células con una solución determinada de manera transitoria una

vez se ha establecido la configuración de patch-clamp deseada. La utilización de este sistema

es clave para realizar estudios electrofisiológicos en los que se quiera probar la actividad de

una droga, de una toxina o de concentraciones iónicas diferentes. La velocidad de perfusión es

constante (1-2ml/min) y el nivel de la cámara también se mantiene igual mediante una aguja

hipodérmica conectada a un sistema de succión

26

3.4.1.7. Soluciones y Drogas empleadas para los estudios electrofisiológicos del canal

BKCa:

Se utilizaron dos soluciones diferentes, una “Solución Externa” que baña a las células y una

“Solución Interna” con la que se llenan las micropipetas [Tabla 7].

Figura 11: Fotografías del set de patch para estudios de electrofisiología del Laboratorio de

Genética Cardiovascular. Se numeran cada uno de los elementos siguientes: Mesa

antivibratoria (1), Interfase Digidata (2), Micromanipulador (3), Amplificador (4), Ordenador y

Software Clampex 10.2 (5), Microscopio Invertido (6), Sistema de Perfusión (7 y 8), Cámara

de registro (9), Aspirador (10) y Electrodo “tierra” (11).

27

Tabla 7: Clasificación de las soluciones utilizadas en los estudios electrofisiológicos.

Solucion Interna Composición

KCl 279 mOSM

130mM KCl, 1mM EGTA, 10mM HEPES, 10mM NaCl , 2mM ATP-

Mg; llevada al pH: 7.2 con KOH. La osmolaridad fue ajustada con el

añadido de glucosa.

Soluciones Externas Composición

NK (NaCl) 140mM 293 mOsm

140mM NaCl, 3mM KCl, 10mM Hepes, 1.2mM MgCl2, 1.8mM CaCl2;

llevada a pH 7.4 con KOH. La osmolaridad fue ajustada con el

añadido de glucosa.

Por otro lado, las drogas utilizadas para inhibir o activar distintas corrientes presentes en las

células se describen detalladamente a continuación [Tabla 8].

Tabla 8: Drogas para los estudios electrofisiológicos.

Droga Acción

Tetraethylammonium chloride

(TEA) 2mM

[Sigma]

Bloqueante de canales de potasio dependientes de voltaje. A bajas

concentraciones es específico para el BKCa.

Paxilline 100nM

[Tocris Bioscience] Bloqueante específico de canales BKCa

Bis-(1,3-Dibutylbarbituric

Acid) Trimethine Oxonol)

(DiBAC4 (3)) 10µM

[Life technologies]

Promueve la activación dependiente de concentración de los canales

BKCa y enlentece la cinética de deactivación.

3.53.53.53.5.... Inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia.

Con el objetivo de valorar si el producto final del subclonaje se expresaba a nivel de proteína y

si ésta se traficaba correctamente hacia la membrana, se comparó la expresión de un plásmido

que codifica y expresa debidamente la subunidad α del canal BKCa con la expresión del

plásmido que codifica para el canal BKcore-tail purificado tras el subclonaje.

Las células HEK 293 se transfectaron con los plásmidos anteriores por separado siguiendo el

protocolo de transfección. Las células que por lo tanto se encuentran en cubres con poly-L-

lisina se lavan con DPBS+ y se fijan con parafolmaldehido [Tabla 5]. Tras 20 minutos a

temperatura ambiente se vuelven a lavar con DPBS+ y se dejan agitándose suavemente 10

minutos con solución de Quench. Tras otro lavado con DPBS+ se bañan durante 30 minutos

con la solución de Permeabilización y bloqueo y se incuban overnight en una cámara húmeda

con el anticuerpo primario.

28

Al día siguiente se lavan los cubres con la solución de Permeabilización y bloqueo y se incuban

durante 2 horas a temperatura ambiente y a oscuras con el anticuerpo secundario, el cual, lleva

consigo un fluorocromo excitable con la longitud de onda 488nm que, al ser exitado, emite una

longitud de onda 536nm mostrando las células donde se haya dado la reacción verdes.

También se utilizó el marcador DAPI que permite la localización de los núcleos celulares

(excitación 350nm, emisión 470nm, azul).

Se probaron dos anticuerpos distintos descritos en la Tabla 6. Para el anticuerpo extracelular,

se modificó la solución de Permeabilización y Bloqueo (prescindiendo de la saponina en los

componentes causante de la permeabilización membranal).

Tabla 5: Clasificación de los reactivos utilizados en el ensayo de inmunofluorescencia.

Reactivo Acción Composición

Buffer de fosfato salino

suplementado (DPBS+)

Solución isotónica que

se emplea como

vehículo neutro para

las células.

NaCl 136.9mM, Na2HPO47H2O 8mM, KCl 2.7mM,

KH2PO4 1.5mM, MgCl26H2O 0.5mM y CaCl2

0.9mM. Ajuste del volumen con agua MiliQ.

Llevada al pH: 7.4 con KOH.

Permeabilización y

bloqueo

Permeabilizar la

membrana y bloquear

las uniones

inespecíficas.

Gelatina 0.7% (peso/volumen), NaN3 0.02%

(peso/volumen) y Saponina 0.025%

(peso/volumen). Llevada al volumen deseado con

DPBS+.

Quench

Disminuir una posible

autofluorescencia.

Glicina 75mM [Sigma] y NH4Cl 20mM [Sigma].

Llevada al volumen deseado con DPBS+.

Parafolmaldehido

Fijar las estructuras

celulares.

Al 4%. Llevada al volumen deseado con DPBS+.

Tabla 6: Anticuerpos utilizados en el ensayo de inmunofluorescencia.

Anticuerpo

Primario Procedencia Tipo

Epítopo

correspondiente

Anticuerpo

secundario

Anti-Slo1/BKAlpha

potassium channel.

Dilución: 1:200

NeuroMab Monoclonal/Ratón

Residuos

aminoacídicos

690-715

(Intracelular)

Anti ratón-Alexa

488

Dilución: 1:1000

Anti-KCa1.1 (BKCa)

Dilución: 1:200 Alomone Labs Policlonal/Conejo

Residuos

aminoacídicos

199-213

(Extracelular)

Anti conejo-Cy2

Dilución: 1:1000

29

4.4.4.4. RESULTADOS RESULTADOS RESULTADOS RESULTADOS YYYY DISCUSIÓNDISCUSIÓNDISCUSIÓNDISCUSIÓN

Como se menciona anteriormente, un estudio reciente del Centro de Genética Cardiovascular,

demuestra que el compuesto DiBAC4(3) es capaz de activar a los canales BKCa nativos, en

ausencia de la subunidad β1 o β4 (Scornik et al, 2013), a diferencia de lo que habían postulado

Morimoto et al., (2007). Más aún, se reportó que los canales BKCa recombinantes se activan por

DiBAC4(3) también en ausencia de las subunidades auxiliares, aunque en menor medida. Esto

indica que posiblemente haya un sitio de unión para el colorante DiBAC4(3) en la subunidad α,

mientras que la subunidad β1 actuaría como moduladora (Bosch et al. 2014).

Basados en los estudios recientemente publicados sobre el efecto modulador del DiBAC4(3) en

relación a la subunidad β1; y dada la naturaleza modular de los canales BKCa, se planteó

dilucidar cuáles módulos intervienen en los mecanismos de activación del DiBAC4(3) y su

potenciación por la subunidad β1.

El presente trabajo se diseñó en base a la reciente disponibilidad de un constructo que permite

la tetramerización funcional de la región central (core) del canal, que contiene al VSG y PGD,

pero no incluye al CTD (Budelli & Geng 2013).

El primer objetivo de este trabajo ha sido conseguir expresar el core del canal BKca en una

línea celular de mamífero y para ello, ha sido necesario subclonar la secuencia BKCa-core en el

plásmido que permitía la expresión en dichas células, el pcDNA3.1(+). El desarrollo y

resultados de este objetivo han sido incluidos en la sección de metodología.

Como se mencionó anteriormente, si bien los controles de digestión enzimática y la

secuenciación del producto obtenido en el procedimiento de subclonación fueron los

esperados, el rendimiento de las purificaciones fue bajo. Aun así se obtuvieron resultados

preliminares que demuestran que la transfección en células de mamífero del plásmido

pcDNA3.1(+)_BK core, expresa una corriente que muestra características de BKCa.

Caracterización de las corrientes macroscópicas del canal BKcCaracterización de las corrientes macroscópicas del canal BKcCaracterización de las corrientes macroscópicas del canal BKcCaracterización de las corrientes macroscópicas del canal BKca a a a core en core en core en core en las líneas celulares HEK 293 y las líneas celulares HEK 293 y las líneas celulares HEK 293 y las líneas celulares HEK 293 y CHOCHOCHOCHO----K1K1K1K1....

Como primera etapa de este objetivo, utilizando la técnica de patch-clamp, se caracterizaron

las corrientes endógenas propias de cada tipo celular, CHO-K1 y HEK 293. Para ello, se

registraron las corrientes en condiciones de K+ simétricas y siguiendo los distintos valores de

potencial descritos previamente [Figura 9].

En un registro de este tipo, lo que se observa es que para cada valor de potencial, se distingue

una corriente macroscópica (generada en ese momento por todos los canales de una célula)

30

cada vez mayor a medida que se incrementa el voltaje aplicado. Este protocolo, permite luego

construir curvas donde se relaciona la corriente macroscópica (corriente promedio estacionaria,

medida en pA) con el voltaje aplicado (medido en Vm). A partir de estos gráficos, se comparan

los registros entre distintas células o entre distintas condiciones, como por ejemplo, la

aplicación de drogas que bloquean determinadas corrientes.

En la Figura 12, se compara un registro de corriente nativa de una célula CHO-K1 (A) con el de

una célula HEK 293 (B). Se puede observar que mientras que la corriente estacionaria, medida

al final del pulso en las células CHO-K1 no llega a 100pA, en las HEK 293, la corriente

estacionaria alcanza un valor cercano a los 500pA.

Figura 12: Registro de corriente macroscópica endógena de cada línea celular utilizada. A) Registro

de corriente macroscópica endógena de CHO-K1. B) Registro de corriente macroscópica endógena

de HEK 293. C) Curva de la corriente promedio estacionaria en función del voltaje comparando la

célula CHO-K1 y HEK 293. Las líneas de punto delimitan la región que se utilizó para calcular la

corriente promedio estacionaria. En las figuras restantes se utilizó una región similar.

31

La característica más llamativa de la comparación entre las dos líneas celulares es que la

corriente endógena máxima de CHO-K1 representa solo una quinta parte de la corriente

endógena de HEK 293.

No obstante, la obtención de estos resultados para la corriente endógena de HEK 293 no

sorprende si los comparamos con las conclusiones de algunos estudios previos que

caracterizaron este tipo de corriente. Éstos, ya avisaban sobre la existencia de canales

endógenos de calcio, cloro y potasio dependientes de voltaje en células HEK 293 (Berjukow et

al. 1996) (Zhu et al. 1998). Posteriormente, otro grupo afirmaba que la contribución que tenían

los canales de calcio y cloro sobre los registros de corrientes macroscópicas era prácticamente

nula comparada con la que ofrecían los canales endógenos de potasio (Avila et al. 2004).

Además, Avila et al. hipotetizan que esta corriente de potasio podría variar con el número de

pasajes que lleven las células en el momento de hacerles el registro electrofisiológico. De esta

manera se podría llegar a entender porqué cuando se utiliza la línea celular HEK 293 hay tanta

heterogeneidad de resultados en cuanto a su corriente nativa e incluso, según las condiciones

de cultivo, se pueden llegar a encontrar nuevas corrientes no descritas hasta entonces (Jiang

et al. 2002).

En este estudio, la corriente endógena de HEK 293 tiene una comportamiento verdaderamente

peculiar, ya que, primeramente aumenta de manera exponencial a potenciales muy poco

despolarizados (a los 50mV llega a su corriente máxima) y luego se satura y permanece en una

fase plateau.

Estos experimentos sugerirían, en principio, que las células CHO-K1 son un mejor modelo que

las HEK 293 para la expresión del BKCa-core ya que no tienen una corriente endógena

conspicua. De todas formas, era necesario saber cuál de estas líneas celulares expresaba

mejor el BKCa-core. Para ello se transfectaron células CHO-K1 y HEK 293 con el constructo

obtenido en el subclonaje (pcDNA3.1(+)_BKCa-core) y se registraron las corrientes

macroscópicas con el mismo protocolo anterior.

Las características farmacológicas de la corriente del canal BKCa han sido ampliamente

estudiadas y se sabe que se bloquean con bajas concentraciones (0.5-2mM) de

Tetraethylammonium chloride (TEA) o de Paxillina (bloqueante específico del canal BKCa)

(Gonzalez et al. 2012). Para caracterizar la corriente resultante de la transfección

pcDNA3.1(+)_BKCa-core se utilizaron ambos bloqueantes. Éstos se aplicaron mediante el

sistema de perfusión a las células en registro para conseguir, de esta forma, diferenciar la

corriente dependiente de los canales BKCa del resto de corriente endógena.

En los registros hechos con la línea CHO-K1 transfectadas con pcDNA3.1(+)_BKCa core, se

obtuvo, tal y como se observa en la Figura 14, una corriente promedio estacionaria que, a un

voltaje de 200mV, alcanza los 1000pA. En la curva de la relación corriente-voltaje [Figura 13C]

32

se observa que hasta que no se llega a un voltaje mayor a 100mV, la corriente aumenta de

manera lineal y no sobrepasa los 100pA. A partir de los 100mV, la corriente aumenta de

manera no lineal, sugiriendo la activación de canales dependientes de voltaje. La curva en rojo

muestra la amplitud de la corriente después de la aplicación de TEA (2mM). Se observa que

mientras que el TEA no afecta a la porción lineal de la curva, disminuye considerablemente la

porción no lineal, llegando a un valor máximo de 200 pA.

Estos resultados indican que la corriente que aparece a partir de 100mV podría deberse a la

activación del canal transfectado, BKCa core. Para confirmar esta observación habría que

comprobar estos resultados con un bloqueante específico del canal BKCa, como la Paxilina.

Debido a la baja eficiencia de transfección de las células CHO-K1 y del deterioro de las mismas

una vez transfectadas, no se pudo realizar ese experimento durante el curso de este trabajo de

maestría. Por lo tanto, a pesar de presentar, con estas células, la gran ventaja de no tener una

corriente endógena importante, se prosiguió con la caracterización funcional del canal BKCa

core con la línea celular HEK 293.

Figura 13: A) Registro de corriente macroscópica de una célula CHO-K1 que expresa el canal BKCa-

core. B) Registro de corriente macroscópica de CHO-K1 que expresa el canal BKCa-core tras la

aplicación de 2nM de TEA. C) Curva de la corriente promedio estacionaria por unidades de voltaje

(pA/mV) comparando la corrientes A y B. Obsérvese que la activación del canal está en los 150mV.

33

Como se puede ver en las dos figuras que siguen [Figura 14 y 15], la línea HEK 293 presenta

una corriente macroscópica definida de forma clara como corriente dependiente de BKCa-core.

Estas células resultaron en una transfección más eficiente y una mayor integridad después de

la transfección que las células CHO-K1, lo cual, permitió realizar protocolos de registro largos y

así completar los ensayos farmacológicos de TEA y Paxilina.

En la Figura 14 se demuestra como la corriente registrada disminuye notablemente por el

bloqueo de TEA y se recupera tras el lavado de dicho bloqueante.

Figura 14: A) Registro de corriente macroscópica de una célula HEK 293 transfectada con el canal BKCa-

core en condiciones control (a), tras la aplicación de 2nM de TEA (b), y luego del lavado de TEA (d). El

registro c corresponde a la diferencia entre las corrientes a y b. B) Curva de la corriente promedio

estacionaria por unidades de voltaje (pA/mV) comparando la corrientes a, b, c y d. Obsérvese que la

activación del canal comienza a los 100mV.

34

De manera similiar, en la Figura 15 se observa una disminución de la corriente causada por la

Paxillina, pero en este caso, la corriente no se recupera porque la Paxilina es una droga

irreversible, de forma que una vez se hace el ensayo, la corriente queda bloqueada.

La corriente registrada en los dos ejemplos [Figura 14 y 15] se ha procesado de manera que se

le resta a la corriente “control” (a) la corriente que se bloquea por TEA o Paxilina (b), siendo la

corriente “Sustracción” , la corriente sensible a TEA o Paxilina, la cual se debe a la activación

del canal BKCa-core.

Luego de esta caracterización preliminar de las corrientes del BKCa core, se realizaron co-

transfecciones de la subunidad α y la subunidad β1. Por otro lado se realizaron experimentos

en los que se añadieron 10 µM de DiBAC4(3) a la solución de pipeta, de manera de que este

fármaco llegue a la región intracelular del canal. Estos experimentos, realizados en células

HEK, no fueron exitosos debido a que no se pudo observar claramente una corriente BKCa core

Figura 15: A) Registro de corriente macroscópica de una célula HEK 293 que expresa el canal BKCa-core.

en condiciones control (a) y tras la aplicación de 2nM de Paxilina (b). El registro c muestra la diferencia

entre las corrientes a y b. B) Curva de la corriente promedio estacionaria por unidades de voltaje (pA/mV)

comparando la corrientes A, B, y C. Obsérvese que la activación del canal comienza a los 100mV.

35

distinguible de la corriente endógena de estas células. Por lo tanto, los objetivos 4 y 5 quedaron

sin resolverse dentro de los límites de este trabajo y serán realizados posteriormente.

La dificultad para registrar corrientes a partir del plásmido pcDNA3.1(+)_BK core puede

haberse debido a distintos factores. Una posibilidad era que el canal BKCa core no se localizara

en la membrana celular. Para confirmar que las corrientes registradas en células HEK 293 en

los experimentos mostrados, fueran debidas a la activación del canal BKCa core, se realizaron

estudios de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo específico para este canal en células

transfectadas y en células sin transfectar, como control de especificidad del anticuerpo.

En este ensayo se transfectaron, además, transitoriamente las células con el plásmido

pcDNA3.1(+)_BKα como control positivo ya que se tenía un conocimiento previo de que la

transfección de toda la subunidad α del canal BKCa se expresaba correctamente.

Por otra parte, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia con células transfectadas con el

canal BKCa-core pero sin marcarlas con el anticuerpo primario. De forma que el primer control

negativo informaba de la afinidad que pudiera tener el anticuerpo primario a otras proteínas que

no fueran el canal de interés y el segundo control negativo hacía constar la afinidad del

anticuerpo secundario también hacia otras proteínas que no eran el canal, ya que este ruido de

fondo entorpecería la lectura de los resultados.

Los datos de la inmunofluorescencia muestran un claro marcaje con el anticuerpo en las

células transfectadas con el canal BKCa [Figura16,A] y las trasfectadas con el canal BKCa-core

[Figura 16,B] y una ausencia de marcaje en las células no transfectadas [Figura 16,D].

No obstante, sí que existe una débil disminución del marcaje entre las células transfectadas

con el canal BKCa completo y las transfectadas con el canal BKCa-core, sugiriendo que la

escisión del dominio CTD del canal podría disminuir ligeramente la expresión de la proteína en

esta línea celular.

Por otra parte, el patrón de expresión en la membrana es el mismo que el observado en las

células transfectadas con el canal BKCa completo, es decir, no se observan cúmulos de

proteína en el citoplasma; por lo tanto, la codificación de la secuencia “tail” del canal BKCa-core,

necesaria para el tráfico del canal hacia la membrana celular, funciona correctamente en HEK

293.

Cabe destacar que los experimentos de inmunofluorescencia ilustrados, corresponden a

células transfectadas con el pcDNA3.1(+)_BKCa core obtenido en la primera purificación. La

inmunofluerescencia realizada a partir de células transfectadas con el plásmido

pcDNA3.1(+)_BKCa core obtenido en la segunda purificación, no mostraron tinción positiva

concluyente para el anticuerpo contra el BKCa (no mostrado en el trabajo). Esta purificación fue

la utilizada en los experimentos de la subunidad β1 y de DiBAC4(3). Es probable que la

cantidad de canal BKCa core en la membrana en estas condiciones no fuera suficiente como

para detectar corriente ni marcaje fluorescente.

36

Figura 16: Resultado del ensayo de inmunofluorescencia con células HEK 293 y el anticuerpo Anti

KCa1.1 (BKCa); realizadas con microscopio óptico invertido a 40X de aumento con aceite de inmersión.

(A) HEK 293 transfectadas con el plásmido pcDNA3.1(+)_BK α; (B) HEK 293 transfectadas con el

plásmido pcDNA3.1(+)_BKcore; (C) HEK 293 transfectadas con el plásmido pcDNA3.1(+)_BKcore sin

anticuerpo primario; (D) HEK 293 no transfectadas.

37

5555. CONCLUSIONES. CONCLUSIONES. CONCLUSIONES. CONCLUSIONES

Conclusión 1: El subclonaje del canal BKca core en el plásmido pcDNA3.1(+) ha permitido,

aunque limitadamente, la expresión de la proteína en la membrana de células de mamífero

CHO-K1 y HEK 293.

Conclusión 2: Las características electrofisiológicas de las células CHO-K1 permiten el

registro de corrientes de potasio sin interferencia de corrientes endógenas, no obstante el

rendimiento de la transfección es muy bajo. Las células HEK 293 expresan de manera un poco

más eficiente, pero la presencia de una corriente endógena conspicua puede dificultar la

interpretación de los registros.

Conclusión 3: Las corrientes obtenidas por la transfección del plásmido pcDNA3.1(+)_BKCa

core presentan características farmacológicas similares al canal BKCa canónico.

Consideraciones para Consideraciones para Consideraciones para Consideraciones para la continuación del la continuación del la continuación del la continuación del estudio.estudio.estudio.estudio.

Es necesario señalar que este estudio ha presentado complicaciones técnicas que no

permitieron completar los objetivos propuestos. De todas formas, los resultados preliminares

predicen que el estudio propuesto es posible. Para ello es necesario: aumentar el rendimiento

de la purificación del plásmido y de la transfección del mismo, así como probar otros modelos

celulares (por ejemplo células COS) que no expresen corriente de K+ endógena y permitan

registros estables.

Aunque en algunos registros como los que ilustran las figuras se observa claramente un

componente de la corriente que aumente con el voltaje de manera no lineal, en muchos

experimentos, la presencia de una corriente endógena de amplitud considerable, dificultaba

determinar claramente si la corriente que estábamos registrando era la de nuestro canal de

interés o era una corriente espuria. Por lo tanto, para comprobar su identidad era necesario

registrar repetidamente la misma célula con distintas bloqueantes específicos hasta responder

a esta cuestión. En este sentido es necesario señalar que llevar una y otra vez una misma

célula hasta los 200mV compromete seriamente la estabilidad de la membrana y por lo tanto la

continuación del experimento. Sin embargo, es necesario llegar a este potencial para empezar

a ver corriente BKCa-core ya que el canal, por la ausencia de su dominio CTD, se empieza a

activar cerca de los 100mV, como se observa en las figuras de registros. Aun así, llegando a

38

los 200mV, no se llega a saturar la corriente y esto es otro aspecto importante para la

descripción de la dependencia de voltaje de un canal iónico ya que la saturación de la corriente

implica haber alcanzado el estado de máxima probabilidad de apertura de todos los canales. La

relación de este parámetro con el voltaje es fundamental para describir el comportamiento del

canal y los cambios debidos a las manipulaciones experimentales.

De todos modos los resultados presentados en este trabajo son prometedores desde el punto

de vista del avance del conocimiento de la naturaleza modular del canal BKCa, ya que por

primera vez se ha logrado expresar solamente el dominio core del canal en un modelo celular

de mamífero.

39

6666. REFERENCIAS. REFERENCIAS. REFERENCIAS. REFERENCIAS

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42

Agradecimientos

A toda la gran familia gencardiana, Anna Iglesias, Rino, Sara, Marcel, Pedro,

Oscar, Eli, Ferran, Alexandra, Catalina, Mónica, Xús, Olallo, Melina, Mireia, Anna,

Javi, Helena, Irene, Bernat y todos los practicantes del tfg,

por hacer que cada nuevo estudiante esté como en casa desde el primer minuto

a Ramón,

como director del Centro de Genética Cardiovascular

a Cristina, por todo el principio, que no es poco,

por la paciencia y por esa profe que sin duda lleva dentro

a Serradesanferm, porque espero que no sea la última vez

que volvamos a compartir lugar y momento ;)

a Ariel, por todo ese mes

y sobre todo,

por lo A GUSTO que se está en su área, pese que la electrofisiología no es un huevo que se echa a freír…

¡Muchísimas gracias, Fabiana y Guillermo!