Libro Biotecnologia 2

BIOTECNOLOGÍAAPLICADABIOTECNOLOGÍAAPLICADA

CURSO DE CURSO DE

DR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓNDIRECCIÓN DEL CURSODR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓNDIRECCIÓN DEL CURSO

7ª Edición7ª Edición

Madrid, 13-16 de febrero de 2007Madrid, 13-16 de febrero de 2007

Este curso es posible gracias a una aportación educacional deEste curso es posible gracias a una aportación educacional de

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Índice

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5Miguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid

Proteómica y Medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz

Inmunoterapia humoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University

Introducción a la inmunoterapia celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41José R. Regueiro. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina. UniversidadComplutense. MadridEduardo Martínez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid

Células embrionarias pluripotentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57Miguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y Oncología.Centro Nacional de Biotecnología. CSIC-Pfizer

Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65Felipe Prósper. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular. ClínicaUniversitaria. Universidad de Navarra

Avances en terapia regenerativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89María Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Migueláñez, Jacobo Trébol López,Damián García OlmoCátedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina RegenerativaUnidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz. Madrid

Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas . . . . . . . . . . . . . . . . 103Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica(IMM-CNM). CSIC

Vectores de transferencia en terapia génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119Jesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones oncológicas

ÍNDICE

Índice

Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición

2

Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137Juan A. Bueren1 y Antonio Bernad2

1División de Hematopoyesis y Terapia Génica. CIEMAT2Departamento de Inmunología y OncologíaCentro Nacional de Biotecnología. CSIC

Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología . . . . . . . . . 157Alfonso Domínguez-Gil Hurlé. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario deSalamanca

Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéuticahumana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173Fernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid

Innovación tecnológica y nuevas terapias: obtención de anticuerposmonoclonales totalmente humanos: panitumumab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185José Luis Motellón. Amgen S.A.

Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europeade Medicamentos (EMEA). BWP (Grupo de Biológicos) y CHMP(Comité de Medicamentos de uso Humano) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197Sol Ruiz y Gonzalo Calvo. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios

Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimisedpharmacotherapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of HospitalPharmacy, Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands

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Introducción

Un año más nos complace presentar una nueva edición

del curso de Biotecnología Aplicada. La buena acogi-

da y el entusiasmo de ponentes y asistentes en cursos

previos nos ha servido de incentivo para trabajar en esta sexta

edición.

El rápido avance que durante los últimos años han experi-

mentado nuestros conocimientos en los múltiples campos de la

Biología y la Medicina ha puesto a nuestro alcance una infor-

mación abundante y crítica que crece de manera exponencial. Nunca anterior-

mente habíamos podido observar, desde una perspectiva tan múltiple y diversa,

el complejo escenario existente en la investigación y el desarrollo de nuevos

tratamientos. Nuevos problemas necesitan nuevas soluciones y, ahora más que

nunca, la innovación terapéutica se presenta como la clave para la consecución

de nuevos tratamientos eficaces y seguros.

La búsqueda de nuevas aproximaciones en investigación y desarrollo se ha

beneficiado de las aportaciones de nuevas y revolucionarias herramientas, entre

las que la Biotecnología brilla con luz propia. Ella nos ha permitido, por pri-

mera vez en la historia, ser capaces de producir mediante manipulación genéti-

ca los compuestos deseados y crear o modificar nuevos fármacos, siguiendo un

diseño determinado para mejorar sus propiedades terapéuticas.

Los productos biotecnológicos han pasado de ser una parte minoritaria en

el arsenal terapéutico, a ser cada vez más indispensables en el tratamiento de

millones de pacientes. Gracias a esta incorporación de la Biotecnología a la

práctica clínica habitual, enfermedades graves pueden ser hoy día tratadas con

éxito, y pacientes con una deteriorada calidad de vida pueden realizar ahora sus

tareas cotidianas.

La Biotecnología alcanza hoy múltiples campos de la investigación médi-

ca, en los que hemos asistido gracias a ella a notables avances. Así ha ocurrido

por ejemplo en el campo del diagnóstico, en el descubrimiento de nuevas dia-

nas celulares, en la potenciación de proteínas naturales y en la mejora de trata-

mientos previos biotecnológicos que permiten aumentar su eficacia y tolerabili-

INTRODUCCIÓN

Introducción


4

dad. Un buen ejemplo de ello son las nuevas tecnologías que han permitido de-

sarrollar anticuerpos totalmente humanizados, o pequeñas moléculas de síntesis

química que actúan sobre múltiples dianas terapéuticas.

La Biotecnología ha recorrido un largo camino, pero las posibilidades que

puede brindar en el futuro son enormes. La interdependencia absoluta entre to-

das las partes implicadas hace de la buena combinación de esfuerzos y siner-

gias entre todas estas partes el factor, probablemente, más importante para se-

guir avanzando. El reto está en potenciar la innovación y la defensa de la

calidad de los productos biotecnológicos. Sólo a través de la continua y estre-

cha interacción entre los diferentes sectores de la investigación, tanto públicos

como privados, con profesionales del ámbito clínico, será posible encontrar

nuevos horizontes en este campo. Para que nuestro país logre ser puntero en

este sector, todo ello deberá estar potenciado por un ambiente de apoyo a la in-

novación dentro del marco macroeconómico.

En el marco de esta colaboración, el Curso de Biotecnología Aplicada en

su 7ª edición que ahora se presenta ofrece de nuevo la oportunidad de que pro-

fesionales de diversos sectores: centros de investigación, farmacia hospitalaria,

clínicos y la industria biofarmacéutica se reúnan en una plataforma de forma-

ción sobre los aspectos más relevantes ligados con la investigación biotecnoló-

gica, especialmente desde el punto de vista más básico y técnico en busca de

nuevas perspectivas y aplicaciones prácticas de la investigación biotecnológica,

y explorar las nuevas líneas de trabajo que han de arrojar, en breve plazo, nue-

vas opciones terapéuticas de relevancia científica y clínica.

Agradecemos su interés por esta nueva edición del curso y esperamos que

encuentren esta iniciativa útil y provechosa.

José Luis Motellón

Juan Bueren Roncero

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Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes

SISTEMAS DE ANÁLISIS MOLECULAR MASIVO

Matrices tisulares (tissue arrays)

Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de análisis masivo. Para

ello crean un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones pre-

definidas hasta 800 cilindros de 600 a 1000µ, procedentes de biopsias de aguja

efectuadas sobre bloques de parafina preexistentes.

Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marca-

dores relacionados en una serie amplia de muestras, útil en IHQ, FISH, HIS,

TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVODE LA EXPRESIÓN DE GENESMiguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid

Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posiblela utilización de tecnologías en Genómica y Proteómica,capaces de analizar la diversidad y complejidad de cadatipo de cáncer, enfocadas hacia el diagnóstico molecularde tumores, adecuando la terapia a cada paciente ycontribuyendo a la identificación de genes relevantes encáncer esporádico y familiar1.De interés particular es la aplicación de los sistemas deanálisis molecular masivo a la predicción de respuesta atratamientos individuales. Numerosos estudios handemostrado la capacidad de generar estos modelospredictivos aplicados a supervivencia, metástasis, respuestaa tratamientos concretos2-5. Todos ellos, en mayor o menorgrado, adolecen del mismo defecto, la insuficientereproducibilidad de los resultados generados, cuando sonaplicados en un contexto distinto; es decir, en otros centros,por otros especialistas, o usando una tecnología diferente4,6.



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complementario a microarrays de cDNA. Indicaciones típicas de esta técnica

son control de calidad, análisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de

cánceres de pequeño tamaño, establecimiento de modelos predictivos basados

en expresión de proteínas.

La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, así como

de cuantificar la expresión de una marcador preciso, abre el camino de un uso

más ambicioso de las matrices tisulares (MTA)7,8.

SNPs

Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debi-

das a sustituciones de una base. Hay actualmente descritos por encima de tres

millones en todo el genoma -SNP Consortium (TSC) & Human Genome Pro-

ject (HGP)-, con una densidad mínima de 1 SNP/1.9 kb. De ellos, hay 60.000

SNPs en exones, lo que refleja una mayor densidad de los mismos en regio-

nes exónicas, más investigadas, hasta una densidad de 1 SNIP/1.08 kb. El

numero de polimorfismos existente está en el rango de 10 a 15 millones por

individuo9,10.

El análisis de SNPs permite realizar estudios de genética de poblaciones,

estudio de genes candidatos para asociación con enfermedades precisas, análi-

sis de resistencia a fármacos, sensibilidad/toxicidad a drogas, así como infor-

mar de la predisposición individual a contraer enfermedades complejas, multi-

génicas9,10. Así, la mejora en las posibilidades de detección masiva de

polimorfismos abre el camino a estudios que relacionen variabilidad genética

con riesgo a formas precisas de cáncer y sensibilidad individual a drogas.

CGH-Arrays

Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u

oligonucleótidos. BACs son cromosomas artificiales humanos conteniendo

secuencias de DNA de longitud variable entre 100 a 200 kb. Hay actualmen-

te clones disponibles para todo el genoma, que cubren el genoma con una

alta densidad. Su uso permite el diagnóstico preciso de deleciones, duplica-

ciones, inserciones y reordenamientos. La disponibilidad de miles de BACs

ha permitido el desarrollo de chips de BACs (CGH-arrays), que permiten

detectar duplicaciones y deleciones con una sensibilidad de 100 Kb11. Para

ello se realiza hibridación comparativa entre DNA de un paciente/DNA suje-

to sano, o DNA tumoral/DNA constitucional. Un ejemplo de ello es la re-

ciente publicación de un array de BACs especifico para la LLC-B, desarro-

llado por P Lichter12.

Existen también microarrays comerciales de CGH basados en oligonucleó-

tidos, con resolución más fina que los basados en BACs y un alto potencial en

investigación y diagnóstico13.

Matrices de cDNA (Oncochip) u oligonucleótidos

Un microarray de DNA es un sistema miniaturizado en el que fragmentos

de DNA se inmovilizan en soportes sólidos. Desde un punto de vista de longi-

tud de la sonda usada, hay 2 tipos de microarrays de DNA: microarrays de cD-

NA que presenta sondas de cientos de bases y arrays de oligonucleótidos con

sondas de 20-25 bases o 50-80.

Estos chip o microarrays consisten en un soporte sólido, por ejemplo un

portaobjetos, sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de

cDNAs específicos (u oligonucleótidos) representantes de otros tantos genes.

Por analogía con el término chip micro-electrónico (dispositivo con una alta

densidad de circuitos electrónicos), en biología molecular también se ha utili-

zado el término de biochip de expresión para denominar a los arrays de DNA,

ya que son dispositivos de pequeño tamaño (chip) en los que se alcanza una

gran densidad de material biológico (bio) inmovilizado sobre una superficie

sólida. Un chip puede ser hibridado simultáneamente con dos sondas de

cDNA marcadas diferencialmente (por ejemplo con los fluorocromos Cy3 y

Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las muestras a comparar (por

ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser marcado con un úni-

co fluorocromo.

Después de la hibridación, y utilizando un scanner, puede medirse para ca-

da spot de cDNA la intensidad de cada uno de los fluoróforos, siendo el nivel

de señal detectado proporcional al número de copias de mRNA en la muestra;

de modo que el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constitu-

ye una medida de la expresión génica diferencial relativa al cDNA representa-

do en el chip ("ratios" de expresión).

El alto grado de integración del array permite, en un solo ensayo, obte-

ner multitud de valores de expresión génica relativa para distintas condicio-

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nes biológicas, lo que convierte a esta técnica en una herramienta de alto

rendimiento para trabajos en el área de la genómica funcional. El gran volu-

men de datos generados debe ser tratado con herramientas y métodos bioin-

formáticos14,15.

ANÁLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS

Los datos generados en estos experimentos precisan de análisis bioinfor-

mático, que esencialmente pretenden:

• Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada.

• Identificar genes cuya expresión se asocia a eventos específicos.

• Asignar función biológica a los genes resultado del experimento.

• Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a lo largo del tiempo.

• Simplificar series de genes al mínimo numero de datos posible.

• Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos.

Diversas herramientas informáticas están disponibles para este objetivo,

entre otras las desarrolladas en el CNIO (GEPAS) y alojadas en la pagina web:

http://gepas.bioinfo.cnio.es/index.html

LIMITACIONES DE LOS MICROARRAYS DE DNA

Como otras técnicas usadas en investigación, los microarrays tienen limi-

taciones, como:

1. Secuencias no verificadas. Hay un proceso constante de reasignación y

edición de las secuencias inicialmente descritas. No obstante, las últimas ver-

siones de los sistemas más comercializados contienen muy escasos errores de

asignación.

2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. Nive-

les altos de expresión de ARN o proteína no necesariamente implican activa-

cion funcional del gen preciso, y de hecho ocasionalmente implican secuestro o

anulación funcional. En este sentido, conclusiones elaboradas a partir de datos

generados por estudios de microarrays deben de ser entendidos como hipótesis

necesitadas de verificación experimental.

3. Ruido biológico. Sistemas celulares críticos están caracterizados por

una alta redundancia. En parte, la variabilidad Inter.-experimental es depen-

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diente de fenómenos azarosos, u oscilaciones cíclicas, no relacionadas con el

objeto del experimento.

4. Falta de estandarización de técnicas de análisis. La mayoría de las

plataformas usadas para análisis genómico han alcanzado un alto gado de ro-

bustez, pero aún adolecen de una reproducibilidad subóptima, cuando los resul-

tados obtenidos con diversas plataformas son comparados entre sí. El impres-

cindible gold standard en validación de datos sigue exigiendo comprobar el

valor de los datos obtenidos en una nueva población de casos.

PCR CUANTITATIVA

Aunque sobre un número menor de genes, existen actualmente plataformas

comerciales que permiten investigar un numero limitado de genes en sistemas

de PCR a tiempo real, dotados de una alta sensibilidad y reproducibilidad. Adi-

cionalmente, datos cada vez mas numerosos muestran que esta técnica es apli-

cable, en determinadas condiciones, a RNA extraído de material parafinado.

El carácter multigénico de alguno de estos análisis (realizados sobre plata-

formas o tarjetas de hasta 384 pocillos) ha llevado a su denominación como

chips de baja densidad.

La alta reproducibilidad de estos experimentos facilita la expansión de esta

tecnología y su uso en la aplicación clínica de datos surgidos de análisis reali-

zados con microarrays de alta densidad. Así, existen en la actualidad diversos

ensayos clínicos enfocados a la predicción de respuesta a terapia basada en da-

tos de expresión obtenidos con PCR en tiempo real, por ejemplo en carcinoma

de mama.

DETECCIÓN DE PROTEÍNAS COMO MARCADORES SÉRICOS

Múltiples grupos de investigación coinciden en el objetivo de identificar

marcadores séricos informativos de riesgo de contraer enfermedades específi-

cas, o adecuados para el seguimiento de enfermedad residual mínima16. La idea

no necesita apenas justificación, el análisis de suero es una técnica mínima-

mente invasiva, que permite monitorizar con frecuencia cambios previos al

diagnóstico clínico o a lo largo de la enfermedad. Resultados iniciales obteni-

dos en cáncer de ovario, páncreas o próstata alentaron esta línea de trabajo,

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usando SELDI-TOF-MS. Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja

reproducibilidad y una elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso

como técnica de análisis rutinario en análisis de poblaciones a riesgo de contra-

er enfermedades específicas17,18.

DETECCIÓN DE FOSFOPROTEÍNAS EN CÉLULAS INDIVIDUALES

Recientes datos experimentales coinciden en que tanto el mecanismo de

acción de drogas, como la sensibilidad a las mismas, es desvelado con mayor

precisión recurriendo a análisis de proteínas inducidas por la acción de estas

drogas, bien en modelos o pacientes. Así, agentes que dañan el DNA inducen

fosforilación de sensores de daño a DNA, mientras que agentes cuya diana está

constituida por rutas de traducción de señal inducen cambios en el estado de

fosforilación de proteínas críticas en estas rutas. La disponibilidad de anticuer-

pos contra diferentes estados funcionales de estas proteínas permite usar la ci-

tometría de flujo como técnica de análisis de estos cambios, con la ventaja de

que esto nos permite reconocer la existencia de cambios sutiles en subpobla-

ciones celulares minoritarias19-21.

APLICACIONES EN FARMACOGENÓMICA

Las matrices de cDNA permiten también establecer el llamado perfil genó-

mico de un fármaco, o firma molecular del mismo, además de establecer fir-

mas moleculares predictivas de sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto

de vista clínico tiene mayor interés identificar marcadores iniciales, al diagnós-

tico, de sensibilidad a drogas precisas, alcanzar este objetivo tropieza con los

mecanismos de acción múltiples de la mayoría de las drogas en uso, así como

con la existencia de múltiples sistemas redundantes de promoción de la super-

vivencia de las células neoplásicas. En la práctica, se ha demostrado que los

cambios inducidos por drogas son más informativos que alteraciones molecula-

res al diagnóstico3. Estos cambios pueden ser analizados in vitro -células tumo-

rales expuestas a la acción de drogas precisas- o in vivo - cambios en el tiempo

en células leucémicas tras tratamiento-.

De hecho, el tratamiento con un fármaco concreto de una línea celular es-

pecífica permite identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese

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fármaco. Estos genes muestran variabilidad en función de la droga, estirpe ce-

lular, alteraciones génicas precisas e intervalo de tiempo transcurrido hasta el

análisis. Su conocimiento permite proponer mecanismos de acción de una dro-

ga precisa.

Uno de los objetivos en análisis farmacogenómico es la identificación de

pacientes sensibles o resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga

depende de múltiples factores, incluyendo sobreexpresión de genes de resisten-

cia a drogas, incremento en la reparación de DNA, o alteraciones en la sensibi-

lidad celular a quimioterapia, afectando a múltiples rutas. Marcadores de resis-

tencia o sensibilidad identificados en modelos experimentales en el laboratorio

o en pacientes aislados pueden perder interés cuando se estudian sobre series

largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la relevancia clínica

de los genes así identificados en series de pacientes tratados de forma randomi-

zada.

Una aplicación extremadamente relevante de estos estudios es la identifi-

cación de dianas terapéuticas y el análisis de rutas. Esencialmente, la informa-

ción derivada de estos estudios brinda la oportunidad de proponer nuevas dia-

nas que, después de validación experimental, permitan el desarrollo de drogas

racionalmente dirigidas.

FUTURO EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE GENÓMICAY PROTEÓMICA

El alto potencial aplicado a investigación y diagnóstico de estas técni-

cas aún precisa de numerosos estudios adicionales, previamente a su aplica-

ción clínica masiva. Este carácter novedoso y el alto nivel de complejidad

de estos experimentos queda subrayado por el hecho de que aún se publican

muchas más revisiones o comentarios editoriales sobre técnicas de genómica

y proteómica que resultados originales. No obstante, cabe esperar que la

aplicación clínica de estas técnicas siga en incremento, cubriendo primero

una etapa de identificación de marcadores diagnósticos y, posteriormente,

propuesta y validación de dianas terapéuticas. El desarrollo de estas técnicas

de análisis molecular masivo, al mismo tiempo, está ofreciendo un reto para

el desarrollo de sistemas de análisis estadístico de múltiples variables y vali-

dación de datos.

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Proteómica y Medicina

INTRODUCCIÓN

Una de las consecuencias más beneficiosas derivadas del conocimiento del

Genoma Humano ha sido el gran impulso que se ha producido en el desarrollo

PROTEÓMICA Y MEDICINAFernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz

La medicina molecular se está desplazando muy rápidamentede la genómica a la proteómica ya que, al permitir el estudiode tejidos, células y líquidos biológicos, las alteraciones en lasproteínas constituyen auténticas firmas moleculares de losprocesos patológicos. Aunque todavía está en desarrollo enmuchas áreas, la proteómica ya está madura para empezar aser trasladada a la clínica. La proteómica clínica favorece ladetección precoz de la enfermedad, su monitorización, el usode terapias más efectivas y un entendimiento más profundo yglobal de la patogénesis. La utilización de perfiles proteicosdiagnósticos y pronósticos, de suero y de tejidos, constituyeuna auténtica revolución que puede cambiar el panorama de laanalítica clínica, acercándose a la medicina personalizada.Además, es un atajo para la detección de biomarcadores (haymas de 500 nuevas proteínas con interés clínico identificadaspor proteómica, frente a las 150 proteínas actualmenteutilizadas como marcadores clínicos) y dianas diagnósticas yterapéuticas, en un mercado claramente en expansión. Losperfiles proteicos de muestras tratadas con fármacospermiten, además, identificar posibles efectos secundariosdesconocidos, ya que permite detectar todas las proteínasque el fármaco altera. La proteómica clínica es ya una realidadde la Medicina del siglo XXI. En España es un área sindesarrollar, que debería ir implantándose en todos los grandeshospitales y centros de investigación biomédica.



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de la Proteómica. La descripción del genoma de los organismos (Genómica)

aporta un conocimiento esencial para el estudio de cualquier proceso biológico.

Sin embargo, tal conocimiento es tan necesario como insuficiente, porque las

funciones celulares dependen en última instancia de los productos finales de los

genes: las proteínas y sus interacciones, asociaciones macromoleculares, vías de

señalización, etc. De esta forma, la era post-genómica de la medicina molecular

se está desplazando rápidamente de los listados de genes, la transcriptómica y la

genómica funcional, a la proteómica. Ésta ha dejado de ser (como en sus ini-

cios) la producción de listas de proteínas que incrementan o decrecen su expre-

sión como causa o consecuencia de diversas condiciones o alguna patología.

Actualmente, la proteómica implica el conocimiento global de las proteínas, su

estructura y funciones, interacciones y modificaciones postraduccionales, rutas

de señalización, localización intra e intercelular, etc., para generar el mapa celu-

lar que permita entender los procesos biológicos en condiciones normales y pa-

tológicas (lo que ha venido a denominarse la biología de sistemas). En suma, la

proteómica es una actividad científica lo suficientemente madura, co-

mo para ser aplicada a la clínica humana con notables beneficios.

El proteoma comprende el conjunto de todas las proteínas que

resultan de la expresión del genoma de las células, tejidos u organis-

mos. No es algo estático como el genoma (relativamente) sino una

colección dinámica de proteínas que refleja tanto el programa gené-

tico propio de la célula como el efecto de su entorno (Figura 1).

Comparado con el genoma, el proteoma proporciona una visión más

realista del status biológico y se espera, por tanto, que tenga una

mayor utilidad que el análisis genómico, para evaluar y conocer la

enfermedad, su progresión y la respuesta al tratamiento farmacológi-

co. Así, la proteómica es el puente entre la

mera descripción de la secuencia de los ge-

nes y el comportamiento celular.

Cada gen puede producir varias formas

moleculares de una(s) proteína(s) que poste-

riormente son modificadas post-traduccio-

nalmente. Se han descrito más de 200 tipos

de tales modificaciones químicas (glicosila-

ción, prenilación, fosforilación, acetilación,

etc.), pudiéndose dar varias en una misma

Figura 1. Esquema de lasrelaciones entre genoma yproteoma. Mientras que elgenoma es comun a todaslas células yrelativamente estático, elproteoma está cambiandoconstantemente enrespuesta a lascondiciones de cadamomento.

proteína de manera permanente o transitoria. Tales modificaciones afectan a su

estructura y propiedades funcionales, vida media, localización intra y extrace-

lular, interacciones proteína-proteína, etc. El proteoma viene definido, por tan-

to, en términos de secuencia, estructura, abundancia, localización, modifica-

ción, interacción y función de las proteínas y constituye el fenotipo

característico de cada célula o tejido. Esta información no puede obtenerse del

genoma ni del transcriptoma (conjunto de ARN mensajeros transcritos), por lo

que el estudio de los proteomas es imprescindible y complementario de los da-

tos genómicos. Entre las muestras biológicas más importantes cuyo conoci-

miento del proteoma es esencial se encuentran los líquidos fisiológicos (suero),

ya que no tienen ácidos nucleicos. Por otra parte, las proteínas son la diana de

más del 90% de los fármacos, por lo que su estudio cobra mayor relevancia.

La proteómica se define habitualmente como el análisis del conjunto de

las proteínas que componen las células y se lleva a cabo mediante tres tipos

fundamentales de estudios:

A) Identificación y catalogación de las proteínas (y sus modificaciones

post-traduccionales) que constituyen los distintos proteomas, cuya in-

formación, almacenada en bases de datos, es un elemento esencial para

el resto de estudios proteómicos.

B) Proteómica de expresión diferencial, cuya finalidad es el estudio com-

parativo de una célula (o muestra biológica) en dos condiciones distin-

tas (un control sano frente al patológico, o tratado y sin tratar con un

fármaco, etc.) para detectar las proteínas que sufren modificaciones

químicas o alteraciones en sus niveles de expresión. Permite identificar

proteínas que puedan representar biomarcadores pronósticos, diagnósti-

cos y de seguimiento de una enfermedad y que, con frecuencia, pueden

ser nuevas dianas terapéuticas.

C) Proteómica del mapa celular, cuyo objetivo es el estudio de las interac-

ciones proteína-proteína, asociaciones macromoleculares, rutas de se-

ñalización, etc. Pretende construir un mapa físico de las interacciones

existentes entre las proteínas celulares, haciendo uso de técnicas es-

tructurales (rayos X, resonancia magnética nuclear) y cinéticas y de

herramientas bioinformáticas.

Una de las áreas con mayor actividad actualmente en proteómica es la

identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y la prevención de

las enfermedades prevalentes, cáncer, cardiovasculares, neurológicas, etc. Los

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avances en las estrategias diagnosticas convencionales (técnicas de imagen,

RMN, PET), están suponiendo una notable mejora, pero no poseen ni la sensi-

bilidad ni la especificidad requerida para detectar estados preclínicos, y además

su coste es muy elevado. Es bien conocido que mas del 50% de los infartos

agudos de miocardio ocurren sin síntomas previos y que más del 60% de los

pacientes con cáncer de mama, pulmón, colon y ovario, presentan ya metásta-

sis cuando son diagnosticados, y en ese estadio, las terapéuticas convencionales

tienen un éxito muy limitado. Hay, por tanto, una necesidad urgente de identifi-

car nuevos biomarcadores que eviten estas situaciones. Un marcador biológico

(biomarcador) es una molécula o característica, que puede ser medi-

do objetivamente y evaluado como un indicador de un proceso bio-

lógico normal o patológico, o de la respuesta farmacológica a una

intervención terapéutica. La búsqueda de biomarcadores puede lle-

varse a cabo en tejidos, en células (circulantes) o en líquidos fisioló-

gicos (fundamentalmente plasma o suero). En el caso de los tejidos

(biopsias por ejemplo) uno de los mayores obstáculos es la heteroge-

neidad celular, que puede complicar mucho el diseño y sobre todo

los resultados de los análisis proteómicos, al no tratarse de poblacio-

nes celulares homogéneas. Sin embargo, recientemente se ha desa-

rrollado una técnica muy útil para la obtención y purificación de es-

tirpes celulares puras a partir de cortes de tejidos, denominada

microdisección, mediante captura con láser que se ilustra en la Figu-

ra 2. Las preparaciones celulares homogéneas así obtenidas son muy

apropiadas para el análisis proteómico. Sin embargo, el tipo de

muestra idóneo para los estudios clínicos es el plasma o el suero, del

que puede obtenerse un perfil o patrón del conjunto de las proteínas

(y/o péptidos) presentes en cada momento y

que puede contener biomarcadores que refle-

jen el estado patológico y que posean valor

diagnóstico y/o pronóstico. Sin embargo, el

estudio de los proteomas o de los perfiles

proteicos de los líquidos biológicos (ver más

adelante), presenta un grado de complejidad

considerable que no existe en los estudios

genómicos, debido fundamentalmente a las

siguientes causas:

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Figura 2. Esquema delfuncionamiento de lamicrodisección mediadapor láser. Parte izquierda:observación al microscopiodel corte de tejido yselección de la zona deinterés. Centro: disparo delláser sobre la zonaseleccionada que catapultaa las células al tubo derecogida. Parte derecha:ampliación de la figura delcentro donde se observa elgrupo de células que sonselectivamente extraídasdel tejido.

a) El amplísimo rango dinámico de la concentración de proteínas en teji-

dos y especialmente en el plasma humano. Entre la concentración de

albúmina (milimolar; 50 mg/ml) y algunas interleuquinas (picomolar;

1-5 pg/ml) hay una diferencia de más de 10 logs. Ninguna técnica ana-

lítica ni proteómica abarca mas de 4-5 órdenes de magnitud. Además,

20 proteínas representan el 99% del contenido total de las proteínas

plasmáticas, lo que dificulta enormemente el análisis de las proteínas

presentes a baja concentración, donde con frecuencia se en-

cuentran los potenciales biomarcadores. Para el análisis de

plasma es necesario deplecionar de estas proteínas mayorita-

rias (Figura 3).

b) La presencia de diferentes formas moleculares de cada pro-

teína e isoformas. Muchos genes producen múltiples mR-

NAs, mediante diversos mecanismos (splicing alternativo,

mRNA editing, modificaciones co- y post traduccionales).

En promedio, en humanos, se estima que un gen genera al

menos 3-4 proteínas, por lo que considerando 30.000 genes,

pueden esperarse un mínimo de 100-200.000 proteínas. Ob-

viamente no todas las proteínas estarán presentes en todas

las células, tejidos, etc., pero el plasma contiene una gran re-

presentación de muchas de ellas.

c) Diversidad estructural. Dada su presencia en distintos entor-

nos (solubles, membranas, matriz, etc.) las proteínas son de

naturaleza muy diversa. Solo en tamaño pueden variar desde

50 aminoácidos (hay 2.500 anotados en el Swiss-Prot) hasta

casi 10.000 aminoácidos, como la Nesprina 1 (8746 aa).

Además, hay que considerar la pre-

sencia de múltiples modificaciones

postraduccionales que afectan a la

función, localización, etc., de las

proteínas.

d) Una gran mayoría de las proteínas

no actúan solas sino en asociación

con otras, creando por un lado, aso-

ciaciones macromoleculares, y por

otro, participando en multitud de ru-

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Figura 3. Depleción de lasseis proteínas mayoritarias

del plasma utilizando uncromatógrafo líquido

(FPLC) y una columna deafinidad que posee

anticuerpos específicosfrente a las 6 proteínas. Alaplicar el plasma sobre lacolumna la mayoría de las

proteínas fluyen sin serretenidas ("low abundant

proteins") yposteriormente las

proteínas mayoritarias soneluidas ("high abundant

proteins"). En la parteinferior se muestra el

análisis mediante 2-DE deambas fracciones.

tas de señalización, metabólicas, etc. El conocimiento de las interaccio-

nes proteicas y la descripción del mapa celular es esencial para enten-

der la fisiopatología de cualquier sistema biológico.

Sin embargo, el conocimiento de los proteomas ofrece la visión óptima de

lo que ocurre en la célula, tejido, líquido fisiológico, etc., por lo que es necesa-

rio su determinación.

PROTEÓMICA CLÍNICA

A pesar de la complejidad antes citada, el rápido y notable desarrollo de

la Proteómica en los últimos años, ha conducido a su aplicación a los proce-

sos patológicos o Proteómica Clínica. La proteómica está especialmente "ca-

pacitada" para el estudio de la enfermedad porque se puede aplicar a las célu-

las, tejidos y líquidos biológicos. La aplicación clínica de la proteómica

implica el uso de las tecnologías proteómicas para todos aquellos aspectos que

puedan beneficiar a los pacientes: desde la búsqueda de nuevos marcadores de

enfermedad o de perfiles proteicos diagnósticos, hasta la descripción de facto-

res predictivos y preventivos que permitan un tratamiento y seguimiento tera-

péutico personalizado.

La Proteómica Clínica se ocupa de la identificación sistemática y exhausti-

va, a gran escala, de patrones proteicos de enfermedad y la aplicación de esos

datos a los pacientes (estudio de la enfermedad, susceptibilidad, prevención,

selección de terapias, seguimiento de los tratamientos, etc.). Dada la compleji-

dad de los procesos patológicos, la integración de las nuevas tecnologías prote-

ómicas con las bases de datos clínicas y las técnicas analíticas clásicas, sería

altamente beneficioso para la comprensión y el tratamiento de la enfermedad.

Entender, por ejemplo, las alteraciones tempranas en diversas enfermedades (tí-

picamente en cáncer o en los síndromes coronarios agudos), produce una nota-

ble mejora en la prevención e identificación de pacientes con riesgo y/o en es-

tado preclínico. La Proteómica Clínica pretende definir patrones de proteínas

que puedan generar información de valor clínico acerca de la susceptibilidad,

diagnóstico, pronóstico y terapia de la enfermedad. Testar hipótesis clínicas re-

levantes, frente a conjuntos de datos (masivos) derivados de medidas proceden-

tes de técnicas de alto rendimiento como las proteómicas, y poblaciones huma-

nas fenotipadas correctamente, es una función esencial de la proteómica

20



clínica. Para que la proteómica clínica impacte de manera real en la mejora de

la salud debe descubrir y seleccionar patrones proteicos, validarlos en estudios

poblacionales muy amplios y trasladarlos a la práctica clínica.

Aunque no se describe aquí, no debe olvidarse que el aprovechamiento

óptimo de la relación entre patrones proteicos y enfermedad, depende a su vez

de la integración con la información sobre la variación genética y la expresión

génica (arrays de DNA, genotipado, SNPs, etc.).

OBJETIVOS DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA

La finalidad de la Proteómica Clínica está, actualmente, centrada en al

menos los siguientes tipos de actividades:

Identificación de biomarcadores

La búsqueda e identificación de biomarcadores individuales se lleva a

cabo siguiendo la metodología proteómica clásica de separación de proteínas

(2-DE, DIGE, cromatografía multidimensional y electroforesis ca-

pilar) y su identificación por espectrometría de masas (MS; MAL-

DI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap, MALDI-TOF/TOF). Su estrate-

gia fundamental es el análisis de la expresión diferencial de

proteínas entre controles y muestras patológicas (Figura 4), de

proteomas completos (lisados celulares) o subproteomas específi-

cos (mitocondrias, membranas, etc.). Recientemente se está utili-

zando la cromatografía líquida (en una o varias dimensiones) apli-

cando diversos métodos de proteómica

cuantitativa que permiten la comparación

de los perfiles proteicos de varias muestras

simultáneamente (iTRAQ, SILAC, etc.).

Un aspecto fundamental es la determina-

ción de las modificaciones postraducciona-

les y su potencial implicación en patología.

En muchos casos los biomarcadores se

convierten simultáneamente en nuevas dia-

nas terapéuticas.

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Figura 4. Esquema delanálisis proteómico

diferencial. Lacomparación de los geles

2-D permite identificar lasproteínas

diferencialmenteexpresadas.

Obtención de perfiles proteicos

Consiste en el estudio sistemático, a gran escala, de las proteínas de una

muestra para la identificación de patrones o perfiles proteicos (huellas dactilares

proteicas), con carácter diagnóstico (discriminatorio) y/o pronóstico. Los escasos

biomarcadores identificados, y aprobados (por la FDA) en los últimos años, son

un reflejo de la estrategia habitual de testar una proteína individual, o llevar a ca-

bo análisis en pequeña escala, etc. Aunque existen excepciones (paraproteínas de

los mielomas, déficit de α1-antitripsina) es muy posible que no existan marcado-

res únicos de las enfermedades complejas, por lo que la estrategia proteómica de

estudiar paneles proteicos supone un paso cualitativo de gran trascendencia. Este

estudio se puede llevar a cabo mediante al menos tres estrategias:

A) Perfiles proteicos de plasma o suero

Se lleva a cabo analizando el suero/plasma de los pacientes con

la patología objeto de estudio (cardiovascular, neurodegenerativa, in-

fecciosas, cáncer, etc.) y alternativamente en otros líquidos fisiológi-

cos (lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquído, orina). Se utiliza

la técnica denominada SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser De-

sorption/Ionization-Time of Flight) para la generación de los perfiles

proteicos, que combina la retención de las proteínas del suero en

biochips con la determinación de sus masas moleculares mediante

MS, permitiendo generar gráficos donde se representa la abundancia

frente a la masa molecular de las proteínas, a modo de código de ba-

rras proteicos constituidos por miles de líne-

as que caracterizan el suero de cada indivi-

duo (Figura 5). La comparación de los

perfiles normales (individuos sanos) con los

obtenidos del suero de pacientes con distin-

tas patologías (se está utilizando en cáncer y

en patologías cardiovasculares, neurodege-

nerativas, osteoarticulares, respiratorias, in-

fecciosas...) permite obtener perfiles pronós-

ticos, diagnósticos, de seguimiento, de

tratamiento farmacológico, etc. Su poder

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Figura 5. Diferentes formasde representar elresultado del análisismediante SELDI-TOF de unamuestra de suero. En elpanel superior se muestrael resultado experimentaly en los dos inferiores trassu procesamientoinformático. Sólo semuestra la seccióncorrespondiente a lasmasas (m/z) comprendidasentre 3000 y 7000 m/z.

discriminatorio es muy superior al de marcadores únicos con los que se han

comparado (por ejemplo, PSA en cáncer de próstata, proteína C reactiva en in-

fección e inflamación). Como el análisis mediante SELDI-TOF utiliza muy po-

ca muestra (1 µl) y, además, es muy rápido (se pueden analizar cientos de

muestras al día) y automatizado, su potencial en clínica analítica es enorme y

puede ir sustituyendo muchas de las técnicas habituales de los laboratorios de

bioquímica clínica (enzimo-inmunoanálisis), que son más lentos, más caros

(utilizan anticuerpos fluorescentes), usan mayor cantidad de muestra y sólo in-

forman de un único marcador, frente a los miles que proporciona el SELDI-

TOF. A pesar de sus indudables ventajas, el sistema SELDI-TOF decrece su

sensibilidad y exactitud en la determinación de la masa para proteínas mayores

de 70 kDa, lo que es el caso de muchas de las proteínas plasmáticas humanas

(se conocen más de 3.000 actualmente). Por otra parte, su reproducibilidad no

es bien conocida, dado el todavía reducido número de investigadores que utili-

zan esta plataforma; además, en muestras tan complejas como el plasma huma-

no, el sistema de fraccionamiento inicial en los chips de retención necesita es-

tandarizarse mejor, por lo que se están definiendo actualmente unos estándares

cuantitativos de referencia. Sin embargo, el número de potenciales biomarcado-

res de enfermedad, identificados mediante SELDI-TOF, no deja de aumentar de

manera constante. Algunas de las críticas al sistema SELDI-TOF tienen un ori-

gen más económico que científico, dado el enorme mercado por el que compi-

te, el de la bioquímica clínica.

B) Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging

En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imágenes (mapas) bidimensionales

de proteínas (MS-Imaging), aplicando directamente la MS sobre cortes histoló-

gicos del tejido (cortes habituales sobre portaobjetos para microscopia óptica,

de 5-20 m de grosor), utilizando el MALDI-TOF o el MALDI-TOF/TOF. El

mapa bidimensional se obtiene haciendo incidir el láser (que "barre" la superfi-

cie de la muestra) del espectrómetro sobre los cortes histológicos recubiertos

de matriz (compuestos orgánicos que cristalizan atrapando las proteínas en el

cristal y absorben la energía del láser, siendo el conjunto sublimado) y anali-

zando las proteínas que son vaporizadas. Típicamente se obtienen 500-1.000

señales de proteínas individuales en cada punto del tejido, con masas entre 2-

70 kDa. De esta forma se obtiene la masa (m/z) de las moléculas (péptidos,

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proteínas) presentes en cada zona del tejido.

Seleccionando una masa dada (m/z) en los

distintos espectros de las diferentes zonas, se

genera un mapa bidimensional de la distri-

bución de esa proteína (esa m/z) a lo largo

del corte de tejido (a modo de cartografía

proteica). Se pueden obtener dos tipos de

datos: Perfiles proteicos (mediante una apli-

cación puntual de matriz y adquisición de

datos de cada punto) e Imágenes (recubrien-

do todo el tejido y haciendo un barrido del

mismo con el láser) (Figura 6).

Las imágenes son generadas mediante un software específico

que clasifica y agrupa las proteínas y compara diversas muestras,

permitiendo obtener imágenes tridimensionales de la distribución de

las proteínas del tejido. Este software también puede integrarse con

software de análisis histológico, permitiendo la cuantificación de su-

perficies e intensidades, así como la superposición con imágenes de

microscopia (histoquímica e inmunohistoquímica). Esta tecnología

implica un tipo de información totalmente nuevo para la descripción,

clasificación y caracterización de muestras histológicas, que está

permitiendo la identificación de biomarcadores, la localización de

proteínas específicas y en el campo de la oncología, por ejemplo, la

reclasificación de tumores. La técnica es compatible con los méto-

dos de tinción clásicos, lo que permite la integración de ambos tipos

de datos. El MS-Imaging puede aplicarse a preparaciones homogé-

neas de células, obtenidas del propio corte histológico mediante mi-

crodisección por captura con láser, incrementando así su resolución.

Esta tecnología puede complementar, o sustituir, muchas de las téc-

nicas manuales actuales (microscopia óptica, fluorescencia) en los

departamentos de anatomía patológica de los hospitales.

Una técnica muy similar (SIMS-TOF; secondary ion mass spectrometry)

permite el análisis (identificación y caracterización) de moléculas de bajo peso

molecular presentes en la superficie de una muestra (determinación del meta-

boloma). Hasta hace pocos años no se utilizaba con muestras biológicas debi-

do a la alta fragmentación que producía sobre los componentes biológicos. Sin

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Figura 6. Representaciónesquemática de losfundamentos del MS-Imaging. Sobre el corte detejido recubierto dematriz, se hace incidir unláser que va recorriendo lasuperficie del tejido y logravaporizar las proteínaspresentes en cada punto dela superficie, obteniéndoseun espectro de masas decada punto. Seleccionandouna masa (m/z) dada (quecorresponderá a unaproteína particular) a lolargo del tejido (en suscorrespondientesespectros), puedereconstruirse una imagen omapa bidimensional de lapresencia de dichaproteína.

embargo, el desarrollo de nuevas fuentes de

iones como los clústeres de metal líquido

(oro o bismuto) han ampliado el rango de

masa que puede ser analizado hasta los

1.000 Da. Esta limitación en el reducido

rango de masas analizado es compensada en

parte por la alta resolución obtenida (subce-

lular; hasta 200 nm/pixel) y por no necesitar

la utilización de ningún tipo de matriz (evi-

tando interferencia y deslocalización de las

muestras, se usa el tejido directamente) lo

que la convierte en una herramienta muy va-

liosa en patología. Además, como esta técnica se aplica para locali-

zar y mapear en el tejido moléculas pequeñas, particularmente fár-

macos (y su colocalización con proteínas), es de gran interés para la

industria farmacéutica.

Los fundamentos del SIMS-TOF Imaging son muy semejantes a

los descritos anteriormente para MALDI Imaging, siendo la princi-

pal diferencia las fuentes de ionización. Los iones primarios se gene-

ran utilizando un dispositivo denominado "liquid metal ion gun",

siendo seleccionados los clústeres de iones incidentes en base a su

masa y carga, focalizándolos en la muestra. El impacto de los iones

primarios en cada punto de la muestra (corte de tejido) genera iones

de la misma (secundarios), que son extraidos mediante un campo

eléctrico entre la muestra y las lentes de extracción. Cuando los iones secunda-

rios alcanzan el detector son convertidos en señales digitales y representados

en forma de un espectro de masas para cada posición de la superficie de la

muestra (x,y). Para cada ion detectado se puede representar su intensidad a lo

largo del tejido en forma de imagen tridiemensional, mostrando su abundancia

relativa, utilizando el mismo software que en el MALDI Imaging (Figura 7).

C) Micromatrices (chips o arrays) de proteínas

La obtención de perfiles proteicos, tanto de suero (u otros líquidos fisioló-

gicos) como de células o tejidos, puede también obtenerse a partir de la utiliza-

ción de chips (o micromatrices) de proteínas. Este es el sector de mayor creci-

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Figura 7. Esquema delfundamento del SIMS-TOF.Es similar a lo descritopara el MS-Imaging(Figura 6), salvo que lafuente de láser sesustituye por una fuentede iones (bismuto) y quelas moléculas liberadas deltejido corresponde acompuestos de bajo pesomolecular (<2000 Da). Noes necesario aplicar lamatriz sobre el tejido.

miento en el mercado proteómico, especial-

mente en el área de la proteómica funcional

(análisis de las propiedades bioquímicas y

celulares de las proteínas). No deben con-

fundirse los chips de proteínas (micromatri-

ces de proteínas capturadas o depositadas en

una superficie) con la miniaturización (y au-

tomatización) de las distintas técnicas bioa-

nalíticas proteómicas (2-DE, electroforesis

capilar, cromatografías) que se están desa-

rrollando en formato tipo chip ("the lab-on-

a-chip") basados en la tecnología de micro-

fluídica. Los chips de proteínas pueden clasificarse según muchos

parámetros (modo de fabricación, química de la superficie, especifi-

cidad, densidad, etc.). Sin embargo, es mejor sistematizarlos en dos

grandes grupos, en base a lo que capturan o analizan:

Chips analíticos: se utilizan para determinar las proteínas presen-

tes en una muestra (perfil de expresión) y su cuantificación. La disolu-

ción de la mezcla de proteínas a analizar se aplica sobre el chip, que

contiene agentes de captura que actúan como sondas. Los agentes de captura más

conocidos son los anticuerpos (Ab) en sus distintas modalidades: monoclonales

completos, Fab, scFv, afibodies (Ab sintéticos), dominios de Ab, etc. (Figura 8).

El uso de Ab no está exento de problemas: inespecificidad, reacciones cruzadas,

orientación, afinidad, etc. Otra alternativa son los chips de antígeno para analizar

el perfil sérico de Ab (y autoAbs en enfermedades autoinmunes), como los chips

de alergénos para la detección de IgEs en respuestas alérgicas.

Recientemente se están generando una plétora de agentes de captura distintos

a los Abs, como péptidos, moléculas orgánicas, polímeros sintéticos, oligonucleóti-

dos, aptámeros, ribozimas, trinectinas (derivados de la fibronectina), MIPs (mole-

cular imprinted polymers: compuestos que se polimerizan sobre las proteínas cre-

ando moldes para su uso posterior), etc. A pesar de esta diversidad, la captura de

las proteínas (y los métodos de detección) constituye el gran problema de los chips

proteicos: no existen todavía agentes de captura de alta calidad que puedan inmovi-

lizarse en la superficie de un chip y que permitan unir, detectar y cuantificar una

mezcla compleja de proteínas. Este problema está retrasando no sólo el desarrollo

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Figura 8. Esquema delanálisis comparativo dedos muestras (marcadascon dos fluoróforosdiferentes, Cy3 y Cy5)mediante chips omicroarrays(micromatrices) deanticuerpos.

de los chips proteicos, sino de la industria proteómica en general. La investigación

proteómica está generando multitud de biomarcadores potenciales y nuevas dianas

terapéuticas, pero tiene el cuello de botella del cribado y la validación de fármacos

y los chips de proteínas parece el método adecuado para solucionarlo.

Los chips de fase reversa son de especial relevancia en Medicina porque

permiten determinar las proteínas implicadas en las rutas de señalización celu-

lar en las biopsias de los pacientes. En ellos, las biopsias (típicamente de tumo-

res o cardíacas) se lisan y se depositan en diluciones sucesivas como microgo-

tas (utilizando los mismos robots que para la fabricación de los chips de ADN);

posteriormente, son revelados con Abs validados (que reconocen proteínas fos-

foriladas y kinasas, a fin de determinar el grado de activación de las diferentes

rutas de señalización), obteniéndose información cualitativa y cuantitativa para

cada paciente, lo que permite un tratamiento personalizado. Existen actualmen-

te cerca de 1.000 Abs validados. Mediante estos arrays puede determinarse si-

multáneamente el estado de fosforilación de las proteínas implicadas en las

principales rutas de señalización intracelular. En este tipo de chip se depositan

pequeños volúmenes (nl) de lisados de tejidos (biopsias de tumores, segmentos

de carótidas procedentes de las endarterectomías) o de células obtenidas me-

diante LCM de los mismos tejidos, sobre una superficie plana (portaobjetos)

usando un microarrayer. Cada microgota contiene el conjunto de todas las pro-

teínas, fosforiladas y no fosforiladas, contenidas en una muestra. Las proteínas

de interés (fosforiladas) se detectan con anticuerpos específicos y se comparan

con las no-fosforiladas. Con arrays de alta densidad pueden detectarse miles de

muestras en un porta. La utilización de los arrays de fase reversa permite así

obtener un tipo de información molecular único e individualizado de cada

muestra, y por tanto de cada paciente. Este nuevo tipo de array proporciona

perfiles de señalización intracelular, incluyendo las modificaciones postraduc-

cionales, datos que no son accesibles mediante técnicas genómicas.

Chips funcionales: estos chips se utilizan para determinar actividades bio-

químicas e interacciones moleculares. Las proteínas de interés se inmovilizan

en el chip y se analizan sus funciones biológicas e interacciones incubándolas

con distintas moléculas (otras proteínas, metabolitos, sustratos de enzimas,

DNA, etc.). Los dos problemas principales de estos chips son la producción de

colecciones extensas de proteínas y su mantenimiento en forma activa en el

chip. Sin embargo, para grupos de proteínas con características funcionales si-

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milares (factores de transcripción, receptores, kinasas) hay un gran campo por

desarrollar en clínica humana.

Análisis y procesamiento de datos: Bioinformática

La enorme cantidad de datos que se están generando mediante la enumera-

ción de los componentes celulares (genes y proteínas), sus funciones e interac-

ciones, a partir de la genómica y la proteómica, está transformando la Biología

y la Medicina. Esta información está siendo recopilada en diversas bases de da-

tos como las relativas a los geles 2-D de proteínas, proteomas de las distintas

estirpes celulares y sus subproteomas, etc. Se están desarrollando multitud de

herramientas informáticas dedicadas al análisis de imagen de los geles 2-D, a

la interpretación de los espectros de masas, a la secuenciación de las proteínas

de forma automática fiable, a los métodos de cuantificación, etc. Uno de los

objetivos fundamentales de la proteómica clínica es la utilización de herra-

mientas bioinformáticas (y bioestadísticas) para el almacenamiento y procesa-

miento analítico de los datos masivos generados por proteómica. Su finalidad

esencial es el desarrollo y aplicación de métodos de jerarquización y clustering,

visualización de datos, algoritmos estadísticos multivariable, para definir los

perfiles específicos de las distintas patologías. Una necesidad inmediata es la

creación de bases de datos de proteínas implicadas en las distintas patologías,

sus interacciones, participación en rutas de señalización, etc., así como su rela-

ción con los datos genómicos. La aplicación de estos métodos a gran escala no

está desarrollada y deben implementarse para poder definir claramente cuál es

el patrón "normal"(no existe actualmente) y poder discriminar, posteriormente,

los patológicos y su gradación. Esto es esencial para poder definir y establecer

test multiparámetricos. Además, hay que desarrollar métodos que integren de

forma efectiva la información procedente de diversos niveles biológicos (perfi-

les proteicos, niveles o concentraciones, imágenes histológicas, datos clínicos,

etc.). Es evidente que el análisis masivo de datos, y la integración de los distin-

tos niveles de información, sólo puede llevarse a cabo mediante una plataforma

bioinformática proteómica, que constituye uno de los elementos claves de cual-

quier unidad de Proteómica Clínica.

Sin embargo, lo más destacado es la aparición de nuevas herramientas in-

formáticas y bases de datos, con una orientación totalmente diferente, fisiológi-

ca y funcional, que intentan integrar el catalogo de proteínas y genes, para re-

28



flejar el comportamiento celular, analizando las rutas de señalización, las inte-

racciones proteína-proteína, los biomarcadores, los perfiles proteicos, etc. Ade-

más, esos datos deben ser integrados con los de la Medicina clásica (historia

clínica, analítica, imágenes de rayos X y resonancia magnética nuclear, histolo-

gía, tratamiento) para obtener un verdadero valor fisiopatológico. De esta for-

ma, se están generando auténticas plataformas bioinformáticas dedicadas a in-

tegrar todos los datos relativos a patologías concretas. En España, ésta es un

área incipiente.

Creación de bancos de muestras clínicas (suero, tejidos)

Tanto los ensayos clínicos como los estudios de validación de biomarcado-

res o de perfiles proteicos necesitan colecciones amplias de muestras biológicas

y sus protocolos de obtención y recogida de muestras, conservación, uso, etc.

Tales estudios son particularmente necesarios para demostrar la especificidad

diagnóstica del perfil proteico, esto es, su ausencia en los controles (incluyendo

otras enfermedades) y su presencia en la enfermedad estudiada. Se contemplan

dos tipos de grupos de muestras:

a) Grupos reducidos de muestras clínicas muy bien caracterizadas, para la

fase de descubrimiento de biomarcadores o perfiles y estudios piloto.

b) Grandes colecciones de muestras clínicas bien caracterizadas necesarias

para la validación de los biomarcadores o perfiles y el progreso hacia

su uso clínico de rutina.

CARÁCTER MULTIDISCIPLINAR DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA

Con lo expresado hasta aquí, parece obvio que la proteómica clínica debe

llevarse a cabo por equipos multidisciplinares, con médicos clínicos y anato-

mopatólogos, químicos de proteínas, expertos en MS, bioinformáticos, farma-

cólogos, etc. Con frecuencia, los análisis proteómicos proporcionan una avalan-

cha de datos de difícil evaluación. Una de las funciones esenciales de los

equipos multidisciplinares es la priorización de patrones candidatos que han de

ser validados. La fiabilidad de los datos, avalados en las bases de datos, su po-

tencial valor clínico y un riguroso análisis bioinformático, son algunos de los

criterios que deben seguirse en la priorización.

29

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BIBLIOGRAFÍA

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30



31

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Inmunoterapía humoral

INTRODUCCIÓN

El desarrollo de anticuerpos con fines terapéuticos ha crecido de forma

importante en la última década. Inicialmente se utilizaron anticuerpos de origen

murino. Estas moléculas tienen el inconveniente de que generan una respuesta

immunológica frente a ellos. Los anticuerpos murinos se pueden transformar

en moléculas humanizadas de forma que no son reconocidos por el sistema im-

mune. Los anticuerpos humanos o "humanizados" se caracterizan también por

una mayor vida media. Más recientemente, se han desarrollado estructuras con

capacidad para reconocer multiples antígenos, y con distintos tamaños y pro-

piedades. Junto a la creciente identificación de dianas terapéuticas, el uso de

anticuerpos tanto "desnudos" como conjugados con toxinas, fármacos y com-

puestos radiactivos ha aumentado notablemente. Los anticuerpos más frecuen-

temente utilizados en el tratamiento contra el cáncer son las IgG. Los avances

en genética humana y molecular han permitido la síntesis de fragmentos de

IgG. Estos anticuerpos modificados se caracterizan por tener distinta afinidad

INMUNOTERAPIA HUMORALDr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University

El uso de anticuerpos monoclonales es actualmente unamodalidad terapéutica de enorme importancia en eltratamiento de pacientes con enfermedades neoplásicas.Los anticuerpos se han utilizado como agentes únicos oconjugados con agentes radioactivos o como vehículos defármacos y toxinas. Actualmente existen anticuerpos frentea receptores de factores de crecimiento, factores decrecimiento per se y otras dianas celulares como antigenosde membrana. Estos fármacos han demostrado actividadclínica en pacientes con tumores de de mama, colon,pulmón, linfomas y leucemias. Áreas de investigación ydesarrollo incluyen la generación de agentes con mejorespropiedades farmacológicas y menos tóxicos.



32

antigénica, número variable de sitios de unión al antígeno y distintas propieda-

des farmacológicas. Las más utilizadas son los fragmentos variables de cadena

única (scFV) que están compuestos por las cadenas variables pesadas y ligeras

unidas por un péptido. Estas moléculas tienen un peso molecular de ≈ 25 kDa

y son eficaces como vehículos de radionucleótidos. También se han desarrolla-

do estructuras de mayor envergadura como los llamados diabodis y minibodis.

El menor peso molecular de estas estructuras facilita su eliminación renal y es-

pecificidad en la localización tumoral con menor toxicidad que la asociada con

IgG completas.

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ANTICUERPOSMONOCLONALES COMO AGENTES TERAPÉUTICOS

Los anticuerpos monoclonales ejercen sus actividades de forma muy di-

versa y varía en función de las dianas afectas. Los anticuerpos dirigidos contra

receptores de factores de crecimiento, como el receptor del factor de creci-

miento epidérmico, inhiben la unión de ligandos con sus receptores y, en con-

secuencia, inhiben las funciones del receptor resultando en inhibición de la

proliferación celular y apoptosis. Los anticuerpos también generan actividad

antitumoral a través de mecanismos inmunológicos, induciendo anticuerpos an-

tiidiotipo, citotoxicidad dependiente de celulas (ADCC) y citotoxicidad media-

da por complemento. Como se ha mencionado anteriormente, los anticuerpos

también se utilizan como vehículos de otros agentes terapéuticos como fárma-

cos, toxinas y sustancias radioactivas. En estos casos, los mecanismos de ac-

ción están en función de las moléculas asociadas.

LIMITACIONES DEL EMPLEO DE ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS

Inicialmente, los anticuerpos terapéuticos usados en Oncología eran anti-

cuerpos murinos. Una de las limitaciones más importantes de estos fármacos es

la generación de HAMA (human antimouse antibodies). Este problema limita

el número de tratamientos que los pacientes pueden recibir. Técnicas más mo-

dernas han permitido la generación de anticuerpos quiméricos que comparten

estructuras humanas y murinas y que tienen menor immunogenicidad. Actual-

mente, es posible la generación de anticuerpos totalmente humanizados que no

generan HAMA. Un segundo problema es la unión del anticuerpo a antígenos

circulantes con la consiguiente reducción en la disponibilidad del anticuepo pa-

ra llegar al tumor. Otras limitaciones a la distribución de los anticuerpos en el

tejido tumoral incluyen las alteraciones en la vasculatura de los mismos, eleva-

da presión hidrostática y la distribución heterogénea de los antígenos dentro de

los tumores. Además, la inmunoterapia humoral se ve limitada por las dificul-

tades de acceso de las células efectoras a los tejidos tumorales. Finalmente, es

bien conocido que los tumores secretan sustancias que disminuyen la respuesta

inmunológica.

ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS

Neoplasias hematológicas

CAMPATH-1: El CAMPATH-1 es un anticuerpo moclonal específico fren-

te al antigeno CD52, un glicopéptido que se expresa en linfocitos B y T. Se ha

empleado en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia pro-

mielocítica y linfomas no Hodgkin (LNH) así como para depleccionar de célu-

las T la médula en transplantes alogénicos. El fármaco tiene aproximadamente

un 50% de respuesta en pacientes con LMC resistente a fludarabina. En pa-

cientes con enfermedad no tratada el fármaco ha demostrado también actividad

en pacientes con enfermedad no tratada, si bien la actividad es menor en pa-

cientes con afectación esplénica y de ganglios linfáticos. En pacientes con

LNH se ha estudiado una versión humanizada del anticuerpo. Un 20% de pa-

cientes respondieron, aunque de forma transitoria. Las principales toxicidades

observadas fueron anemia, trombocitopenia e infecciones oportunistas.

Rituximab: El rituximab es un anticuerpo monoclonal humanizado frente

al antigeno CD20. En estudios fase II, el fármaco resultó en un 40-50% de res-

puestas objetivas en pacientes con recidivas de LNH de bajo grado con muy

buena tolerancia. En algunas ocasiones, el tratamiento con rituximab resultó en

reacciones infusionales caracterizadas por fiebre, escalofríos, lisis tumoral, pla-

quetopenia, broncoespasmo e hipoxemia. Estos síntomas se suelen resolver con

tratamiento de soporte y los pacientes pueden continuar el tratamiento sin se-

cuelas. En raras ocasiones se han descrito reacciones cutáneas de gran intensi-

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dad, siendo algunas incluso fatales. En pacientes con linfomas de grado alto e

intermedio, las respuestas fueron de un 30% con independencia de la dosis em-

pleada. En combinación con quimoterapia CHOP, el índice de respuestas es

mayor del 90% con hasta un 55% de respuestas completas de larga duración.

Es importante resaltar que pacientes con translocacion del gen blc2 negativiza-

ron dicho marcador en sangre medido por PCR. En pacientes ancianos, el trata-

miento combinado de quimioterapia con rituximab ha demostrado superioridad

al tratamiento con quimioterapia sola. En linfomas de bajo grado, el tratamien-

to combinado de rituximab y fludarabina resultó en un 93% de respuestas glo-

bales, con una duración de más de 14 meses. Una observación importante en el

desarrollo clínico del rituximab es que la presencia de células CD-20 positivas

circulantes puede afectar a la actividad del fármaco, actuando como un santua-

rio en el que se deposita el anticuerpo, pudiendo necesitar dosis más altas del

mismo. De hecho, en otros estudios se ha observado una relación entre niveles

séricos del anticuerpo y actividad clínica, de forma que pacientes con enferme-

dad avanzada puedan necesitar una dosis de anticuerpo más alta. En casos oca-

sionales, los pacientes desarrollan resistencia a rituximab debido a la prolifera-

ción de poblaciones linfocitarias sin expresión del antígeno. En estas

situaciones se puede considerar la combinación de este agente con otros fárma-

cos dirigidos contra las poblaciones linfocitarias emergentes.

Tumores sólidos

Trastuzumab: El Her2/Neu, también llamado ErbB2, es uno de los miem-

bros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Este receptor de membrana se encuentra sobreexpresado, debido a una amplifi-

cación genética en el 30% aproximadamente de pacientes con cáncer de mama.

El trastuzumab (Herceptin®), también conocido como herceptin, es una versión

humanizada del anticuerpo murino 4D5. El anticuerpo va dirigido frente a epi-

topos en el dominio extracelular del Her2. En estudios de fase II, en pacientes

con carcinoma de mama avanzado, el tratamiento con este fármaco resultó en

un 10-15% de respuestas objetivas, y aproximadamente, 9 y 13 meses de tiem-

po a la progresión y supervivencia respectivamente. El fármaco es activo en

aquellos tumores que sobreexpresan el Her2, determinado bien mediante im-

muhistoquimica o mediante amplificación genética por FISH. En combinación

con quimioterapia, el tratamiento con trastuzumab ha mostrado superioridad

34



frente al tratamiento con quimioterapia sola en pacientes con cáncer de mama

avanzado. En un estudio fase III, el tratamiento combinado de herceptin con

paclitaxel o ciclofosfamida-adriamicina demostró superioridad en repuestas ob-

jetivas así como supervivencia. El tratamiento combinado con antraciclinas re-

sultó en casos de disfunción miocárdica y no se recomienda su utilización. Re-

cientemente se han publicado los estudios de herceptin en pacientes con

carcinoma de mama operado en combinación con quimioterapia. Estos estudios

han demostrado una mejor supervivencia libre de enfermedad en pacientes tra-

tadas con este fármaco, lo cual ha resultado en la aprobación de los mismos

para uso clínico. La mejor supervivencia de las pacientes tratadas indica que

posiblemente se logre un mayor número de curaciones de la enfermedad.

Cetuximab: El EGFR, o sus ligandos, está sobreexpresado en la gran mayo-

ría de los tumores sólidos epiteliales y es una diana muy interesante para el desa-

rrollo de fármacos antitumorales. Farmacológicamente se han desarrollado dos

estrategias contra esta diana, que se basan en el uso de anticuerpos monoclonales

contra el dominio extracelular del receptor o moléculas pequeñas dirigidas frente

al domino intracelular del mismo. Ambas estrategias han demostrado ser efecti-

vas y actualmente se están aprobando fármacos inhibidores de este receptor en

estas dos categorías. Los anticuerpos monoclonales bloquean la interacción del

ligando receptor e inhiben la función del mismo. Además, los anticuerpos mono-

clonales inducen la degradación del receptor, siendo este otro mecanismo de ate-

nuación de la señal. A nivel celular, estos eventos producen una inhibición de la

proliferación celular. Estudios preclínicos han demostrado, además, que estos fár-

macos reducen la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular, con

lo que se produce una disminución del potencial angiogénico. En estudios preclí-

nicos se ha visto también que los anticuerpos monoclonales frente al EGFR ejer-

cen efectos sinérgicos con quimioterapia y radioterapia.

Actualmente existen varios anticuerpos de esta clase en desarrollo. Los

más avanzados son el cetuximab (Erbitux®), aprobado para el tratamiento de

pacientes con carcinoma de colon refractario a irinotecán en combinación con

este agente, en combinación con radioterapia en pacientes con carcinoma epi-

dermoide de cabeza y cuello con enfermedad localmente avanzada así como en

pacientes con enfermedad avanzada como agente único. En diferentes estudios

clínicos se ha observado que este anticuerpo tiene actividad como agente único

y en combinación con irinotecán en pacientes con cáncer de colon avanzado.

En un reciente estudio fase III, la combinación de cetuximab con irinotecán re-

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sultó ser superior a cetuximab sólo en pacientes con cáncer de colon avanzado

que habían progresado al tratamiento con irinotecan. El fármaco tiene también

actividad en otros tumores tanto como agente único como en combinación con

quiotereapia y radioterapia. En particular, varios estudios recientes han demos-

trado que este fármaco tiene actividad como agente único en pacientes con tu-

mores de cabeza y cuello. Asimismo, la adición de cetuximab al tratamiento

con quimioterapia basada en platino en pacientes con carcinoma de cabeza y

cuello resistentes a esta quimioterapia resultó en un aumento de las respuestas

objetivas. Finalmente, en un estudio fase III, la combinación de cetuximab con

radioterapia resultó superior a la radioterapia sola en pacientes con carcinoma

de cabeza y cuello localmente avanzado. La toxicidad principal observada con

este fármaco cutanea y se manifiesta como acne. En estudios clínicos se ha ob-

servado, de forma muy interesante que los pacientes que desarrollan toxicidad

cutanea tienden a evolucionar mejor.

El otro anticuerpo monoclonal aprobado para uso clínico es panitumumab.

Este anticuerpo, a diferencia de cetuximab, es totalmente humano, lo cual dis-

minuye la indicencia de reacciones de hipersensiblidad. En un reciente estudio

fase III en pacientes con carcinoma de colon resistente a tratamiento con qui-

mioterapia, el panitumumab resultó en un aumento significativo en el tiempo a

la progresión frente a placebo. Estos resultados han llevado a la aprobación clí-

nica de panitumumab para pacientes con carcinoma de colon refractario a qui-

mioterapia.

Edrecolomab: El anticuerpo 17-1A (Panorex®) reconoce el antígeno Ep-

CAM. El anticuerpo desarrollado clínicamente es un anticuerpo humanizado

que tiene una larga vida media, induce ADCC y no produce HAMA. Debido a

observaciones preclínicas que indican una mayor actividad del anticuerpo

cuando se combina con citokinas como interferón, interleukinas y factores de

crecimiento hematopoyéticos, este anticuerpo se ha desarrollado en combina-

ción con estos otros agentes. Los estudios clínicos realizados con esta molécula

han dado resultados conflictivos. La combinación con citoquinas ha resultado

en mejores respuestas inmunólogicas, pero no en mejores respuestas clínicas.

Los estudios iniciales en pacientes con estadio III de cáncer de colon demostra-

ron un aumento en la supervivencia del grupo tratado con anticuerpo frente al

control. Estudios posteriores en pacientes con estadio II de cáncer de colon y

en combinación con quimioterapia en pacientes con estadio III no han confir-

mado dicha actividad.

36



Bevacizumab: El VEGF es uno de los mediadores más importantes de la

angiogénesis. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal dirigido contra este

factor de crecimiento que ha sido recientemente aprobado para el tratamiento

de pacientes afectos de carcinoma de colon en combinación con quimiotera-

pia. El fármaco ha demostrado en estudios fase III en pacientes con carcino-

ma de colon avanzado, mama y pulmón un mayor índice de respuestas objeti-

vas y mejor supervivencia. La droga tiene también actividad en pacientes con

carcinoma de pulmón y está siendo extensivamente estudiada en estas otras

enfermedades. Los principales efectos secundarios más notorios han sido hi-

pertensión, hemorragias (tumorales, epistaxis, hemoptisis) y cuadros de per-

foración intestinal.

RADIOINMUNOTERAPIA

Radioinmunoconjugados

En esta modalidad terapéutica, los anticuerpos se utilizan como vehículos

de sustancias radioactivas. Los anticuerpos utilizados pueden ser anticuerpos

sin actividad terapéutica per se o con actividad terapéutica, como por ejemplo

rituximab. La gran disponibilidad actual de anticuerpos y radioisótopos con

propiedades físicas y biológicas muy diversas permite mucha flexibilidad en

la combinación de los mismos, de manera que es posible generar reactivos de

muy diversa índole. Hasta recientemente, el único radioisótopo disponible era

el 131I. Más recientemente está disponible también el 90Y, cuyo uso está au-

mentando de forma progresiva. Estos agentes se clasifican en dos grandes ca-

tegorías dependiendo del tipo de energía que emiten, alfa o beta. Estas sustan-

cias se han utilizado mayormente en el tratamiento de neoplasias

hematológicas. Tositumomab (Bexxar®) está compuesto por 131I -anti CD 20.

Dosis mieloablativas de este agente han sido eficaces en el tratamiento de pa-

cientes con linfoma refractario a tratamiento convencional y también ha de-

mostrado actividad a dosis más bajas en pacientes con linfomas refractarios.

Ibritumomab (Zevalin®) combina un anticuerpo frente al CD20 con 90Y. El es-

tudio más relevante con este fármaco es un estudio randomizado fase III en

pacientes con linfoma de bajo grado. Ciento cuarenta y tres enfermos se ran-

domizaron a recibir tratamiento con ibritumomab o rituximab resultando en un

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mayor índice de respuestas objetivas tanto completas como parciales en el

grupo tratado con ibritumomab. Otros fármacos RAIT incluyen Lym-1 y

M195. Esta modalidad terapéutica se ha ensayado también en tumores sólidos

con menor éxito hasta el momento.

CONCLUSIONES

Los anticuerpos monoclonales se han establecido como una importante

modalidad terapéutica y actualmente existen varios aprobados para el trata-

miento de pacientes con diversos tipos de tumores. Los anticuerpos ofrecen

una gran versatilidad en cuanto a su posible utilización como agentes únicos o

combinados con radioinmunoconjugados, fármacos y toxinas.

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Introducción a la inmunoterapia celular

¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA?

La inmunoterapia es la utilización de he-

rramientas inmunológicas para tratar enferme-

dades como las que se indican en la Figura 1.

• Cáncer (Blattman 2004).

• Infecciones (Casadevall 2004).

• Enfermedades inmunitarias.

– Por exceso de respuesta a antígenos.

■ Propios: autoinmunidad (Stein-

man 2004, Feldmann 2004).

■ Ajenos: alergia, rechazo (Hu

ggins 2004, Waldmann 2004).

– Por defecto de respuesta a patógenos: inmunodeficiencias.

LA INMUNOTERAPIA FUNCIONA (Blattman 2004)

La extraordinaria capacidad de reconocimiento del sistema inmunita-

rio ya se puso de manifiesto en siglos anteriores con la inmunoprofilaxis,

INTRODUCCIÓN A LA INMUNOTERAPIA CELULARJosé R. Regueiro. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. MadridEduardo Martínez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid

Figura 1.



42

que ha permitido erradicar, por ejemplo, la viruela o el sarampión. De

igual manera, la inmunoterapia ha demostrado en los últimos años que

funciona, como acreditan los ejemplos que se citan en la Figura

2. Por ejemplo, el linfoma no-Hodgkin se trata con éxito con

anticuerpos monoclonales anti-CD20, ya que la célula tumoral

expresa CD20 y, por tanto, queda marcada para su eliminación

sistemática y concienzuda merced a todos los mecanismos des-

t ruct ivos que la

inmunidad dedica

normalmente a los

patógenos (Figura

3). La Figura 4 re-

sume algunos de

ellos y otras estra-

tegias que aprove-

chan la exquisita

especif ic idad de

los ant icuerpos .

Otro ejemplo es el

uso de anti-CD25

para tratar el re-

chazo renal agudo,

que es debido a l

reconocimiento de

Figura 3: Manipulación de lainmunidad adaptativahumoral. (A) Los antígenostumorales pueden inducir,mediante vacunación, laproducción por los linfocitosB de anticuerpos capacesde eliminar tumores omejorar la presentación desus antígenos por lascélulas dendríticas (DC). Losmonoclonales, como el anti-CD20 o anticuerposbiespecíficos, reconocentumores y activan diversascélulas efectoras. BCR/lg, Bcell receptor; Ag:Ab,antígeno:anticuerpo. (B) Losmonoclonales puedeneliminar tumores pormecanismos independientesde células efectoras. MAC,membrane attack complex.Tomado de Blattman 2004.

Figura 4.Figura 2.

las células renales por los linfocitos T alogénicos (Figura 5). Como dichos

linfocitos expresan CD25 para su expansión (Figura 6), el tratamiento los

elimina eficazmente sin dañar a otros linfocitos T. Los linfocitos T, en es-

te caso autorreactivos, son los responsables de la síntesis de un importante

mediador de la inflamación (TNFα) en patologías autoinmunitarias como

la esclerosis múltiple (Figura 7) o la artritis reumatoide. Es dicho media-

dor el que bloquean los anticuerpos anti-TNFα, que tanto éxito han tenido

en esta enfermedad. En realidad, los mecanismos implicados en la inmu-

noterapia de la aloreactividad podrían aplicarse a todas las inmunopatías

(Figura 8), ya que en todas existen linfocitos "malos" (alo, auto o alerre-

activos).

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Figura 8.Figura 7.

Figura 5. Figura 6.

LA INMUNIDAD ADAPTATIVA ES MUCHO MÁSQUE LOS ANTICUERPOS

Los ejemplos precitados tienen en común que se aprovechan de la enorme

diversidad de los anticuerpos, normalmente dirigidos contra los patógenos, para

eliminar o bloquear la causa de la patología tratada (sea ésta el tumor, el linfocito

malo o la citocina, Figura 9). Pero los linfocitos T también tienen esa capacidad,

aún no explotada suficientemente, aunque su concepto de antígeno (péptido ex-

terno o interno presentado por moléculas MHC) difiere del que tienen los linfoci-

tos B (epítopo externo del antígeno nativo, Figura 10). Además los linfocitos T,

especialmente los Th, tienen una enorme capacidad reguladora de la inmunidad

44



Figura 10.Figura 9.

Figura 12.Figura 11.

innata y adaptativa, y entre

otras cosas son los responsables

de la propia función de los B

(Figura 11, 12). Por tanto, inten-

tar redirigir la actividad defensi-

va anti-patógeno de los linfoci-

tos T y sus células auxiliares

sobre el tumor, el linfocito malo

o la citocina, es una estrategia

con enormes posibilidades tera-

péuticas (Figura 13).

¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA CELULAR?

La inmunoterapia celular es la utilización de células como herramien-

tas inmunológicas para tratar las enfermedades que se listan más arriba,

especialmente el cáncer (Paul 1998 y Figura 14). La Figura 15 propone al-

gunos ejemplos, más deseos que realidades salvo quizá el tratamiento de la

leucemia por trasplante de médula ósea compatible. La técnica se resume

en la Figura 16: se obtienen precursores hematopoyéticos del paciente, que

se limpian ex vivo de posibles células tumorales, y se congelan. Entretan-

to, el paciente se trata agresivamente para erradicar el tumor, y después se

reconstituye con los precursores congelados. Los recientes avances en la

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Figura 13.

Figura 14. Figura 15.

reconstitución del linaje T, que es el

más importante clínicamente, mejorarán

previsiblemente esta opción terapéutica

(van den Brink 2004). También se puede

aplicar el procedimiento a enfermedades

autoinmunitarias graves (esclerosis múl-

tiple, artritis reumatoide resistente a

otros tratamientos), ya que los linfocitos

autorreactivos, como la leucemia, pue-

den ser eliminados dentro y fuera del

paciente (Sykes 2005).

DAME UN BUEN ANTÍGENO Y ELIMINARÉ EL CANCER

Aunque el sistema inmunitario ha evolucionado para defendernos de los pató-

genos, y parece poco preocupado por los tumores (o por constituir una molesta ba-

rrera frente a los trasplantes), lo cierto es que elimina con rapidez tumores siempre

que tengan un buen antígeno asociado. Dos ejemplos: el virus de Epstein-Barr y

los idiotipos (regiones variables de las Igs) en linfomas B de bajo grado (Figura

17), aunque hay otros (Figura 18). El caso del virus de Epstein-Barr es muy ilustra-

tivo (Figura 19), ya que infecta a casi toda la población e in vitro transforma a los

linfocitos B (su diana) para que crezcan indefinidamente. Pero in vivo se mantiene

a raya por los linfocitos Tc principalmente. La inmunosupresión lo puede liberar de

46



Figura 16.


este control permitiendo la proli-

feración de los linfocitos B in-

fectados, que con el tiempo pue-

den acumular mutaciones que

los hacen tumorales (Figura 20). La Figura 21 explica el mecanismo de las vacunas

antitumorales con idiotipos del BCR del linfoma, que se convierten por sobreex-

presión en antígenos tumorales (de distribución mucho más restringida que CD20,

por cierto, y por tanto mucho más específicos). Sin embargo, pocas veces hay un

buen antígeno tumoral (ver último párrafo del siguiente apartado).

INMUNOTERAPIA CELULAR DEL CÁNCER

Por tanto, la inmunoterapia celular pretende convencer a los linfocitos Tc (y

Th) de que destruyan a las células tumorales (propias, aunque descarriadas) como

si estuvieran infectadas por EBV (Figuras 22, 23). Para ello, utiliza células diver-

sas: linfocitos alogénicos de médula ósea, células dendríticas, las propias células

47

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Figura 20.

Figura 19.

Figura 21.

tumorales modificadas, o linfo-

citos propios (T, NK NKT…,

Figuras 24, 25) (Plunkett 1999).

Linfocitos alogénicos

Las preparaciones de médula

ósea alogénica contienen siempre

cierto porcentaje de linfocitos T

maduros (Figura 26). Mientras

que los precursores se diferencian

en el timo del receptor para dar

lugar a linfocitos T autotolerantes

restringidos por el MHC del re-

ceptor, los linfocitos contaminan-

tes pueden contener una propor-

ción variable de linfocitos T

48



Figura 22.

Figura 24.

Figura 23.

Figura 25.

alogénicos, que son los responsables de la reacción injerto contra huésped en los tras-

plantes de médula no purgada de linfocitos. Esta reacción es más peligrosa que la re-

acción alogénica de los linfocitos T del receptor contra el injerto de médula y su pro-

genie (que puede provocar el rechazo del injerto), ya que puede comprometer la vida

del receptor. Por esa razón se suele purgar la médula alogénica con monoclonales an-

ti- CD2, CD3, CD5, CD7 o CD52 en el caso de pacientes sin cáncer. Pues bien, esa

misma actividad anti-huésped aparentemente indeseable es la responsable del efecto

injerto contra leucemia, que elimina con efectividad a todas las células tumorales por

razones alogénicas, las mismas que operan en el rechazo renal (Figura 27), pero aho-

ra dirigidas contra el tumor. Este efecto antitumoral de las células T alogénicas ha si-

do claramente demostrado en dos enfermedades: leucemia mieloide crónica (CML) y

la enfermedad linfoproliferativa de linfocitos B inducida por el virus de Epstein-Barr

(EBV). Pero, en este caso, la razón por la que el

tumor es eliminado es porque, en realidad, no

es propio. También se ha demostrado el efecto

beneficioso del rechazo del huésped en algunas

enfermedades autoinmunitarias (Sykes 2005).

Células dendríticas y tumorales(Irvine 2000, Berzofsky 2004a)

Las células dendríticas y tumorales au-

tólogas (Figura 28) son también objeto de

las estrategias de inmunoterapia celular que

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Figura 28.


a menudo se denominan vacunas celulares. El diseño es sencillo (Figuras 29,

30): consiste en hacer crecer las células dendríticas ex vivo a partir de monoci-

tos (si es que al resultado se le puede llamar células dendríticas), madurarlas y

cargarlas con lisados del tumor, o vectores virales que expresen antígenos tu-

morales, o péptidos antigénicos de origen tumoral (Curti 2004, Figura 31). Se

espera que así las células dendríticas carguen en su MHC péptidos tumorales y,

al reinyectarse al paciente, consigan disparar una respuesta vigorosa de linfoci-

tos Tc (y Th) antitumorales. Más recientemente se ha demostrado en ratón que

los antígenos tumorales podrían expresarse con vectores en precursores hema-

topoyéticos que, al diferenciarse en dendríticas, activarían a los linfocitos T an-

titumorales (Cui 2003). Otra estrategia complementaria es modificar las propias

50





células tumorales con vectores que produz-

can localmente moléculas inmunoestimula-

doras (por ejemplo, citocinas, o bien molé-

culas coestimuladoras, como B7/CD80) con

la esperanza de que, al volver al enfermo,

estimulen una fuerte respuesta presentadora

en las células dendríticas y, por tanto, una

respuesta Th y Tc muy potente (Figura 30),

o bien una respuesta directa por parte de es-

tas últimas (Figura 32). Otra estrategia es

utilizar el propio tumor autólogo o bien uno

alogénico del mismo tipo (Cancervax).

Linfocitos T, NK, NKT (Khanna 1999, Kessels 2001, Alvarez-Vallina 2001)

Por último, la extraordinaria capacidad de los linfocitos propios para

eliminar células infectadas ha propiciado su aplicación a la eliminación de

tumores, con diversas estrategias (básicamente despabilar linfocitos, Figura

34). Una es la transferencia adoptiva de grandes números de linfocitos T

anti-tumor generados in vitro por estimulación con citocinas como la IL-2,

a partir de linfocitos infiltrantes o TIL (B). Los resultados de las fases I y

II de estos ensayos fueron bastante desesperanzadores, aunque recientemen-

te las estrategias linfoablativas han hecho renacer las esperanzas (Rosen-

berg 2004). Otra es la modificación genética de los linfocitos T, antes de su

transferencia adoptiva, para que expresen

nuevos receptores de reconocimiento tu-

moral (TCR, anticuerpos biespecíficos o

quiméricos), o de proliferación autocrina,

o proteínas que bloquean las señales inhi-

bidoras que limitan las respuestas T (D y

Figura 35).

El tratamiento con IL-2 también se ha em-

pleado para la transferencia adoptiva de linfoci-

tos NK expandidos in vitro (las LAK, Figura

36). La α-galactosilceramida es un análogo del

ligando natural de los linfocitos NKT que per-

51

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Figura 34.

Figura 33.

mite expandirlos y que ha acredi-

tado su potencial antitumoral.

En el caso de los linfocitos

T y las células dendríticas, exis-

ten dos problemas importantes

(Figura 37): el riesgo de autoin-

munidad, y la necesidad de que exista un verdadero antígeno tumoral. Este último

obstáculo no puede destacarse lo suficiente, porque confunde enormemente el pa-

norama científico. CD20, CEA (antígeno carcinoembrionario), AFP (alfa feto pro-

teína) no son verdaderos antígenos tumorales, ya que se expresan normalmente en

el enfermo en cantidades que garantizan la autotolerancia. Por tanto, es muy difí-

cil convencer al sistema inmunitario que los considere ajenos, a no ser que se le

proporcione un sistema de reconocimiento generado en otra especie, para la que sí

son verdaderos antígenos (por ejemplo un anti-CD20 de ratón). En cambio, los

antígenos (inmunógenos para ser más precisos) de los oncovirus (EBV, HTLV-I) o

la p53 mutada o el antígeno oncofetal sí son verdaderos antígenos tumorales, ya

que para ellos no existe autotolerancia y puede, por tanto, estimularse la inmuni-

dad contra las células tumorales que los portan (Coggin 2005).

52



Figura 35.

Figura 36.

Figura 37.

INMUNOTERAPIA CELULAR DE OTRAS ENFERMEDADES

Pero la inmunoterapia celular, al menos en teoría, tendría una enorme apli-

cación potencial en diversas patologías, como se sugiere en la Figura 38. Por

ejemplo, células dendríticas cultivadas con un antígeno de melanoma deberían

generar in vivo linfocitos Tc anti-melanoma. O expandiendo linfocitos Tc autó-

logos anti-EBV in vitro debería poderse tratar la mononucleosis (Khanna 1999,

Berzofsky 2004b). Una vacuna celular a base de los linfocitos T responsables

de la artritis reumatoide, el asma o el rechazo podría eliminarlos completamen-

te. Pero también injertar TCR anti-EBV, o -tumor, o -linfocito malo puede redi-

rigir a linfocitos normales contra las dianas implicadas en cada una de esas pa-

tologías (Figura 39).

Por último, las inmunodeficiencias (ID)

congénitas son desafortunados experimentos

de la Naturaleza que afectan a la inmunidad.

Resulta especialmente apropiado que puedan

curarse mediante afortunados experimentos

diseñados por el ser humano. Ya fue así en

1968, cuando una ID ligada al cromosoma X

se convirtió en la primera enfermedad huma-

na curada con éxito por trasplante de médula

ósea, un procedimiento terapéutico que aho-

ra es estándar para muchas otras patologías,

incluido el cáncer. Naturalmente, se observa-

ron efectos adversos graves, como la enfer-

medad del injerto contra el huésped. Más de

30 años después, la misma ID ha sido la pri-

mera en ser curada por terapia génica. Hay

obstáculos que superar, como ha demostrado

la leucemia de células T desarrollada por on-

cogénesis insercional en tres pacientes. La

propia inmunidad puede ser un obstáculo pa-

ra la terapia génica cuando se dirige contra

el vector o incluso la proteína terapéutica.

Pero la terapia génica seguirá adelante. El

cáncer, las enfermedades infecciosas, inclui-

53

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Figura 38.

Figura 39.

do el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, y otras enfermedades congé-

nitas, son las siguientes de la lista. Los beneficios globales serán probablemen-

te más que los riesgos, como se demostró para el trasplante (Regueiro 2004).

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55

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Células embrionarias pluripotentes

INTRODUCCIÓN

El cuerpo humano se compone de una gran variedad de células especiali-

zadas en diferentes funciones. Esta especialización determina una divergencia

extrema en la apariencia externa y capacidad funcional de cada una de las cla-

ses de células que componen un organismo. Por ejemplo, una célula ósea difie-

re extraordinariamente en su apariencia externa de una neurona y no podría re-

alizar sus funciones especializadas. La composición y diversidad celular de

nuestro cuerpo, salvo excepciones, está presente en el momento de nacer y nos

acompaña hasta la muerte. Sin embargo, a pesar de su gran heterogeneidad, to-

das nuestras células descienden de una única célula embrionaria: el zigoto. Du-

rante el desarrollo embrionario ocurren dos importantes procesos que conducen

a la composición final del recién nacido; por un lado el zigoto se multiplica

por división, generando el número de células necesarias para la construcción

del organismo, y en paralelo, distintos linajes celulares se diferencian en pobla-

ciones celulares que adoptan las características propias de su identidad.

Una vez diferenciadas, las células disponen de un periodo de vida limitado

y deben ser reemplazadas por otras nuevas para mantener la función de los teji-

dos y órganos del individuo. En el embrión temprano existe una población de

CÉLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENTESMiguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y OncologíaCentro Nacional de Biotecnología. CSIC-Pfizer



58

células, las células troncales embrionarias, capaz de diferenciarse en cualquier

tipo celular del organismo, y por lo tanto, capaz de aportar todos los tipos celu-

lares necesarios para la construcción de los distintos tejidos y órganos. En el

individuo ya desarrollado, son las células troncales adultas las que heredan esta

capacidad y aportan a cada tejido u órgano un flujo constante de nuevas células

que sustituyen a las envejecidas o dañadas por enfermedad o accidente, regene-

rando órganos y tejidos. Sin embargo, la capacidad de regeneración es muy va-

riable según el tejido; desde casi nula en el caso del Sistema Nervioso Central,

o muy reducida en el caso del páncreas, hasta muy activa en el caso de la piel,

el sistema hematopoyético o el hígado. Esta circunstancia determina que la pér-

dida o deterioro de una población celular concreta durante la vida adulta sea,

en muchos casos, insustituible de manera espontánea.

La carencia de las funciones realizadas por las células dañadas provoca el

sufrimiento de enfermedades crónicas como la diabetes, el Parkinson, la escle-

rosis múltiple, etc. o la pérdida de determinadas funciones, como las parálisis

sufridas tras una lesión de médula. Una de las soluciones para resolver este ti-

po de enfermedades sería la disponibilidad de células embrionarias totipotentes,

capaces de especializarse en las funciones perdidas durante la vida adulta. Sin

embargo, las células troncales embrionarias se encuentran de manera natural en

el embrión en estadio de blastocisto, en número muy limitado y en una ventana

de tiempo muy restringida. Por esta razón, la posibilidad de usarlas depende de

la capacidad de aislar y multiplicar las células troncales embrionarias de mane-

ra controlada en el laboratorio.

LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS: OBTENCIÓN,CARACTERÍSTICAS Y APROXIMACIONES TERAPÉUTICASEXPERIMENTALES

El aislamiento y cultivo de células troncales embrionarias se consiguió por

primera vez a partir de blastocistos de ratón en el año 1981 (Figura 1), cono-

ciéndose universalmente como células ES (según la denominación inglesa

"Embryonic Stem")1,2. Las células aisladas mostraron características excepcio-

nales; por un lado se multiplican indefinidamente en cultivos in vitro, y a la

vez, si se les proporciona las condiciones adecuadas, se diferencian dando lu-

gar a las distintas células especializadas del organismo. Las conclusiones deri-

vadas del cultivo y

uso de las células ES

en el ratón son con-

tundentes. Células

ES mantenidas en

cultivo por periodos

prolongados son ca-

paces de mezclarse

con células de un

embrión en desarro-

llo, contribuyendo

células sanas y fun-

cionales a todos los

tejidos de un animal

adulto (Figura 2). A

pesar de haber acu-

mulado un número

indefinido de divi-

siones in vitro, las células ES no parecen "envejecer", ya que los ani-

males generados a partir de éstas células no presentas síntomas de

envejecimiento prematuro. Estas características se relacionan con una

alta actividad telomerasa y con la expresión de otros marcadores re-

lacionados con el mantenimiento del estado indiferenciado y prolife-

rante.

En 1998 se consiguió por primera vez obtener y propagar in

vitro líneas de células pluripotentes aisladas de blastocistos y de

gónadas fetales humanas3,4. Al igual que sus homólogas de ratón,

59

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Figura 1. Establecimientode líneas de célulastroncales embrionarias.

Figura 2. Contribuciónde las células ES a laformación de quimerasde ratón con colonizaciónde la línea germinal.

las células pluripotentes embrionarias humanas se multiplican indefinidamen-

te en cultivos artificiales, pero si se les proporciona las condiciones adecua-

das, se diferencian dando lugar a las distintas células especializadas del orga-

nismo. Los cultivos de células ES humanas representan por lo tanto una

fuente ilimitada de células jóvenes capaces de contribuir a cualquier tejido

del organismo adulto5,6.

En modelos experimentales animales se han producido ya varios ejem-

plos del potencial terapéutico de las células ES. Se ha descrito, por ejemplo,

la diferenciación de células ES de ratón hacia músculo cardíaco y su im-

plantación con éxito en el corazón de un animal adulto7. En estudios simila-

res, se han observado mejorías de lesiones medulares y enfermedades neuro-

degenerativas trasplantando, respectivamente, poblaciones de neuroblastos o

gliales diferenciadas in vitro a partir de células ES de ratón8,9. También se

han conseguido derivar células beta-pancreáticas funcionales a partir de cé-

lulas ES, mediante un proceso de diferenciación y purificación. La posterior

implantación de estas células en modelos experimentales de diabetes ha eli-

minado los síntomas de la enfermedad, demostrando la eficacia de la aproxi-

mación10.

LIMITACIONES PRESENTES A LA APLICACIÓN DE LASCÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS EN TERAPIA HUMANA

Existen al menos tres problemas conocidos que impiden prever qué enfer-

medades se beneficiarán de la nueva técnica y cuándo será posible su aplica-

ción.

En primer lugar, las células ES de ratón forman teratocarcinomas al ser

implantadas en estado indiferenciado en animales de laboratorio. Este problema

desaparece si se implantan después de su diferenciación total o parcial in vitro,

por lo que cualquier protocolo de transferencia de células ES deberá incluir un

paso previo de diferenciación in vitro.

Un segundo problema para la aplicación terapéutica de las células ES re-

side en la dificultad de obtener células diferenciadas a un linaje celular puro.

Cuando se estimula su diferenciación, las células ES son capaces de originar

cualquier tipo celular, pero raramente lo hacen de manera homogénea, sino

que dan lugar a poblaciones de células en que se mezclan distintos tipos es-

60



pecializados. Idealmente deberíamos ser capaces de controlar las vías elegi-

das por las células ES cuando se diferencian6,11. Gracias a experimentos en

células en cultivo y a modelos animales como el ratón, hoy conocemos genes

de diferenciación que controlan estas vías. Por ejemplo, existen genes miogé-

nicos que determinan la diferenciación hacia músculo, neurogénicos que in-

ducen la diferenciación hacia neuronas, genes que determinan los distintos ti-

pos celulares pancreáticos, otros implicados en determinar los diferentes tipos

celulares de la hipófisis y un largo etcétera. La activación controlada de ge-

nes de diferenciación en las células ES podría producir el tipo celular desea-

do para cada aplicación. Un ejemplo práctico de esta aplicación es la estimu-

lación de la producción in vitro de células troncales hematopoyéticas a partir

de células ES de ratón por la sobreexpresión del factor de transcripción

HoxB412. Alternativamente, se pueden exponer los cultivos a factores difusi-

bles capaces de instruir a las células sobre la vía de diferenciación a seguir.

Muchos de estos factores de crecimiento tienen ya aplicaciones terapéuticas y

su utilización sería fácil y directa. Algunas de estas aproximaciones se han

aplicado ya con éxito para dirigir la diferenciación de células ES a determi-

nados linajes in vitro11.

El tercer problema sería que las células implantadas podrían sufrir el mis-

mo tipo de rechazo inmune que se produce en el trasplante de órganos. Antes

de su utilización habría que establecer bancos de distintas líneas celulares com-

patibles con el sistema inmune de cada uno de los posibles receptores, una ta-

rea abordable con la tecnología disponible en este momento, pero sin duda la-

boriosa. Una posibilidad en este contexto sería utilizar técnicas de clonación

por transferencia nuclear, mediante lo cual se pueden generar líneas de células

troncales personalizadas a partir de células somáticas de cada individuo13. Esta

aproximación se ha demostrado viable en animales de experimentación y sería

la solución definitiva al problema del rechazo.

COMBINACIÓN DE TERAPIA CELULAR Y TERAPIA GÉNICA PORMUTAGÉNESIS DIRIGIDA: ¿UNA VENTAJA TERAPÉUTICA DELAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS?

En aquellos casos en que una población celular determinada esté daña-

da debido a un defecto genético congénito o adquirido, el autotransplante,

61

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simple o por clonación, no sería eficaz. Por otro lado, el trasplante de célu-

las sanas ajenas plantearía los problemas de rechazo antes mencionados. De

nuevo, el modelo experimental de ratón ofrece una posible solución idónea

a este problema. La tecnología de células ES en el ratón se ha explotado

fundamentalmente como una vía para la producción de animales modifica-

dos genéticamente14,15. La repercusiones de esta aplicación han sido, y se-

rán en el futuro, de gran importancia. Baste mencionar la disponibilidad de

modelos de ratón que reproducen patologías humanas como el cáncer, la es-

clerosis múltiple o la diabetes, o el avance en el conocimiento sobre cómo

los genes determinan los distintos linajes celulares que componen el orga-

nismo. Gracias a esto, las técnicas de modificación dirigida del genoma del

ratón se han desarrollado enormemente, y en la actualidad permiten realizar

de manera "limpia" mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, sustitu-

ciones, translocaciones, inversiones, mutaciones inducibles etc…El poten-

cial terapéutico de estas aproximaciones sería extraordinario en el caso de

que se pudieran aplicar a la reparación del genoma en células ES humanas.

La reparación genética mediante estas técnicas representaría la terapia géni-

ca idónea, al reestablecer un genoma intacto, en lugar de añadir material

genético de manera incontrolada. Este tipo de modificaciones genéticas se

han realizado extensivamente en células ES de ratón, pero se pueden reali-

zar en cualquier línea celular establecida. Sin embargo, por el momento, no

se ha tenido éxito al intentar aplicarlas en células troncales humanas, ya sea

adultas o embrionarias. En caso de no conseguir aplicar estas técnicas en

células troncales, existiría un argumento añadido en favor de la utilización

de la clonación terapéutica, ya que se podría realizar la corrección genética

en una línea establecida de células somáticas y utilizar sus núcleos como

donadores para obtener, primero blastocistos y luego células troncales co-

rregidas. En un experimento paradigmático, que supera todas las limitacio-

nes previsibles a la aplicación terapéutica de las células ES16, se han com-

binado las diferentes aproximaciones mencionadas en este artículo para

sanar ratones inmunodeficientes a causa una mutación en el gen Rag-2.

Mediante biopsia, se obtuvieron núcleos celulares de los ratones adultos in-

munodeficientes y, por trasplante nuclear, se clonaron blastocistos genética-

mente idénticos al ratón original. Posteriormente, de estos blastocistos se

derivaron células ES y se corrigieron por modificación dirigida, reparando

el defecto en el gen Rag-2. A continuación, se utilizó una combinación de

62



diferenciación espontánea, y dirigida por el gen selector HoxB4, para obte-

ner in vitro células troncales hematopoyéticas reparadas. Finalmente, se

trasplantaron las células obtenidas en los ratones deficientes en Rag-2, re-

constituyendo establemente un sistema inmune completamente sano.

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

En resumen, la disponibilidad de células ES humanas representa un gran

avance que proporciona accesibilidad ilimitada a tejidos especializados y a

su proceso de diferenciación. De manera inmediata, representan un modelo

excelente para el estudio de los procesos de generación de diversidad celular

en nuestro organismo y para la caracterización de fármacos que puedan diri-

girlos. Los resultados de los ensayos terapéuticos realizados en animales mo-

delo permiten pensar en la aplicación a corto/medio plazo de la tecnología

de células troncales embrionarias en terapia humana. Una de las

perspectivas más prometedoras en este campo es la combinación

del uso de células troncales embrionarias con la reparación genó-

mica dirigida, lo que representaría la terapia génica ideal. En cual-

quier caso, existen limitaciones técnicas a la aplicación terapéutica

de las células troncales embrionarias que impiden determinar con

certeza qué enfermeda-

des se van a beneficiar

de las nuevas terapias y

en qué plazos. La com-

binación de la tecnolo-

gía de células troncales

embrionarias con la clo-

nación terapéutica per-

mitirá, al menos, elimi-

nar los problemas de

rechazo, y además, pue-

de ser esencial para

conseguir la reparación

genómica dirigida (Fi-

gura 3).

63

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Figura 3. Esquemapropuesto para la

aplicación de nuevasestrategias en terapia

celular.

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65

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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre

INTRODUCCIÓN

Las primeras evidencias científicas de que en el organismo adulto existen

células madres proviene de experimentos realizados por Till y McCulloch a fi-

nales de los años 50 centrados en las células madre hematopoyéticas. Sin em-

bargo, la capacidad de regenerar tejidos en organismos adultos, e incluso de re-

generar organismos completos, como en el caso de planarias, se conoce desde

mucho antes. Clínicamente, hemos explotado la potencialidad de las células

madre adultas, concretamente de las células madre hematopoyéticas, desde ha-

ce más de 50 años, y podemos afirmar que gracias al trasplante de médula ósea

(trasplante de células madre hematopoyéticas) miles de pacientes han podido

ser curados de enfermedades incurables de otra forma. Aunque la forma más

ampliamente utilizada de TC es el trasplante de progenitores hematopoyéticos,

TRASPLANTE CELULAR Y TERAPIA REGENERATIVACON CÉLULAS MADREFelipe Prósper. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular. Clínica UniversitariaUniversidad de Navarra

Uno de los campos de la Medicina que más expectativas halevantado en los últimos años es la terapia celular concélulas madre. El aislamiento de células embrionariashumanas, la aparente e inesperada potencialidad de lascélulas madre adultas y el desarrollo de la terapia génicanos lleva a imaginar un futuro esperanzador para unimportante número de enfermedades actualmenteincurables. A lo largo de las siguientes páginas vamos atratar de dibujar el panorama de la investigación concélulas madre, describiendo los principales logros en estecampo así como algunas de las preguntas pendientes deresponder. A pesar de las grandes expectativas, esfundamental que mantengamos un espíritu crítico y realistaa la hora de analizar los avances científicos en este área.



66

el término Terapia Celular (TC), en un sentido amplio, incluye cualquier tipo

de tratamiento que utiliza células como agente terapéutico.

El interés por la utilización de las células madre, sin embargo, ha crecido

de forma exponencial en los últimos años a raíz de la identificación, caracteri-

zación y aislamiento de las células madre embrionarias humanas1 y de las ex-

pectativas, de alguna forma prematuras, de que las células madre podrían ser

capaces de curar innumerables enfermedades (enfermedades neurodegenerati-

vas, cardíacas, endocrinológicas, etc.) gracias a su enorme potencial de diferen-

ciación. Desgraciadamente, el debate científico sobre las aplicaciones terapéuti-

cas de las células madre, adultas o embrionarias, se ha transformado en un

debate político y mediático en detrimento del ambiente necesario que facilite el

progreso científico.

Quizá el mensaje más importante que me gustaría trasmitir es que, a pesar

de las enormes perspectivas que existen en relación con las células madre, es

esencial que seamos capaces de trasmitir un sentimiento de prudencia y pacien-

cia a nuestros enfermos y colegas: las células madre pueden llegar a contribuir

al tratamiento de distintas enfermedades, pero estos avances no son esperables

a corto plazo. Solamente, la investigación seria y continuada podrá contribuir a

medio o largo plazo a determinar la utilidad terapéutica real de las células ma-

dre adultas o embrionarias.

CÉLULAS MADRE

Una célula madre, o más adecuadamente denominada troncal, es aquélla

que es capaz de dividirse indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos de cé-

lulas especializadas, no sólo morfológicamente sino también de forma funcio-

nal. Las células madre se pueden clasificar según su capacidad de diferenciarse

a distintos tipos de tejidos o lo que es lo mismo según su potencialidad: las cé-

lulas madre totipotenciales son aquellas capaces de producir tanto tejido embrio-

nario, es decir, un embrión completo, como extraembrionario (placenta y anejos

placentarios). En sentido estricto, solamente los estadios iniciales del zigoto

constituirían células madre totipotenciales; las células madre pluripotenciales

son aquéllas que tienen la capacidad de diferenciarse a cualquiera de los tejidos

existentes en un organismo adulto y, por tanto, tejidos procedentes de cualquiera

de las tres capas embrionarias incluyendo las células germinales; por último, las

células madre multipotenciales serían capaces de diferenciarse a distintos tipos

celulares, pero siempre restringiendo su potencial a tejidos derivados de una

única capa embrionaria, es decir, tejidos derivados mesodérmicos, ectodérmicos

o endodérmicos2. Desde el punto de vista de su origen dividimos a las células

troncales en embrionarias (derivan del embrion, bien del blastocisto o de la

cresta gonadal) y adultas (derivan de alguno de los tejidos adultos).

Células madre embrionarias

Las células madre embrionarias se han obtenido bien a partir de la masa

celular interna del blastocisto en el estadio de embrión preimplantatorio1, o

bien de las cresta gonadal3. Aunque las líneas de células embrionarias de ratón

se utilizan desde hace más de 20 años4, hasta 1998 no fue posible obtener célu-

las embrionarias humanas1,3. La posibilidad de obtener y utilizar terapéutica-

mente las células embrionarias humanas ha disparado las expectativas de la te-

rapia celular con células madre.

Las células madre embrionarias son pluripotenciales, es decir, son capaces de

proliferar de forma continua sin diferenciarse, siendo prácticamente inmortales, y

además son capaces de diferenciarse a cualquier tejido del organismo, incluyendo

tejidos somáticos (corazón, hígado, hueso, pulmón, cerebro, etc.. y células germi-

nales (oocitos y espermatozoides), como se ha podido demostrar recientemente5-8.

Obviamente, la posibilidad de obtener cualquier tipo de tejido, y sin limitaciones

en cuanto a número de células, ha abierto expectativas de tratamiento de enferme-

dades tradicionalmente incurables (infarto de miocardio, enfermedades neurodege-

nerativas, enfermedad de Parkinson, diabetes y otras muchas).

Sin embargo, las células madre embrionarias tienen, a día de hoy, impor-

tantes limitaciones que, de momento, han hecho que no exista ningún estudio

clínico abierto en pacientes. Por una parte, la misma capacidad proliferativa de

estas células lleva a que en los distintos modelos animales en los que se han

utilizado, se detecte de forma invariable la producción de tumores (teratomas y

teratocarcinomas). Con el objetivo de limitar este problema, diferentes grupos

han realizado estudios utilizando células embrionarias prediferenciadas con re-

sultados positivos. Junto a este problema, se encuentra el hecho de que el tras-

plante de células embrionarias se produciría entre dos sujetos inmunológica-

mente incompatibles, lo cual exigiría la utilización de medicación

inmunosupresora y los consiguientes efectos adversos. Aunque en este sentido,

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la trasferencia nuclear, al menos teóricamente, permitiría eludir el problema de

histoincompatibilidad, desde el punto de vista económico e incluso científico

no es una solución viable hoy en día.

Células madre adultas

Se conoce desde hace muchos años que distintos tejidos del organismo tienen

la capacidad de auto-regenerarse, gracias a la existencia de células madre residen-

tes en dichos tejidos. Estas células madre obtenidas de tejidos adultos poseen las

dos características de auto-renovación y diferenciación que hemos mencionado

anteriormente. Sin embargo, a diferencia de las células madre embrionarias, se

considera que su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciación es signi-

ficativamente menor9. Se han identificado células madre adultas en la médula

ósea, músculo esquelético, epidermis, intestino, testículo, hígado, y de forma más

reciente en tejidos como el sistema nervioso central o el corazón.

Las células madre adultas se consideran multipotenciales, es decir, capaces

de diferenciarse a un número limitado de tejidos, principalmente en función de

su origen embrionario (células de origen mesodérmico pueden diferenciarse a te-

jidos derivados mesodérmicos etc.). Sin embargo, cada vez parece más evidente

que las células madre adultas son capaces de generar células maduras de tejidos

derivados de capas embrionarias distintas, siendo el caso más típico el de las cé-

lulas madre hematopoyéticas capaces de diferenciarse a hepatocitos, músculo

cardíaco, endotelio o incluso a tejidos derivados de las tres capas embrionarias9-

12. Este fenómeno, denominado versatilidad o capacidad de transdiferenciación

de las células madre adultas no está exento de controversia, ya que mientras al-

gunos estudios lo apoyan, otros trabajos recientes cuestionan la existencia de esta

capacidad de transdiferenciación de las células, justificando algunos de los ha-

llazgos de versatilidad en función de fenómenos de fusión celular13,14 o incluso

cuestionando abiertamente los resultados experimentales15.

TERAPIA CELULAR CON CÉLULAS MADRE

A día de hoy, las aplicaciones clínicas de la terapia celular se limitan a las

células madre adultas. Es posible que en el futuro las células madre embriona-

rias se apliquen de forma terapéutica, pero hoy en día las limitaciones que he-

68



mos mencionado anteriormente hacen inviable su utilización. Existen, sin em-

bargo, ensayos clínicos con células madre embrionarias previstos en un futuro

próximo.

Terapia celular en Endocrinología

La prevalencia de la diabetes mellitus se está incrementado hasta adquirir

proporciones epidémicas en el mundo. Se estima que actualmente 100 millones

de personas padecen la enfermedad, debido a la incapacidad de las células βdel páncreas de secretar insulina, hormona fundamental para el control de la

glucemia. En la actualidad, no existe un tratamiento curativo de la diabetes si-

no que el pronóstico de los pacientes está supeditado al control de su glucemia

mediante el tratamiento sustitutivo.

Recientemente, los resultados positivos obtenidos mediante el trasplante

de islotes de páncreas en pacientes diabéticos ha incrementado el interés por

utilizar células capaces de producir insulina. Mientras que el escaso número de

islotes, y la imposibilidad de expandir dichas células in vitro, impide que el

trasplante de islotes de cadáver sea utilizable en un número importante de pa-

cientes, la posibilidad de utilizar células madre con capacidad de diferenciarse

en células productoras de insulina se plantearía como una estrategia mucho

más atractiva16.

En modelos experimentales, se ha podido demostrar que las células madre

embrionarias se pueden diferenciar a células secretoras de insulina y que cuan-

do estas células se implantan en el bazo de ratones, en los que previamente se

ha inducido una diabetes mediante la inyección de estreptozotozina, son capa-

ces de inducir una normalización de las cifras de glucosa. Uno de los principa-

les problemas para la utilización de células embrionarias es que en el proceso

de diferenciación, además de células productoras de insulina, se producen otros

tipos celulares diferentes, que habría que eliminar de forma previa a su utiliza-

ción17.

Aunque hasta el momento no ha sido posible caracterizar la célula madre

pancreática, distintos estudios sugieren el potencial de células obtenidas a par-

tir de hígado, conductos pancreáticos o islotes pancreáticos, o incluso células

de médula ósea para producir células secretoras de insulina18-19. En cualquier

caso, una de las principales limitaciones con cualquiera de los tipos celulares

descritos es que el porcentaje de células secretoras de insulina que se puede

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obtener es muy pequeño, lo cual limita su aplicación terapéutica. A pesar del

enorme interés en esta área de investigación, no existe ningún estudio clínico

publicado utilizando células madre en pacientes con diabetes tipo I, aunque las

expectativas sean enormes.

Terapia celular en enfermedades neurológicas

Las células madre tienen un enorme potencial como células capaces de re-

construir las neuronas y estructuras dañadas en enfermedades como la enferme-

dad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, es-

clerosis en placas, infartos cerebrales o las lesiones medulares, por mencionar

algunas. El sistema nervioso central añade una dificultad adicional a la terapia

celular. Al ser un órgano con una sofisticada organización estructural, las célu-

las implantadas han de ser capaces no sólo de injertarse, sino también de esta-

blecer nuevas conexiones sinápticas e integrarse con el resto del tejido circun-

dante.

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa

que afecta a más del 2% de la población mayor de 65 años. Se caracteriza por

una degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia ne-

gra20 que origina la aparición de los signos y síntomas característicos de la en-

fermedad. A pesar del tratamiento farmacológico, la evolución de la enfermedad

conlleva complicaciones motoras y psiquiátricas que disminuyen la calidad de

vida de los pacientes y dificultan su manejo clínico. La utilización de células

con capacidad de sintetizar y liberar dopamina y restablecer los circuitos neuro-

nales dañados se perfila como nuevas expectativas en el tratamiento de la EP21.

En la EP se han utilizado células de origen fetal en ensayos clínicos en humanos

con resultados cuando menos controvertidos22,23. Estudios in vitro e in vivo han

demostrado que tanto las células madre embrionarias como las adultas (células

madre de médula ósea, células madre neurales) son capaces de diferenciarse a

neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, no está claro hasta que punto dichas cé-

lulas son capaces de restablecer los circuitos neuronales destruidos en la EP y,

por tanto, eliminar los síntomas de la enfermedad.

Las lesiones medulares, principalmente secundarias a traumatismos, son

una de las causas más frecuentes de patología neurológica en edades jóvenes.

No existe un tratamiento curativo para esta enfermedad incapacitante, por lo

que la posibilidad de utilizar células madre para restablecer las conexiones axo-

70



nales aparece como una estrategia especialmente atractiva. Estudios recientes

sugieren que las células madre embrionarias poseen la capacidad de diferen-

ciarse a neuronas motoras y facilitar la recuperación motora en animales con

lesiones espinales24,25. Sin embargo, parece que el mecanismo por el cual di-

chas células contribuyen a restablecer las neuronas motoras estaría relacionado

con la liberación de factores de crecimiento, que contribuirían al recrecimiento

de los axones destruidos. Otros tipos celulares, como las células de la glía en-

volvente o las células mesenquimales (o estromales) de la médula ósea también

han demostrado su capacidad para favorecer el recrecimiento de los axones tal

como se ha demostrado en modelos animales26-28.

La esclerosis múltiple es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada

por la degeneración de las células productoras de mielina (oligodendrocitos) y

que se manifiesta por una afectación tanto motora como sensitiva como conse-

cuencia de la desmielinización de los axones. La posibilidad de favorecer la

formación de mielina mediante la utilización de células madre capaces de dife-

renciarse a oligodendrocitos ha sido explorada en modelos animales. Un estu-

dio reciente ha podido demostrar en un modelo de esclerosis múltiple en ratón

(más concretamente de encefalitis autoinmune experimental), que la inyección

de neuroesferas (células madre neurales) tanto de forma intravenosa como in-

tratecal promueve la remielinización multifocal. Indudablemente, estos resulta-

dos están muy lejos de justificar experimentos en pacientes, en una enferme-

dad, que aunque incapacitante, tiene una supervivencia prolongada29.

Por la gran incidencia y el elevado coste económico y humano que gene-

ran, los accidentes cerebrovasculares son uno de los objetivos más atractivos

para la terapia celular. Las evidencias recientes que indican la presencia de un

proceso de neurogénesis tras producirse una isquemia cerebral han estimulado

el interés por utilizar células madre para suplementar la regeneración autóloga

que se produce espontáneamente30,31. El beneficio de la terapia celular con cé-

lulas madres podría deberse al aporte exógeno de células con capacidad de

neurogénesis o de angiogénesis, o debido a la modulación del microambiente,

estimulando la supervivencia y diferenciación de las células residentes en el te-

jido dañado. El trasplante de células madre neurales en modelos de rata ha de-

mostrado ciertos beneficios y de hecho se han realizado pequeños estudios en

humanos utilizando neuronas obtenidas a partir de una línea celular de terato-

carcinoma32-34. Estudios realizados en animales sugieren que las células de mé-

dula ósea son reclutadas a las zonas de infarto cerebral y que contribuyen a la

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mejoría funcional cuando son inyectadas focalmente e incluso intravenosamen-

te. La inyección de células se asocia con la formación de nuevos vasos, libera-

ción de factores tróficos así como con la expresión de marcadores neurales por

parte de las células implantadas.

No son estas las únicas enfermedades neurológicas susceptibles de benefi-

ciarse de la terapia celular con células madre, pero si las más frecuentes o las

que representan un paradigma, como es el caso de la enfermedad de Parkinson.

Terapia celular en enfermedades cardiovasculares

La cardiopatía isquémica es una de las causas más importantes de mortalidad

y morbilidad en el mundo occidental y un problema de salud pública. Dentro de

ésta, el infarto de miocardio tiene una especial trascendencia ya que el músculo

cardíaco posee una limitada capacidad de regenerarse, por lo que la necrosis de

una región lleva a la formación de una cicatriz fibrosa. Dependiendo del área a la

que afecte esta cicatriz, y debido a los mecanismos que condicionan el remodela-

do ventricular, el infarto puede llevar a una disminución progresiva e irreversible

de la función cardiaca, que conduce al síndrome de la insuficiencia cardíaca (IC).

La prevalencia de la IC en la población general en EEUU o el Reino Unido es del

orden del 1% y si nos fijamos en los mayores de 75 años oscila entre el 5 y

10%35. En los últimos años se han desarrollado nuevos tratamientos para la fase

aguda del infarto de miocardio (fibrinolisis, angioplastia primaria) que han tenido

un gran impacto en el pronóstico de estos pacientes pero que, desgraciadamente,

no han conseguido detener la evolución de la enfermedad que prosigue hasta el

desarrollo de la IC terminal. Para su tratamiento el único recurso real del que dis-

ponemos en la práctica clínica es el trasplante cardiaco, cuyas limitaciones más

importantes son la desproporción entre el número de donantes y receptores poten-

ciales, así como la necesidad de tratamiento inmunosupresor de por vida.

La posibilidad de utilizar células madre para regenerar el músculo cardía-

co destruido ha abierto enormes esperanzas para un número muy importante de

pacientes. Es probablemente en este campo donde la experiencia clínica es ma-

yor, habiéndose publicado en la actualidad más de 20 ensayos clínicos de tera-

pia celular en pacientes con infarto de miocardio. Por limitaciones de espacio

nos limitaremos a detallar los tipos de células empleadas y algunos aspectos

concretos de los resultados obtenidos (se han publicado excelentes revisiones

recientes en este sentido)36-40.

72



Diversos estudios, inicialmente en modelos experimentales y posterior-

mente en humanos, han utilizado las células madre del músculo para regenerar

el músculo cardíaco en pacientes con infarto de miocardio (mioblastos esquelé-

ticos)41. La plasticidad de las células de músculo esquelético junto con su capa-

cidad de responder a estímulos eléctricos sugieren la posibilidad de que células

musculares individuales (mioblastos) puedan ser convertidos en fibras muscula-

res capaces de producir trabajo cardíaco (cardiomioplastia celular)42. Los estu-

dios iniciales con mioblastos obtenidos de músculo esquelético han permitido

determinar que dichas células son capaces de injertar en el corazón de animales

de experimentación y contribuir a mejorar la función contractil del corazón43

constituyendo la base de la aplicación de esta técnica en pacientes con infarto

de miocardio.

El grupo de Menasche ha sido pionero en la utilización de mioblastos es-

queléticos, realizando el primer implante de mioblastos autólogos en un pa-

cientes con un IM en junio del 200044. La estrategia diseñada por este grupo, y

posteriormente utilizada por otros grupos, consiste en la obtención de una biop-

sia muscular del propio paciente entre las 2-3 semanas previas a la cirugía de

revascularización en pacientes con IM antiguo. Durante la cirugía se procede al

implante por inyección intramiocárdica de las células cultivadas in vitro en la

región peri-infarto. Los estudios realizados por el grupo de Menasche y por

nuestro grupo han permitido demostrar la seguridad del procedimiento y su efi-

cacia45,46. Otros grupos, de forma muy reciente, han utilizado una vía de admi-

nistración percutanea, evitando por tanto la necesidad de la cirugía47. Tanto los

estudios en modelos experimentales como los estudios clínicos indican la capa-

cidad de los mioblastos para implantarse y diferenciarse a células músculares

esqueléticas, Sin embargo, no se ha podido demostrar que las células origina-

das a partir de los mioblastos sean capaces de trasmitir las señales electromecá-

nicas derivadas de las células musculares cardiacas o de transdiferenciarse a

células musculares cardíacas.

Estudios recientes apoyan la existencia de diferentes poblaciones celulares

en la médula ósea (MO) con capacidad de diferenciarse a fibras musculares

cardíacas, así como a células endoteliales, contribuyendo a la angiogénesis o

vasculogénesis48-53. En la mayoría de estos estudios los investigadores han uti-

lizado poblaciones celulares heterogéneas, lo que limita de forma importante

las conclusiones, ya que no es posible determinar cuáles son exactamente las

células responsables del beneficio terapéutico. Frente a estudios en los que se

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han utilizado células mononucleadas de MO48, el grupo de Anversa y Orlic ha

utilizado poblaciones seleccionadas de células madre hematopoyéticas de MO

(Lin- Kit+) demostrando la capacidad de dicha células de injertarse, diferen-

ciarse a células musculares cardíacas y endoteliales y contribuir a la mejoría de

la función cardíaca.

Además de las células madre hematopoyéticas, en la médula ósea existen

progenitores y células madre angioblásticas, identificables por la presencia de

una serie de marcadores y antígenos celulares como CD34, AC133 o el recep-

tor de VEGR tipo 2, expresados a su vez en células madre hematopoyéticas53-

57. Estudios realizados en modelos animales de isquemia periférica e IM indi-

can que en la MO existen células madre endoteliales con capacidad de

contribuir a la neo-angiogénesis, favoreciendo la regeneración miocárdica49, 53,

58, 59. Estas células madre endoteliales pueden ser movilizadas a sangre perifé-

rica y contribuir también a la angiogénesis en extremidades isquémicas59.

Las células madre mesenquimales (MSC) son capaces de diferenciarse a

tejidos mesodérmicos como osteoblastos, condrocitos, adipocitos o músculo es-

quelético60 pero, a su vez, estudios recientes indican que las MSC son capaces

de diferenciarse tanto in vitro como in vivo a cardiomiocitos48, 61. In vitro, el

cultivo de MSC en presencia del agente desmetilante 5-azacitidina induce dife-

renciación hacia células con características fenotípicas y electrofisiológicas de

músculo cardíaco62. Utilizando modelos animales de IM, varios grupos han de-

mostrado que las células madre mesenquimales inyectadas en la cicatriz mio-

cárdica no sólo son capaces de injertarse, sino que adquieren características de

cardiomiocitos y, lo que es más importante, contribuyen a mejorar la función

cardíaca48, 63.

A pesar del número de incógnitas existentes, la acumulación de resultados

derivados de los estudios preclínicos en los últimos 5 años ha impulsado el de-

sarrollo de los primeros ensayos clínicos de factibilidad y seguridad de regene-

ración cardíaca con células madre. Tales ensayos hasta el momento no han es-

tado desprovistos de cierto grado de controversia, derivada de la opinión de

distintos investigadores cuyo argumento es la falta de suficientes evidencias

que apoyen el inicio de la investigación clínica. No vamos a detenernos en ar-

gumentar las distintas posturas, sino en poner en perspectiva los esfuerzos clí-

nicos realizados. Hasta el momento se han publicado al menos 20 estudios clí-

nicos en los que se han utilizado las vías percutánea, intracavitaria o

intramiocárdica, se han implantado células mononucleadas de médula ósea, cé-

74



lulas enriquecidas en progenitores hematopoyéticos o endoteliales o mioblastos

y los resultados se han monitorizado mediante técnicas de imagen y función

como resonancia, ecocardiografia o tomografía con positrones. Algunos estu-

dios han utilizado pacientes controles con los que comparar los resultados entre

los pacientes que han recibido células y los que no, pero en cualquier caso to-

dos los pacientes han recibido además de las células tratamientos adicionales.

La acumulación de estos resultados apoya la continuidad de los estudios en

marcha y el desarrollo de nuevos ensayos clínicos.

Terapia celular en Oftalmología

La visión, junto con los otros sentidos, provee la relación con el mundo

exterior, y es de gran valor para la supervivencia de muchas especies animales

y tiene un gran valor para los hombres. A pesar de su importancia, sólo en al-

gunas especies de anfibios se conserva una capacidad de regeneración impor-

tante de los tejidos del ojo. Es, por tanto, de gran valor conocer en profundidad

los distintos tipos de células madre del ojo y sus mecanismos de renovación y

regeneración, para intentar terapias capaces de recuperar los distintos tejidos

oculares que se pueden dañar. Las estructuras que tienen más interés desde el

punto de vista de la Medicina Regenerativa son el epitelio corneal, el epitelio

conjuntival y la retina.

La fuente de células del epitelio corneal son las células madre que se en-

cuentran en la región del limbo corneal. Estas células, que se encuentran en la

zona de transición entre la córnea y la esclera, tienen todas las características

de las células madre, ya que poseen una gran capacidad de renovación, que se

mantiene a lo largo de la vida y son capaces de originar células hijas que pue-

den sufrir un proceso de diferenciación terminal a células especializadas (64).

Sin embargo, no se ha podido demostrar que estas células sean pluripotentes y

parece que sólo dan lugar a células del epitelio corneal y conjuntival. Actual-

mente no existe un marcador biológico definitivo de las células madre del lim-

bo corneal, aunque se han propuesto varios, como la alfa-enolasa, y más re-

cientemente el factor de transcripción p63, aunque ciertamente estos antígenos

pueden aparecer en otras células65.

En condiciones fisiológicas, las células madre del limbo corneal son capa-

ces de suplir la necesidad de renovación de la córnea. Sin embargo, en algunas

situaciones patológicas, como traumatismos, quemaduras, sustancias químicas,

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síndrome de Stevens Johnson o penfigoide ocular, la capacidad de regeneración

de las células limbocorneales se ve desbordada (o se produce una disminución

o ausencia de éstas) y se origina un daño corneal permanente66. Aunque el tras-

plante de córnea es una opción, no es eficaz en los casos donde es necesario

restaurar el epitelio corneal. Kenyon y Tseng en 1989 fueron los primeros en

llevar a cabo un autotrasplante de limbo conjuntival67. Posteriormente, tras el

conocimiento de las células madre corneales, Kinoshita modificó la técnica pa-

ra transplantar células madre del limbo corneal en conejos.

Actualmente el trasplante de limbo corneal es una práctica reconocida,

usándose células del ojo contralateral cuando el daño es en un solo ojo, y célu-

las de un donante cuando el daño es bilateral. Se pueden usar células histocom-

patibles de un donante vivo, o células no compatibles de donantes cadáver. La

posibilidad de expandir ex vivo estas células puede reducir el riesgo de defi-

ciencia de células del limbo del ojo sano o del donante68. La combinación de

células del limbo con membrana amniótica se usa con éxito para promover una

rápida reepitelización de la córnea. En españa al menos 2 grupos de investiga-

ción (Vall d'Hebron y Clínica Universitaria) han implantado células madre lim-

bocorneales con éxito en pacientes con insuficiencia limbocorneal completa,

resultando en la re-epitelización de la cornea con mejoría de la agudeza visual

de los pacientes.

La retina neural y el epitelio pigmentario de la retina se desarrollan duran-

te el periodo postnatal temprano, y no hay evidencia de regeneración en la

edad adulta. Ha sido ampliamente documentada la presencia de células madre

en la retina de peces y anfibios. Sin embargo, hasta el año 2000 no se habían

identificado células progenitoras de la retina en mamíferos. Estas células se en-

cuentran en muy baja frecuencia en la zona ciliar marginal y tienen muchas

propiedades asociadas con las células madre: son capaces de proliferar y expre-

san el marcador neuroectodérmico nestina, son multipotentes y pueden autorre-

novarse. La identificación de células progenitoras de la retina abre la posibili-

dad de su uso para tratamiento en degeneraciones retinianas como la retinitis

pigmentosa, el glaucoma y la degeneración macular. El éxito del uso de células

madre retinianas para la regeneración de la retina depende de la posibilidad de

restaurar los complejos circuitos establecidos en la retina, ya que aunque el en-

tendimiento actual de las conexiones dentro de la retina es muy importante, se

conoce menos como se controla el proceso que lleva a estas conexiones entre

las células.

76



Además, se están llevando a cabo estudios experimentales con otros tipos

de células madre, como células madre neurales, células madre embrionarias,

células madre derivadas de la médula ósea, etc., que tratan de confirmar el po-

tencial del trasplante de células madre en este contexto y contribuyen al cono-

cimiento de los mecanismos de diferenciación y de integración de las células

transplantadas en la retina, que conduzca a un adecuado procesamiento visual.

Terapia celular en enfermedades musculares

El músculo ha sido reconocido recientemente como otra importante fuente

de células madre adultas. Las células progenitoras musculares más importantes

son las células satélite, que no sólo contribuyen a la regeneración de miofibras,

sino que se han demostrado capaces de diferenciarse en otras líneas celulares

como osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Si embargo, además de las células

satélite, existen otras poblaciones de células madre en el músculo con un ma-

yor potencial de diferenciación. El origen de estas células, bien existentes en el

músculo69 o procedentes de otros órganos como la médula ósea70, se desconoce

con precisión, pero en cualquier caso estas células serían las progenitoras de

las propias células satélite.

La mayoría de las lesiones musculares son reparadas espontáneamente,

sin que quede deterioro funcional, pero en algunas circunstancias, debido a la

importancia de la herida, ésta no cura completamente y se forma tejido cicatri-

cial que impide la recuperación funcional completa. En estos casos, la cura-

ción de la lesión podría ser mejorada aumentando la regeneración de fibras

musculares e inhibiendo la fibrosis. El trasplante de células progenitoras mus-

culares podría curar esas importantes lesiones. Muchos de los esfuerzos de los

investigadores que trabajan en patología muscular se centran en determinar la

forma de corregir miopatías congénitas tales como la distrofia muscular de

Duchenne, enfermedad caracterizada por la ausencia de expresión de distrofi-

na, una proteína de membrana imprescindible para mantener la integridad es-

tructural de las miofibras. A lo largo de la vida del enfermo se produce una

destrucción crónica del tejido muscular y aunque, inicialmente, las células sa-

télites son capaces de regenerar el músculo, progresivamente van agotando su

capacidad de proliferar. El objetivo del tratamiento sería conseguir células

musculares con genoma normal capaces de formar miofibras que se injerten y

regeneren el músculo atrofiado.

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Se han utilizado modelos experimentales de enfermedad de Duchenne,

más concretamente en ratones mdx1 (ratones transgénicos deficientes en dis-

trofina) para determinar la capacidad de distintos tipos de células madre de

contribuir a regenerar el músculo esquelético. De forma análoga a la regene-

ración cardíaca, los primeros estudios en modelos de distrofia muscular se

realizaron con mioblastos esqueléticos, es decir, células progenitoras muscu-

lares. Aunque los resultados iniciales en los año 90 no fueron positivos, per-

mitieron determinar una serie de aspectos como la importancia de la inmuno-

supresión y la forma de administración de células que posteriormente han

sido de gran utilidad a la hora de diseñar estudios nuevos71. De forma más

reciente, distintos grupos han utilizado otras fuentes de células madre con la

esperanza de poder utilizar una vía sistémica de administración72, 73. En estos

estudios se ha podido demostrar que utilizando células obtenidas de médula

ósea de ratones, un pequeño número de células contribuyen a formar fibras

musculares con expresión de distrofina. A pesar de intentos posteriores, el

grado de contribución de las células de médula ósea que se ha observado en

los distintos estudios hasta el día de hoy es muy escaso (menor del 1%). Una

de las principales limitaciones para el éxito de la terapia celular en pacientes

con distrofias musculares es la escasa supervivencia de las células una vez

implantadas, a pesar de que el implante se realice directamente en el múscu-

lo74, asi como el hecho de que el tratamiento se tendría que realizar entre un

donante y un receptor no idénticos y, por tanto, supeditado a problemas de

rechazo inmunológico.

Terapia celular en Traumatología

El organismo tiene una importante capacidad de reconstruir los huesos,

cartílagos y tendones dañados, gracias a la capacidad regenerativa de las célu-

las progenitoras presentes en las estructuras lesionadas. Por ahora estamos lejos

de conocer el origen y características fenotípicas de estas células progenitoras y

los factores que gobiernan la formación y remodelación de los huesos. A pesar

de este desconocimiento, ha sido posible la utilización de células maduras co-

mo forma de contribuir a la regeneración de tejidos óseos y cartilaginosos y,

concretamente, la utilización de células de cartílago cultivadas es un ejemplo

de cómo el autotrasplante de células maduras puede ser un tratamiento eficaz

para la reparación de la superficie articular75.

78



Más atractiva resulta la posibilidad de utilizar células madre con capacidad

de diferenciarse hacia tejidos de estirpe mesenquimal, como el hueso o el cartí-

lago. Las células madre mesenquimales (MSC) se pueden obtener a partir de

médula ósea, pero también de grasa e incluso otros tejidos. Son capaces, in vi-

tro, de autorenovarse y proliferar extensamente, sin perder su capacidad de di-

ferenciarse hacia osteoblasto, condrocitos, adipocitos o incluso músculo esque-

lético según las condiciones en las que se cultivan. Estas cualidades han

permitido su utilización para la reparación de lesiones óseas extensas, normal-

mente utilizando algún tipo de soporte en la colocación de las células. Igual-

mente, también se han utilizado para tratar defectos cartilaginosos y lesiones

traumáticas, pudiendo sustituir a los injertos de condrocitos, con la ventaja de

su mayor capacidad proliferativa y de supervivencia, al no tratarse de células

maduras sino de progenitoras.

También se han utilizado células mesenquimales en el tratamiento de ni-

ños con osteogénesis imperfecta76. En este estudio, los niños recibieron trata-

miento mediante trasplante alogénico, pudiendo demostrarse a los meses del

trasplante un mejoría muy significativa en la calidad y cantidad de tejido óseo

formado y demostrando la capacidad de las células mesenquimales injertadas

de generar osteoblastos y sintetizar nueva matriz ósea.

Terapia celular en enfermedades hepáticas

Un número importante de enfermos hepáticos puede curarse gracias al

trasplante hepático, que restituye un órgano enfermo por un órgano sano. De

igual forma que en otros tipos de trasplantes de órganos, las dificultades técni-

cas junto con la escasez de órganos hacen que el número de pacientes que se

benefician de esta terapéutica sea mucho menor que el número de potenciales

candidatos. La posibilidad de utilizar células madre de distintos orígenes, o in-

cluso hepatocitos maduros modificados genéticamente, aparece como una alter-

nativa de gran interés. Vaya por delante que no existen en la actualidad estu-

dios clínicos de regeneración hepática con células madre y tan sólo se han

realizado algunos estudios clínicos utilizando el trasplante de hepatocitos con

escaso éxito. Sin embargo, existen estudios experimentales que sugieren la po-

sibilidad de regenerar tejido hepático a partir de células madre.

Las células madre embrionarias tienen una indudable capacidad de dife-

renciarse en hepatocitos maduros in vitro; sin embargo, existen muy escasos

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estudios in vivo que hayan podido demostrar la eficacia de las células embrio-

narias en la regeneración hepática, existiendo además el problema de la genera-

ción de tumores a partir de dichas células embrionarias77.

La posibilidad de regenerar tejido hepático con células madre hematopoyéti-

cas se describió por primera vez por el grupo de Petersen78 en el que observaron

la contribución de células de médula ósea a la regeneración del hígado a través

de la diferenciación hacia células ovales. Utilizando un modelo de ratón transgé-

nico análogo a la tirosinemia humana tipo I, Lagasse demostró la capacidad de

las células madre hematopoyéticas de rescatar animales con dicha enfermedad,

con la consiguiente implicación clínica79. Aunque como ya hemos comentado no

existen estudios clínicos, sí que existen observaciones en pacientes sometidos a

trasplante de médula ósea en los que se ha podido demostrar que células deriva-

das del donante son capaces de adquirir características de células hepáticas, apo-

yando en humanos las observaciones de Lagasse y Petersen. La principal limita-

ción de estos estudios es que datos posteriores, obtenidos por diversos grupos de

investigación, sugieren que la mayor parte de los fenómenos de regeneración he-

pática, observados a partir de células madre hematopoyéticas, se deben realmente

a la capacidad de fusión de las células trasplantadas con los hepatocitos existen-

tes en el animal, y por tanto no a una auténtica transdiferenciación80. Aunque el

mecanismo que contribuye a la regeneración de los hepatocitos es de indudable

interés desde el punto de vista biológico, el hecho de que se trate de fusión celu-

lar o de auténtica transdiferenciación no disminuye su interés desde el punto de

vista clínico. Es decir, incluso en el caso de que las observaciones experimentales

de regeneración hepática se debieran mayoritariamente a fusión celular, sería po-

sible que resultaran clínicamente beneficiosas en pacientes.

La existencia de un compartimento hepático de células madre ya se sugi-

rió hace mas de 40 años81. Las células ovales fueron las primeras candidatas a

células madre hepáticas. Localizadas en los canales de Hering, son células ma-

dre multipotenciales capaces de diferenciarse a hepatocitos así como a epitelio

ductal, y poseen algunos antígenos comunes con células de médula ósea. Sin

duda esta población celular tiene cierta capacidad de regeneración hepática, pe-

ro a día de hoy permanece sin definir si realmente su origen está en el hígado

o, por el contrario, derivan de células de la médula ósea.

Estudios recientemente publicados sugieren que una población de células ma-

dre bien caracterizada, como las células madre mesenquimales, pueden contribuir a

la regeneración hepática. Como hemos mencionado anteriormente, la principal fuen-

80



te de células madre mesenquimales es la médula ósea, si bien es posible derivar di-

chas células a partir de otros tejidos, como la grasa. Son células no hematopoyéticas

de origen mesodérmico en las que, al menos in vitro, se ha podido demostrar su ca-

pacidad de diferenciarse a hepatocitos maduros y funcionales(82). El potencial in vivo

de esta población de células madre no esta definido en la actualidad.

CONCLUSIONES

A lo largo de las paginas anteriores hemos tratado de presentar una pers-

pectiva general, quizá un poco superficial, de lo que la terapia celular y las cé-

lulas madre podrían representar en el futuro. No tenemos ninguna duda de que

las posibilidades son enormes, pero sin embargo es muy importante que sea-

mos conscientes de que estamos todavía muy lejos de alcanzar el objetivo de

utilizar clínicamente esta nueva herramienta. Este es el mensaje más importan-

te que queremos trasmitir: a pesar de las enormes expectativas que existen para

pacientes con enfermedades incurables, es imprescindible eludir el optimismo

exagerado y continuar desarrollando una investigación de calidad científica que

nos permita alcanzar nuestros objetivos.

No sabemos si la terapia celular llegará a curar la diabetes o la enferme-

dad de Parkinson, pero si lo hace seguro que no será en los próximos 5 años,

ni con células madre adultas ni con células madre embrionarias. Los obstáculos

existentes son enormes, y es responsabilidad de los médicos e investigadores

no manipular ni trasmitir esperanzas erróneas e infundadas a los pacientes, que

a la larga se volverán contra nosotros.

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Avances en terapia regenerativa

INTRODUCCIÓN

El término célula madre o célula troncal (stem cell) se utiliza para definir una

célula indiferenciada con capacidad de autorregeneración que, a su vez, puede dar

lugar a diferentes líneas de células especializadas. Es decir, son células con capa-

cidad de división asimétrica (Fig. 1). Se describieron inicialmente en el embrión y

son el origen de todas las líneas celulares somáticas y germinales que conforma-

rán el nuevo organismo (células madre embrionarias totipotenciales); desde el año

2001 se están describiendo células con características semejantes en diferentes te-

jidos del organismo adulto (células madre adultas) (Silvester et al 2004).

Se conoce como terapia celular al método que intenta curar enfermedades

con el uso de células vivas. El concepto de Medicina Regenerativa sugiere la

AVANCES EN TERAPIA REGENERATIVAMaría Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Migueláñez, Jacobo Trébol López,Damián García Olmo

Cátedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina RegenerativaUnidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz de Madrid

El término de célula madre se ha hecho tan popular dentro yfuera del foro científico que, en ocasiones, puede parecerque pierde credibilidad. Por esto es tan importante respetarlas normas del rigor científico, por un lado, y filtrar lainformación que nos llega, por otro, de manera que nuestrainvestigación parta de una base completamente revisada.En este artículo se ha realizado una actualización de laliteratura con dos objetivos: conocer cada uno de los tiposde células madre existentes y las ventajas e inconvenientesque presentan; saber cuál es la aplicación clínica enhumanos que tienen este tipo de células, basándonos en larevisión de los ensayos clínicos en fase I y II publicados enla literatura.



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posibilidad de obtener

en el laboratorio, a

partir de las células

madre, órganos con

todas sus funciones.

Sin embargo, existen

todavía barreras im-

portantes en este cam-

po; algunas de ellas

son puramente técni-

cas o de laboratorio

(desarrollo de mejores

procedimientos de se-

lección y cultivo de

células) y otras son las barreras que podríamos llamar fisiopatoló-

gicas o médicas (como la posibilidad de inmunotolerancia de las

células. Salvar este problema de inmunotolerancia supondría poder

realizar trasplantes celulares alogénicos sin necesidad de inmuno-

supresión).

En este artículo se intentará contestar a dos preguntas que resultan funda-

mentales para evaluar en qué momento se encuentra actualmente la terapia re-

generativa:

–¿Qué tipo de células madre son mejores para el uso terapéutico en humanos?

–¿Cuáles son los últimos avances en terapia regenerativa en humanos?

¿QUÉ TIPO DE CÉLULAS MADRE SON MEJORES PARA EL USOTERAPÉUTICO EN HUMANOS?

Las células madre embrionarias se obtienen a partir de un blastocisto. Una

vez aisladas de la masa celular interna del embrión en este estadio pueden

mantenerse en cultivo de forma indiferenciada porque se dividen indefinida-

mente. Teóricamente podrían constituir una fuente de progenitores de células

de las tres capas embrionarias: endodermo, ectodermo y mesodermo (células

pluripotenciales). Sin embargo, no pueden ser usadas en clínica al menos por

cuatro graves problemas: son cancerígenas, generan problemas de histocompa-

Figura 1. Representaciónesquemática del conceptode reproducciónasimétrica que caracterizaa las células madre.

CCéélluullaa mmaaddrree

CCéélluullaa ddiiffeerreenncciiaaddaa

AAuuttoorrrreennoovvaacciióónn

tibilidad, requieren un gasto imposible de asumir para las patologías que se

pretenden tratar y plantean problemas éticos de gran complejidad.

Las células madre adultas se encuentran en tejidos órgano-específicos des-

pués del nacimiento. Al principio se pensó que las células progenitoras existen-

tes en los tejidos adultos estaban predeterminadas para generar exclusivamente

un tipo de célula especializada de ese tejido. Por ello se las llamó células mul-

tipotenciales. Así, por ejemplo, las células progenitoras de las criptas intestina-

les solo podrían formar células del epitelio intestinal. Sin embargo, en sucesi-

vos experimentos se ha comprobado que hay células madre en tejidos adultos

con capacidad de transdiferenciación, es decir, que son capaces de dar lugar a

múltiples líneas celulares de las tres capas embrionarias. De esta manera, estas

células podrían ser consideradas verdaderas células pluripotenciales. Un buen

ejemplo de ello es que a partir de células madre de la médula ósea se han obte-

nido líneas celulares como condrocitos, miocitos o neuronas (Conrad et al.

2005).

El uso de células autólogas (del mismo sujeto) o alogénicas (de la misma

especie) obtenidas de sujetos adultos parece suponer un camino más sencillo y

seguro para la terapia celular. Por ello hay que señalar que, hoy por hoy, el uso

de las células madre de origen embrionario está alejado de la clínica humana,

por lo que la única fuente celular en la Medicina Regenerativa actual son los

tejidos del propio ser humano adulto. Actualmente hay cinco fuentes de células

madre de uso clínico: la médula ósea, la sangre periférica, el cordón umbilical,

la biopsia muscular y la grasa (lipoaspirados). La siguiente cuestión es averi-

guar cuál es el mejor tejido donante.

La capacidad de algunas células del estroma de la médula ósea para dife-

renciarse también en otras líneas celulares no hematopoyéticas está hoy bien

documentada. Ha sido demostrado por varios autores (Pittenger et al 1999) que

estas células pueden diferenciarse in vitro evolucionando a osteoblastos, con-

drocitos o adipocitos en función de los factores de crecimiento que se utilicen

para estimularlas. También es interesante la posibilidad de que estas células,

tras entrar en la circulación, puedan migrar a otros lugares del cuerpo donde

pueden diferenciarse y reparar tejido dañado. Puede que, en el futuro, el trata-

miento consista únicamente en usar citocinas para incrementar la salida a la

circulación de las células madre de la médula ósea, tal y como han mostrado

resultados prometedores en modelos murinos (Orlic et al. 2003). Por otro lado,

no debe olvidarse que el uso de citocinas como factores estimulantes de colo-

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nias se ha visto asociado a efectos secundarios que aún hoy son difíciles de

predecir. El problema es que para obtener poblaciones celulares de la médula

ósea es necesario realizar varias punciones bajo anestesia, que comportan mo-

lestias y riesgos.

Desde 1980 ha sido posible movilizar estas células a la sangre periférica

donde pueden ser recogidas por aféresis, un procedimiento que es más prácti-

co, menos doloroso y asociado a menor riesgo que las punciones (Lewis et al.

2005). Por otro lado, se ha comunicado que las células madre procedentes de

sangre periférica desarrollan el injerto de neutrófilos y plaquetas más rápida-

mente reduciendo el riesgo de infección o hemorragia en el tratamiento de la

enfermedad hemato-oncológica.

El transplante de células de cordón umbilical en adultos presentan las si-

guientes ventajas respecto a las derivadas de médula ósea (Chao et al. 2004): 1.

Fácil disponibilidad (se pueden tener en depósito perfectamente testadas y con

la tipificación de HLA para su uso inmediato); 2. No existe riesgo para madres

y donantes; 3. Posibilidad escasa de transmitir infecciones, particularmente ci-

tomegalovirus; 4. Pocas posibilidades de desarrollar enfermedad de injerto con-

tra huésped; 5. Criterios menos estrictos para el cruce de HLA; 6. El donante

no sufre una agresión. Este tratamiento se ha utilizado sobre todo en enferme-

dades hematológicas como leucemia mieloide crónica, leucemia aguda o sín-

dromes mielodisplásicos. El transplante de células madre del cordón umbilical

expandidas ex vivo está todavía en experimentación.

El crecimiento y la regeneración del músculo tras una agresión del mismo

denotan la existencia de células musculares progenitoras en este órgano (Jan-

kowski et al 2004). Se ha defendido la idea de que la miogénesis es atribuible

a precursores musculares circulantes, habiéndose demostrado en algunos traba-

jos que esta labor la realizan células madre dependientes del músculo y tam-

bién de la médula ósea. Esta vía sistémica todavía se encuentra en investiga-

ción, ya que no se ha logrado evitar las pérdidas celulares para conseguir que

las células cumplan su objetivo. En cualquier caso, la biopsia muscular se ha

mostrado como una buena fuente de células madre (Herreros et al 2003).

El tejido adiposo, como la MO, deriva de la hoja embrionaria mesodérmi-

ca y contiene estroma que puede ser aislado fácilmente. Aquí se han identifica-

do células madre denominadas células madre derivadas de lipoaspirado

(CMDL) (Zuk et al. 2001 y 2002). El proceso de aislamiento de esta población

de células madre fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964. Más tarde

92



el procedimiento fue

mejorado por varios

grupos de investiga-

ción y, finalmente, las

células fueron caracte-

rizadas como células

madre por el equipo

de Hedrick del "Labo-

ratorio de Bioingenie-

ría y Reparación Rege-

nerativa" del Servicio

de Cirugía de la Uni-

versidad de California

de Los Ángeles (Zuk

et al. 2001).

Estas células, al igual que las células madre mesenquimales de

la MO, pueden evolucionar hacia líneas osteogénicas, adipogéni-

cas, miogénicas y condrogénicas. Lo más sorprendente es que tam-

bién pueden diferenciarse en células de características neuronales

(Ashjian et al. 2003). Muestran una caracterización muy similar a

las derivadas de MO (CD29, CD44, CD71, CD90, CD13, CD105, SH-3 y

STRO-1) pero también algunos marcadores específicos (CD49d, CD106,

CD54, CD 34) (De Ugarte et al. 2003). No se han observado diferencias sig-

nificativas entre los dos tipos de células respecto a la adherencia estromal, el

crecimiento, la senescencia celular, la capacidad de diferenciarse en diferen-

tes líneas celulares y la eficiencia en la transducción genética (De Ugarte et

al. 2003). El proceso de obtención se inicia con una liposucción al paciente

que se realiza bajo anestesia local o sedación. El lipoaspirado se somete a un

proceso de laboratorio mediante el cual se aíslan las células adecuadas; éstas

se cultivan a 37º C hasta que el crecimiento alcanza la subconfluencia (Fig.

2). En ese momento pueden emplearse terapéuticamente o ser criopresevadas

para su uso posterior. Este método presenta las siguientes ventajas respecto al

necesario para obtener células de médula ósea: 1. Es seguro; 2. La grasa es

un tejido de fácil acceso; 3. Es menos molesto y agresivo que las punciones

medulares; 4. Puede realizarse bajo anestesia local; 5. Las células pueden

criopreservarse (Mizuno et al. 2003).

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Figura 2. Célulasmesenquimalesprocedentes de

lipoaspirados en cultivo.

Por todo esto, desde nuestro punto de vista de clínicos, las células madre

derivadas de lipoaspirado superan incluso a las de médula ósea a la hora de

utilizarlas en terapia humana. Como cirujanos, el método de obtención nos

resulta sencillo y cotidiano, pero puede ser igualmente alcanzable para cual-

quier especialista que cuente con un cirujano plástico o general en su centro

de trabajo.

Al revisar la literatura actual sobre las células madre derivadas de lipoas-

pirado, se observa que la mayoría de los trabajos publicados se centran en su

caracterización en el laboratorio o en ensayos realizados en animales. De he-

cho, sólo se ha comunicado un ensayo clínico realizado en humanos (García

Olmo et al. 2005). Esto significa que, a pesar de su manejabilidad y fácil ob-

tención, el clínico todavía no se ha acostumbrado a este tipo de células, posi-

blemente por desconocimiento o rutina.

Ahora bien, este modelo celular se está analizando ampliamente en mode-

los experimentales. Se han comunicado estudios en animales que utilizan

CMDL como vehículo de determinados genes. Dragoo y cols. (Dragoo et al.

2003, 2005) aislaron células madre derivadas de lipoaspirado de la grasa sub-

cutánea y de la almohadilla infrapatelar y las cultivaron en un medio osteogé-

nico. La mitad de estas células fueron transfectadas con un adenovirus con el

cDNA para la proteína morfogenética básica (BMP-2). Las células, inmersas en

una matriz de colágeno I, fueron inyectadas en una pata trasera de ratones in-

munodeficientes; la otra pata fue inyectada con CMDL no modificadas genéti-

camente. Tras 6 semanas se comprobó que en la pata donde se inyectaron las

células transfectadas, el hueso tenía una mineralización adecuada y comenzaba

a establecer la cavidad medular.

Por otro lado, Martinez-Estrada y cols. (Martinez-Estrada et al. 2005) con-

siguieron diferenciar CMDL en EPC (células progenitoras endoteliales postna-

tales) cultivándolas en un medio hematopoyético. El primer marcador que ex-

presaron fue Flk-1, y progresivamente Ve-caderina y factor de Von Willebrand.

Dado que el bajo número de EPC en la circulación limita su uso en Medicina,

las CMDL pueden ser un gran apoyo.

Además, es muy prometedor el efecto anti-inflamatorio que presentan las

CMDL. Se ha comparado (Puissant y cols. 2005) el efecto de las células madre

derivadas de médula ósea con las CMDL. Las CMDL no provocaron in vitro

"alorreactividad" frente a linfocitos incompatibles, es más, lograron suprimir la

reacción linfocitaria mixta (MLR) y la proliferación linfocitaria como respuesta

94



a mitógenos. Cuando las CMDL y los linfocitos fueron separados por una

membrana permeable estos hallazgos no se repitieron, lo que hace pensar que

es necesario el contacto celular para desencadenar esta reacción. Aquí surge

una nueva idea respecto a la posibilidad de utilizar estas células de manera alo-

génica a partir de un banco de donantes.

En esta línea, otro estudio (Aust et al 2004) investigó el rendimiento celu-

lar por milímetro cúbico de lipoaspirado y los marcadores de superficie que de-

terminan su fenotipo. Se recogió el producto de lipoaspirado de 18 donantes

mujeres, registrando su edad e índice de masa corporal (BMI). El rendimiento

celular medio fue de 404.000±206.000 células por milímetro de lipoaspirado,

de manera inversamente proporcional al BMI pero no a la edad. Las CMDL

eran positivas homogéneamente para CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e,

CD59, CD90 y HLA-ABC; y homogéneamente negativas para CD11b, CD45 y

HLA-DR. La ausencia del marcador panhematopoyético CD45 indica que las

células no derivaban de células madre circulantes. El hecho de obtener una po-

blación tan homogénea procedente de múltiples donantes refuerza también la

idea del empleo alogénico en un futuro.

Por último, Morizono y cols. (Morizono et al. 2003) examinaron la infec-

ción de las CMDL con vectores como adenovirus, oncoretrovirus y lentivirus,

demostrando la posibilidad de transfectarlas con lentivirus. Las células mantie-

nen la expresión transgénica tras diferenciarse en líneas adipogénicas y osteo-

génicas. Así, las CMDL y un vector como el lentivirus pueden ser una buena

combinación como vehículo de la terapia génica.

Para utilizar las células en humanos se han desarrollando ensayos de biosegu-

ridad. Para llegar a realizar estudios en humanos las células se han sometido a es-

tudios de caracterización por inmunofluorescencia y de crecimiento. Existe un tra-

bajo en la literatura en el cual se ha comunicado que, tras mantenerlas en cultivos

durante mucho tiempo, las CMDL pueden experimentar una transformación neo-

plásica capaz de desarrollar tumores en el ratón (Rubio et al. 2005). La posibili-

dad de transformación neoplásica de CMDL humanas in vitro se vio en cultivos

en los que se permitió el crecimiento más allá de la subconfluencia, manteniéndo-

los incluso más de dos meses después del aislamiento celular. En estas células se

demostró la transformación neoplásica mediante el estudio del cariotipo, que con-

firmó la existencia de cambios en el DNA. Se observó, además, que eran células

de crecimiento anómalo o no controlado, capaces de desarrollar tumores al inocu-

larse en ratones inmunodeprimidos. Por otro lado, de manera paralela, se cultiva-

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ron CMDL evitando el crecimiento más allá del 85% de confluencia celular. En

estas células también se estudió el cariotipo y se inocularon después en ratones

deficientes, observándose ausencia de alteraciones en el DNA y de desarrollo de

tumores en los animales. Ésta es la razón por la cual nuestro grupo siempre ha uti-

lizado células del pase 3 o menor, antes de que las células lleguen a la subcon-

fluencia. No hemos observado ningún caso de reacciones de rechazo ni transfor-

mación tumoral. Por otro lado, la terapia con células madre derivadas de

lipoaspirado, que nuestro grupo utiliza en el tratamiento de fístulas en humanos,

se ha demostrado tan segura que ha sido aprobada por la Agencia Europea del

Medicamento (EMEA) para que este "producto" sea considerado un medicamento

huérfano ("orphan drug"). Además, este ensayo clínico está registrado en Clinical-

trials.gov, ID: NCT00115466) para el tratamiento de la fístula perianal compleja.

¿CUÁLES SON LOS ÚLTIMOS AVANCES EN TERAPIAREGENERATIVA EN HUMANOS?

El uso de células madre como terapia en humanos se está extendiendo rá-

pidamente en distintos campos de la Medicina. Los grupos que investigaban las

enfermedades hematológicas fueron pioneros al iniciar este camino. Actual-

mente, los oncólogos trabajan en íntima colaboración con los hematólogos para

tratar enfermedades proliferativas con stem cells. Se ha comunicado un estudio

en fase I/II sobre el tratamiento del cáncer de ovario (Frickhofen et al. 2006).

Este tipo de tumor es quimiosensible, pero la mayoría de los pacientes mueren

por la progresión del mismo. La quimioterapia cura el 25% de los pacientes,

por ello está justificado el tratamiento con altas dosis. Se incluyeron 48 pacien-

tes con cáncer de ovario intratable realizándose una movilización de células de

sangre periférica con ciclofosfamida y paclitaxel. Posteriormente las pacientes

se sometieron a dos ciclos de altas dosis de quimioterapia con carboplatino/pa-

clitaxel y carboplatino/melfalan/etoposido. A los 8 años la supervivencia libre

de enfermedad fue de 13,3 meses y la supervivencia global de 37 meses.

La imposibilidad de regeneración de los miocardiocitos en la enfermedad

isquémica supone el fallo cardíaco congestivo postinfarto y el deterioro de la

función del ventrículo izquierdo. Tras demostrar que las células madre proce-

dentes de la médula ósea y de la sangre periférica son capaces de evolucionar a

miocardiocitos bajo las condiciones adecuadas, se están utilizando como tera-

96



pia de la cardiopatía isquémica dentro de varios ensayos clínicos (Schachinger

et aml 2006) (Bardoff et al. 2006) (Emanueli et al. 2005) (Thorin-Trescases et

al. 2005). Este tratamiento parece reemplazar a los miocardiocitos, desarrollar

neoangiogénesis y conseguir la remodelación de la cicatriz. También se ha

comparado el efecto de stem cells derivadas de médula ósea frente a las deriva-

das de sangre periférica, asociándose a las primeras una mejoría significativa

de la eyección del ventrículo izquierdo a los tres meses (Assmus et al. 2006).

Las grandes heridas de los quemados se presentan como otro ejemplo de

terapia celular. Gracias a células madre procedentes de la médula ósea se ha

conseguido una recuperación precoz tanto de las áreas quemadas, como de las

zonas donde se extrajeron los autoinjertos libres de piel (Rasulov et al. 2005).

Se ha comunicado el tratamiento satisfactorio de úlceras del limbo ocular

en pacientes diabéticos. Tras realizar una inyección en el limbo ocular de célu-

las madre derivadas de sangre periférica en los pacientes del grupo de trata-

miento se encontró una tasa de cicatrización completa del 77,8% frente a un

38,9% de los pacientes tratados con placebo (Huang et al. 2005).

En casos severos de enfermedades autoinmunes se están utilizando ciclos

de altas dosis de quimioterapia seguidos de transplante de células hematopoyé-

ticas. Los estudios en fase I y II realizados en 473 pacientes mostraron una

mortalidad del 11% debido a una complicación del transplante o a la progre-

sión de la enfermedad. El 71% de los pacientes respondieron a la terapia con

una franca mejoría de la enfermedad (Gratwohl et al. 2005).

Una de las líneas de investigación de nuestro equipo es el tratamiento de

fístulas en humanos con células madre derivadas de lipoaspirado. Hemos desa-

rrollado un estudio en fase I, con el objetivo de demostrar que la terapia es se-

gura y factible, y un estudio en fase II para conocer la eficacia.

Los resultados del estudio en fase I ya han sido comunicados (García-Ol-

mo et al. 2005). Se reclutaron cinco pacientes desde abril del 2002 a noviem-

bre del 2003, tres hombres y dos mujeres. Se realizaron nueve implantes celu-

lares, 4 en fístulas rectovaginales, 4 en fístulas enterocutáneas (tres fístulas en

el mismo paciente) y uno en una fístula perianal supraesfinteriana. El segui-

miento mínimo exigido en el protocolo fue de 8 semanas. Finalmente se inocu-

laron con CMDL pase 3 o menor nueve fístulas de cuatro pacientes. Ocho de

las fístulas fueron consideradas como evaluables y fueron seguidas durante un

mínimo de ocho semanas (Tabla 1). Se logró ausencia de supuración y el cierre

del orificio externo con reepitelización a la octava semana en seis fístulas

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(75,0%); estos pacien-

tes se consideraron

curados. Las otras dos

fístulas sólo mostra-

ron un cierre parcial

del orificio externo

con disminución del

flujo, según refirieron

los pacientes, pero

con ausencia de reepi-

telización. Estos dos

pacientes fueron con-

siderados no curados

(25,0%).

Actualmente se

han cumplido más de

dos años de segui-

miento en todos estos

pacientes y ninguno

de los considerados

curados ha presentado

una recidiva de la fís-

tula. No existió rela-

ción entre el número

de células inyectadas

y la reepitelización.

No existió relación

entre el sexo y la

edad de los pacientes

y la curación.

Los procedimien-

tos quirúrgicos y de

implantación se realizaron de manera habitual y sin dificultades téc-

nicas añadidas debidas a la inyección celular de las nueve fístulas

tratadas (Fig. 3). No se observaron efectos adversos en ninguno de

los 9 implantes.

98



Figura 3. Procedimientopara el tratamiento de lasfístulas en el ensayoclínico en fase I.

No se han observado efectos adversos a largo plazo ni aparición de tumo-

res u otras enfermedades en los dos años siguientes a la aplicación de las célu-

las (Tabla 1).

Por otro lado, hemos concluido el ensayo clínico en fase II que analiza la

eficacia de la terapia con células madre derivadas de lipoaspirado para el trata-

miento de fístulas perianales complejas, que está pendiente de publicación.

Para concluir, ha quedado claro que el tratamiento con células madre adul-

tas es una de las líneas de investigación más prometedoras actualmente. Lo

más importante es la gran aplicación clínica que posee, que esperamos que siga

desarrollándose a este ritmo casi vertiginoso, aunque siempre dentro de las nor-

mas de buena praxis clínica y siguiendo el máximo rigor científico.

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Tabla 1. Resumen de los resultados clínicos el fase I. NE, no evaluable; NI, no implantadoNº Nº Tipo de Nº Días Nº células

implante paciente fístula pase cultivo (x106) Resultado

1 001 Rectovaginal 1 6 6.1 Curado

2 002 Enterocutanea 1 9 9.0 Curado

3 002 Enterocutanea 1 7 8.0 NA

NI 003 Perineal 1 NE NI NA

4 002 Rectovaginal 2 14 10.0 No curado


6 001 Rectovaginal 1 12 20.0 Curado

7 004 Enterocutanea 2 16 30.0 No Curado

8 005 Perineal 2 31 20.0 Curado


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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas

INTRODUCCIÓN: ¿QUE ES LA NANOBIOTECNOLOGÍA?

Desde hace unos años, la Nanotecnología se esta perfilando como un área

emergente en ciencia y tecnología y todo indica que esta disciplina nos conducirá

a una nueva revolución industrial. La Nanotecnología hace referencia a las técni-

cas que permiten manipular la materia a escala atómica y molecular. Nano- signi-

fica la milmillonésima parte de un metro. Lo mas interesante de la Nanotecnolo-

gía no es la posibilidad de trabajar con materiales de reducidas dimensiones, sino

el cambio a menudo radical que sufren las propiedades físicas y químicas de la

materia cuando se trabaja a escala nanométrica: la conductividad eléctrica, el co-

lor, la resistencia, o la elasticidad, entre otras propiedades, se comportan de ma-

nera diferente a como lo hace el material volumétrico (ver Figura 1).

La Nanotecnología tiene gran aplicación en diferentes campos, entre los

que destacan los materiales, la electrónica, la Medicina y la energía. Así, ya se

NANOBIOTECNOLOGÍA: HERRAMIENTASDIAGNÓSTICAS Y TERAPÉUTICASLaura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica (IMM-CNM). CSIC

La Nanobiotecnología, convergencia entre la Nanotecnologíay la Biotecnología, es la rama de la Nanotecnología que seperfila como la de mayor impacto en un futuro próximodebido a sus importantes aplicaciones, especialmente,diagnósticas y terapéuticas. La detección temprana deenfermedades, su tratamiento precoz a nivel personalizadoy el posterior seguimiento de su evolución serán posibles enlos próximos años gracias a la aplicación de las herramientasnanobiotecnológicas que se están actualmentedesarrollando. Los importantes avances en este campopodrían dar lugar a sistemas de diagnóstico y terapéuticosde mayor eficacia que los existentes, lo que redundaría enuna mayor calidad de vida para los ciudadanos.



104

está avanzando en

conseguir materia-

les de mayor dure-

za y resistencia,

ordenadores más

veloces y con ma-

yor capacidad gra-

cias a los micro-

procesadores con

componentes nano-

tecnológicos, diag-

nósticos médicos

más eficaces o

energía abundante

a bajo coste y res-

petuosa con el me-

dio ambiente. Actualmente ya existen productos “nanotecnológicos”

en el mercado como cosméticos más eficaces y protectores, raquetas

de tenis más flexibles y resistentes o gafas que no se rayan, por citar

algunos ejemplos.

La irrupción de la Nanotecnología en la Biotecnología y en la Medicina ha

dado lugar a una nueva disciplina que se denomina Nanobiotecnología y que sin

duda constituirá uno de los pilares básicos de esta nueva revolución industrial.

La Nanobiotecnología se define como la aplicación de herramientas, com-

ponentes y procesos de la Nanotecnología al campo de la salud, lo que fre-

cuentemente se denomina también como Nanomedicina, permitiendo el desa-

rrollo de herramientas para diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades cuando

están todavía en estados poco avanzados o en el inicio de su desarrollo. La Na-

nomedicina estudia interacciones a la nanoescala (1 a 100 nm) y para ello utili-

za dispositivos, sistemas y tecnologías que incluyen nanoestructuras capaces de

interactuar a escala molecular y que se interconectan a nivel micro para inte-

raccionar a nivel celular. Uno de los grandes retos en este proceso reside en el

desarrollo de “nanoterapias”, dirigidas específicamente a los tejidos y órganos

enfermos, evitándose dañar a las células sanas circundantes.

En nuestro mundo industrializado se está observando un progresivo aumento

de graves enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la

Figura 1. Comparativa detamaños entre el mundonatural y el mundo artificialdesarrollado medianteMicro y Nanotecnología.

diabetes o las enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson), para

las que no existen tratamientos definitivos. Por otra parte, debido a la mayor cali-

dad de vida y al aumento de la esperanza de vida, hay un progresivo envejeci-

miento de la sociedad y una mayor incidencia de enfermedades crónicas, lo que

está significando un considerable aumento del gasto de la sanidad pública.

Es evidente que necesitamos nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos

que sean más rápidos, eficaces y específicos que los actuales y que, además,

reduzcan al máximo los costes de los análisis y los servicios. La Nanomedicina

promete resolver algunos de estos grandes retos mediante la capacidad de de-

tectar de forma precoz la presencia de enfermedades (como el cáncer) o la ca-

pacidad de regenerar los órganos y tejidos que estén dañados dentro del orga-

nismo, proporcionado un diagnóstico precoz, una terapia adecuada y un

seguimiento posterior efectivo de la evolución del paciente. En un futuro próxi-

mo se podrá incluso disponer de tratamientos individualizados a distancia en el

propio hogar o lugar de trabajo del paciente.

NANOMEDICINA

La Nanomedicina agrupa tres áreas principales: el nanodiagnóstico, la libera-

ción controlada de fármacos y la medicina regenerativa, tal como se detalla en la

Figura 2. El nanodiagnóstico desarrolla sistemas de análisis y de imagen para de-

tectar una enfermedad o un mal funcionamiento celular en los estadios más tem-

pranos posibles tanto in vivo como in vitro. Los nanosistemas de liberación de fár-

macos transportan los medicamentos sólo a las células o zonas afectadas para

conseguir un tratamiento más efectivo y con menos efectos secundarios

y, además, protegiendo al fármaco de la degradación antes de llegar a

su destino. La medicina regenerativa pretende reparar o reemplazar te-

jidos y órganos dañados aplicando

herramientas nanobiotecnológicas.

A continuación se detalla el

nivel de desarrollo que se ha con-

seguido hasta la fecha principal-

mente en el área de nanodiagnósti-

co, así como las principales lineas

de investigación futuras.105

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Figura 2. Áreas deinvestigación en

Nanomedicina.

Nanodiagnóstico

El objetivo del nanodiagnóstico es identificar la aparición de una enferme-

dad en sus primeros estadios a nivel celular o molecular e idealmente al nivel

de una sola célula, mediante la utilización de nanodispositivos (nanobiosenso-

res, biochips de ADN, laboratorios-en-un-chip, nanopinzas, nanosondas...). De

esta forma se conseguiría una capacidad de respuesta más rápida para comenzar

el tratamiento adecuado de cada enfermedad o bien de reparar o recrecer los te-

jidos y órganos dañados, lo que ofrecería mayores posibilidades de curación.

Los nanosistemas de diagnóstico se pueden aplicar in vitro o in vivo. En

aplicaciones de diagnóstico in vitro, los nanodispositivos son capaces de detec-

tar con gran rapidez, precisión y sensibilidad la presencia de patógenos o de-

fectos en el ADN a partir de volúmenes muy reducidos de muestras de fluidos

corporales o de tejidos. En aplicaciones de diagnóstico in vivo, se pueden desa-

rrollar dispositivos biocompatibles que, por ejemplo, puedan penetrar en el

cuerpo humano para identificar estadios iniciales de una enfermedad, identifi-

car y cuantificar la presencia de un determinado patógeno o de células cancerí-

genas, etc.

La principal área del nanodiagnóstico son los nanobiosensores, dispositi-

vos capaces de detectar en tiempo real y con una alta sensibilidad y selectivi-

dad agentes químicos y biológicos.

Biosensores

Desde que en el año 1962 surgió el primer concepto de biosensor (biosen-

sor de glucosa, Clark, 1962), el campo de investigación sobre biosensores ha

ido creciendo de forma exponencial hasta convertirse en un área fundamental

de trabajo. La masiva introducción en el mercado de los biosensores de gluco-

sa, que son utilizados diariamente por miles de personas en todo el mundo, su-

puso la prueba más concluyente de la utilidad de la tecnología biosensora, al

ayudar a miles de enfermos diabéticos a mantener una mejor calidad de vida.

Un biosensor se puede definir como un dispositivo compuesto por dos

elementos fundamentales: un receptor biológico (por ejemplo proteínas, ADN,

células,...) preparado para detectar específicamente una sustancia basado en la

gran especificidad de las interacciones biomoleculares y un transductor o sen-

106



sor, capaz de interpre-

tar la reacción de reco-

nocimiento biológico

que produce el receptor

y “traducirla” en una

señal cuantificable. En

la Fig. 3 se muestra el

esquema básico de fun-

cionamiento de un bio-

sensor.

Los dos constituyentes del biosensor están integrados conjunta-

mente y es precisamente esta íntima unión de dos mundos opuestos

(el “vivo” y el “inerte”) la que le confiere a los dispositivos biosen-

sores sus especiales características de sensibilidad y selectividad. Es frecuente

confundir el termino “biosensor” con un dispositivo que mide moléculas bioló-

gicas, cuando en realidad el nombre “biosensor” hace referencia a la parte re-

ceptora biológica que lleva incorporada en su interior.

Además de la sensibilidad y selectividad, una de las características funda-

mentales que hace atractivos a los biosensores es la posibilidad de realizar el

análisis de la sustancia a determinar en tiempo real y de forma directa (sin nece-

sidad de marcador) a diferencia de cualquier análisis biológico o clínico que re-

quiere siempre un marcador (ya sea fluorescente o radioactivo). Estas dos carac-

terísticas le confieren a los biosensores la posibilidad de realizar no sólo un

análisis cualitativo (si/no) y cuantitativo, sino también la posibilidad de evaluar

la cinética de la interacción (constante de afinidad, asociación, disociación,...) y,

por tanto, elucidar los mecanismos fundamentales de dicha interacción. Las téc-

nicas de análisis de laboratorio más habituales, ya sea de sustancias químicas o

biológicas, suelen ser laboriosas, consumen mucho tiempo y en la mayoría de la

ocasiones requieren personal especializado para su manejo. Frente a ellas los

biosensores ofrecen la posibilidad de hacer medidas directas, continuas, de for-

ma rápida y con alta sensibilidad. Además, muchos biosensores ofrecen también

las ventajas del pequeño tamaño y la portabilidad, lo que posibilita su utiliza-

ción en cualquier lugar, como el hogar o la consulta del médico. Ello implica

también la necesidad de una cantidad de muestra para hacer el análisis relativa-

mente baja (de micro a nanolitros), lo que es muy importante si se trata de aná-

lisis de sangre o de ADN o si la muestra es cara o difícil de conseguir.

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Figura 3. Esquema delfuncionamiento de un

biosensor.

Son muchos los dispo-

sitivos biosensores que se

han desarrollado y muy va-

riados los mecanismos físi-

co-químicos de transduc-

ción que se han empleado

para traducir la interacción

biológica de la parte “bio”

en una señal cuantificable y

útil para el usuario. La cla-

sificación de los biosenso-

res viene impuesta tanto por la naturaleza de la biocapa receptora ele-

gida como por el tipo del transductor empleado. Para construir un

biosensor se pueden usar diferentes componentes. Como elementos

biológicos receptores se pueden emplear enzimas, anticuerpos, recepto-

res proteicos, secuencias de oligonucleótidos, fragmentos subcelulares

como mitocondrias, secciones de tejidos animales y vegetales, células

completas, etc. y como transductor dispositivos ópticos, electroquímicos y meca-

no-acústicos, principalmente. La combinación de las diversas capas receptoras con

los diferentes transductores ha dado lugar a una gran variedad de biosensores.

El término “nanobiosensor” designa a aquellos biosensores cuyas propie-

dades vienen moduladas por la escala nanotecnológica con la que están fabrica-

dos. Es de esperar que los nanobiosensores tengan una sensibilidad mucho más

alta que la de los dispositivos biosensores convencionales y además emplean

un menor cantidad de muestra. Por otra parte, podrían ser fácilmente introduci-

dos en el interior del cuerpo humano, por lo que proporcionarían datos mucho

más fiables del estado de salud de un paciente. Dentro de los incipientes desa-

rrollos de nanobiosensores son de destacar los nanobiosensores fotónicos, los

basados en nanopartículas de oro o magnéticas, los nanobiosensores basados en

nanotubos de carbono o los biosensores nanomecánicos, que han surgido como

reemplazo de los biochips de ADN, entre los más importantes (ver Fig. 4).

Biosensores basados en nanopartículas

Existen ya numerosos trabajos científicos que han demostrado la posibili-

dad de detectar la aparición de las primeras células cancerosas utilizando dife-

108



Figura 4. Algunos ejemplosde nanobiosensores que sepueden emplear para eldiagnóstico precoz deenfermedades de unaforma selectiva y con unalto nivel de sensibilidad.

rentes tipos de nanopartículas.

Una de las más utilizadas son

las llamadas puntos cuánticos

(“Quantum Dots”), así denomi-

nadas porque su tamaño nano-

métrico provoca un efecto de

confinamiento cuántico en su

estructura (ver Figura 5). Los

puntos cuánticos están fabrica-

dos de material semiconductor

y contienen sólo unos cientos

de átomos. Cuando son excita-

dos emiten luz en diferentes

longitudes de onda dependiendo de su tamaño, por lo que son extre-

madamente útiles como marcadores biológicos. Los puntos cuánticos

más empleados son los de CdSe, ya que son fáciles de fabricar con el

tamaño deseado mediante procesos químicos, se pueden producir en

gran variedad de colores, tienen una emisión excelente (mejor que los

marcadores fluorescentes habitualmente usados en biología), y no se

desestabilizan ya que son fotoestables. La emisión de fluorescencia

de estos puntos cuánticos es tan brillante que incluso es posible ob-

servar una célula que contenga una única de estas nanopartículas.

Hoy en día los puntos cuánticos son comerciales y se ha demostra-

do ampliamente su utilidad para la localización de tumores en los pri-

meros estadios, lo cual significa que se podría proceder a su extirpación inmediata.

Pero los puntos cuánticos no funcionan por sí mismos, es preciso indicar-

les cómo localizar el tumor y para ello hay que recubrir la superficie del punto

cuántico con moléculas biológicas (biorreceptores) con afinidad hacia un com-

puesto específico de la célula cancerosa. Por ejemplo, hay ciertas proteínas o

moléculas que se encuentran en mayor proporción en la superficie de las célu-

las cancerosas (como los receptores de ácido fólico o la hormona luteinizante)

y ésto va asociado con cada tipo de cáncer en particular. Cuando los puntos

cuánticos recubiertos con el biorreceptor se acercan a una muestra que contiene

dicha proteína, ambos se unen. Ahora se puede detectar la interacción ilumi-

nando los nanocristales con luz ultravioleta y observando su emisión caracterís-

tica. Hay ya numerosos ejemplos de como los puntos cuánticos localizan célu-

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Figura 5. Nanopartículascon diferentes propiedades

de emisión según sutamaño utilizadas en

nanodiagnóstico. Puedeobservarse el detalle de

una nanopartícula obtenidomediante microscopia

electrónica (Foto cortesiadel Prof. L.Liz-Marzán,

Univ. Vigo).

las tumorales, como en el caso

del cáncer de mama y de gan-

glios linfáticos cancerosos. Has-

ta ahora, los experimentos se

han realizado con animales, pe-

ro se preve que una vez autori-

zado por las agencias de salud

correspondientes, estos ensayos

puedan realizarse en seres hu-

manos. La Figura 6 muestra un

ejemplo de tal localización.

Al igual que los puntos

cuánticos, muchos otros tipos de

nanopartículas pueden usarse pa-

ra la localización de tumores, por

ejemplo nanopartículas metálicas

o magnéticas. El paso primordial

es disponer del biorreceptor ade-

cuado a la enfermedad que se

pretende detectar y, sobre todo,

ser capaces de recubrir adecuadamente estas nanopartículas con dicho

receptor que permita la localización de las células tumorales.

Además de para realizar un diagnóstico, las nanopartículas tam-

bién pueden usarse como método terapéutico. Así, una vez que las

nanopartículas se unen a las células cancerosas, se puede inducir un

calentamiento de las mismas mediante un campo magnético de baja

intensidad. El calentamiento provoca la destrucción de las células tu-

morales pero sin causar ningún daño a las células o tejidos sanos

circundantes. Esta tecnología para el tratamiento del cáncer evitaría

los graves problemas de efectos secundarios de los actuales trata-

mientos de quimio o radioterapia.

Biosensores plasmónicos

El biosensor óptico más conocido es el Biosensor de Resonancia de Plas-

món Superficial (SPR), basado en la variación de reflectividad de una capa me-

110



Figura 6. Funcionalizaciónde puntos cuánticos deCdSe con biomarcadoresespecíficos a tumor depróstata e inyecciónde los mismos parala localización precozde las primeras célulascancerosas (comparaciónentre un ratón enfermoy sano).

tálica en contacto con un

medio biológico. El bio-

sensor SPR ha sido am-

pliamente desarrollado,

cientos de publicaciones

aparecen cada año en la

literatura especializada y

numerosas compañias lo

comercializan en diferen-

tes versiones. Este sensor permite detectar de forma directa concen-

traciones en el rango nanomolar (o cambios de 10-5 en el índice de

refracción, o lo que es lo mismo 1pg/mm2 depositado en la superfi-

cie del sensor).

En el sensor de resonancia de plasmón se deposita una capa

metálica delgada (generalmente una capa de oro de 50 nm de espe-

sor) sobre una cristal. Excitando esta superficie en condiciones de reflexión in-

terna total se obtiene una resonancia para un cierto ángulo de incidencia de la

luz, resonancia que se manifiesta en una absorción de la luz y, por tanto, un

mínimo agudo en la intensidad de la luz reflejada. La característica más intere-

sante de este efecto es que el ángulo de resonancia es muy sensible a cualquier

variación que tenga lugar en la superficie metálica, como puede ser una inmu-

norreación o cualquier otro tipo de interacción biomolecular. La interacción

biomolecular se detecta entonces como una variación del ángulo de resonancia.

En la Fig. 7 se muestra el esquema de un sensor de SPR y su mecanismo de

funcionamiento.

Especial mención merece el biosensor de SPR comercializado por Biacore

bajo diferentes modelos, que domina desde hace años el mercado de los bio-

sensores ópticos. Su única desventaja es su elevado precio y su sofisticada ins-

trumentación.

Biosensores nanofotónicos

Los biosensores nanofotónicos han demostrado un nivel de sensibilidad

extremo para la detección directa de proteínas y ADN. En estos sensores (tam-

bién llamados de onda evanescente) se hace uso de la forma particular en que

se transmite la luz en el interior de los circuitos ópticos: esta transmisión tiene

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Figura 7. (Izda.) Esquemade funcionamiento de unbiosensor de Resonancia

de Plasmón Superficial.(Dcha.) Biosensor de SPRcomercial (SENSIA, S.L.).

lugar a lo largo de la guia óptica mediante multiples reflexiones internas. A ca-

da reflexión, una componente de la luz, denominada onda evanescente, se pro-

paga en el medio que envuelve a la guía. La longitud de penetración de la onda

evanescente es de unos cientos de nanometros y ofrece una oportunidad única

e ideal para medir cualquier interacción biomolecular que tenga lugar en su in-

terior. Con estos sensores es posible evaluar concentraciones de proteínas a ni-

vel picomolar o variaciones de una única base en el ADN en tan sólo unos mi-

nutos, necesitando volúmenes de muestra del orden de los microlitros y, en

algunas ocasiones, las muestras a analizar (orina, suero) no necesitan ni tan si-

quiera ser pretratadas.

Los nanosensores fotónicos también permiten la medida en el interior de

una única célula de su estado metabolico. Para este fin existen nanosensores

que consisten en una fibra óptica muy afilada (su extremo final tiene solo 30-

50 nm) lo que le permite penetrar a través de la membrana celular sin causar

ningún daño y sin alterar el funcionamiento normal de la célula. La fibra óptica

se biofuncionaliza con receptores específicos antes de su introducción. Una vez

dentro, la nanosonda puede detectar especies químicas y señalizar procesos

moleculares en localizaciones especificas del interior de la célula. La detección

se realiza a través de la interacción del campo evanescente de la luz que circu-

la por la fibra óptica con la interacción biomolecular, debida al biorreceptor es-

pecífico anclado en la superficie del extremo final de la fibra. Con esta técnica

se abre la posibilidad de identificar cambios patológicos dentro de una célula

individual e incrementar nuestro conocimiento sobre las funciones celulares in

vivo como la división celular, la apoptosis, funcionamiento de las nanomáqui-

nas biológicas, etc....

Biosensores nanomecánicos

Otro tipo de nanobiosensor con grandes perspectivas en nanodiagnóstico

son los biosensores nanomecánicos, que emplean como sistema de transduc-

ción la deflexión nanométrica de una micropalanca o el desplazamiento de su

frecuencia de resonancia al interaccionar con el sistema biológico. El cambio

en la posición y movimiento de la micropalanca inducido por el reconoci-

miento molecular ocurre a escala de unos pocos nanometros y de aquí deriva

el nombre de biosensores “nanomecánicos”. La Figura 8 muestra las imáge-

nes de algunos de estos sensores. Las micropalancas tienen un área sensora

112



muy pequeña (del or-

den de 1000 µm2) lo

cual permite el análi-

sis de cantidades de

sustancia inferiores al

femtomol. Además, se

fabrican con tecnolo-

gía microelectrónica

estándar, lo que pro-

porciona producción

en masa a bajo coste y

permite la fabricación

de miles de micropalancas en un mismo proceso, que podrían ser

empleadas para la detección simultanea de miles de analitos de la

misma muestra.

Sistemas “laboratorio-en-un-chip”

Desarrollos como los nanosensores fotónicos o los nanomecáni-

cos, fabricados a miles gracias a la tecnología microelectrónica,

abren un camino para la fabricación de nanobiochips genómicos y

proteómicos, que a diferencia de los actuales biochips, llevan incor-

porado un sistema de transducción de la interacción (no se necesita-

rían marcadores fluorescentes) con los que sería posible conseguir

en muy poco tiempo una inmensa cantidad de información genética

y proteómica, lo que permitirá elaborar vacunas, identificar mutacio-

nes indicativas de enfermedades, identificar nuevos fármacos, identi-

ficar patógenos, etc...de forma mucho más rápida que utilizando las

tecnologías convencionales.

Pero, a pesar de estos incipientes desarrollos, todavía queda

mucho camino por recorrer y, cara al futuro, sería deseable contar con nano-

biosensores que cumplieran la mayoría de los siguientes requisitos: robusto,

barato, posibilidad de multianalito, detección a niveles de pico/femtomolar o

incluso a nivel de una sola molécula, rápidos y directos, portátiles, de fácil

manejo por parte de personal no especializado, de multiuso o suficientemente

barato para ser de un único uso. El trabajo futuro se encamina tanto al desa-

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Figura 8. Biosensoresnanomecánicos empleados

en nanodiagnóstico. Lasmicropalancas se doblanunos pocos nanómetroscuando tiene lugar una

reacción dereconocimiento molecular

en su superficie. Elnanobiosensor de matrices

de micropalancas puedeemplearse como biochip

de ADN o proteómicosegún la

biofuncionalizacion (Fotocortesia de los Drs. K.

Zinoviev, J.A. Plaza, C.Domínguez y L.M. Lechuga

del Centro Nacional deMicroelectrónica, CSIC).

rrollo de nuevas estrategias de inmovilización y de protección, para permitir

biosensores completamente reversibles y regenerables y que puedan funcio-

nar in situ en muestras complejas (como es la sangre) y que sean biocompati-

bles para ser implantados in vivo. La inclusión de los nanodispositivos en el

interior del cuerpo humano preservando su funcionalidad será un logro para-

digmático en nanodiagnóstico. Los nanobiosensores implantados podrían fun-

cionar como “centinelas” dentro del cuerpo humano y emitir una señal de

alarma ante la aparición de las primeras células enfermas. Ya se han obtenido

pequenos avances como pildoras con cámaras de imagen que pueden tragar-

se, sensores que pueden realizar medidas in vivo durante operaciones, etc.

Ésta será sin duda una de las grandes áreas de trabajo de la Nanomedicina en

los anos venideros (ver Figura 9).

La integración en sistemas “lab-on-a-chip” será otras de las áreas funda-

mentales de trabajo, que permitirá la descentralización de las medidas. El tér-

mino “lab-on-a-chip” (o “laboratorio en un chip”) describe el desarrollo de

plataformas integradas y miniaturizadas donde tienen lugar com-

plejas reacciones químicas y bioquímicas. Estas plataformas se es-

tán constituyendo como una tecnología revolucionaria en el sector

clínico. Las micro y nanotecnologías han proporcionado las herra-

mientas necesarias para llevar a cabo esta innovación en el diag-

nóstico molecular, al permitir la fabricación e integración de mi-

cro/nanobiosensores, microcanales, microactuadores, etc. en un

mismo chip micro-

electrónico. El uso

de estos dispositi-

vos aporta las ven-

tajas de rapidez en

el análisis, reduci-

dos volúmenes de

muestra, alto grado

de automatización

y su carácter portá-

til y desechable.

Un simple mi-

crosistema con na-

nosensores incor-

114



Figura 9. Futuro de lautilización denanobiosensores comosistemas denanodiagnóstico(Adaptado de GeneralElectric).

porados podría ofrecer un diagnóstico completo a partir de una gota de san-

gre mediante la identificación (de otra manera imperceptible) de cambios

moleculares. Esto implica que los análisis podrían hacerse a domicilio. Cuan-

do se empiecen a reemplazar los caros y lentos análisis de laboratorio por es-

tos análisis de microchips más baratos, rápidos y cómodos, el impacto en or-

ganizaciones sanitarias y sus pacientes será tremendo. De momento, todavía

no se cuenta con ningún desarrollo de microsistema biosensor que haya lle-

gado al mercado, pero numerosos laboratorios a nivel internacional trabajan

en esta dirección.

Liberación controlada de fármacos

La segunda gran área de actuación de la Nanomedicina es el desarrollo de

sistemas de liberación controlada de fármacos. Estos sistemas tienen como mi-

sión transportar el fármaco hasta el lugar donde debe ser liberado. Además, los

fármacos necesitan ser protegidos durante su tránsito por el cuerpo hasta llegar

al lugar afectado, tanto para mantener intactas sus propiedades físico-químicas

como para proteger a las otras partes del cuerpo por las que viaja de

sus efectos adversos. Una vez que el fármaco llega a su destino, ne-

cesita liberarse a una velocidad apropiada para que sea efectivo. Este

proceso no siempre es óptimo con las medicinas actuales, por lo que

la Nanomedicina está ofreciendo métodos para mejorar tanto las ca-

racterísticas de difusión del fárma-

co como las de degradación del

material encapsulante, permitiendo

que el fármaco se transporte de for-

ma mucho más eficaz y que su li-

beración sea igualmente más con-

trolada. Para la administración de

fármacos pueden emplearse diver-

sos tipos de nanoestructuras. Entre

ellas cabe destacar la utilización de

nanopartículas, nanocápsulas, den-

drímeros, liposomas, micelas, nano-

tubos, conjugados poliméricos, etc.

(ver Figura 10).

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Figura 10. Diferentes tiposde nanosistemas quepueden emplearse en ladosificación de fármacos.

Nanomedicina regenerativa

La Nanomedicina regenerativa es la tercera gran área de la Nanomedicina

y es una de las áreas más emergentes. La Medicina regenerativa intenta la re-

paración o reemplazamiento de tejidos y órganos enfermos o dañados mediante

la aplicación de métodos procedentes de terapia génica, terapia celular, dosifi-

cación de sustancias biorregenerativas e ingeniería tisular, estimulando los pro-

pios mecanismos reparadores del cuerpo humano.

La ingeniera tisular intenta generar tejidos in vivo o in vitro, para lo cual ne-

cesita materiales biocompatibles que mimetizen respuestas celulares específicas a

nivel molecular. Gracias al desarrollo de las nanotecnologías, los materiales tie-

nen el potencial de interaccionar con componentes celulares, dirigir la prolifera-

ción y diferenciación celular y la producción y organización de la matriz extrace-

lular. Entre los materiales que se están utilizando cabe destacar los nanotubos de

carbono, nanopartículas como nanohidroxiapatita o nanozirconía, nanofibras de

polímeros biodegradables, nanocomposites, etc. También se pueden utilizar su-

perficies con nanoestructuración nanométrica que actúen como incubadoras de lí-

neas celulares y que favorecen el proceso de diferenciación celular.

Gracias a la Nanomedicina, las células madre pluripotenciales y los facto-

res de señalización serán componentes esenciales de implantes inteligentes y

multifuncionales que podrán reaccionar en función del microambiente que le

rodee y facilitar entonces la regeneración del tejido dañado de forma especifica

y en el mismo lugar.

Es de prever también que se puedan desarrollar nanoestructuras artificiales

que puedan detectar y reparar daños en el organismo, de la misma forma que

las nanoestructuras naturales lo hacen (por ejemplo los linfocitos de la sangre).

Así, se ha propuesto de forma teórica la fabricación de unas nanoestructuras

para sustituir la hemoglobina, denominadas “respirocitos”. Los respirocitos son

células rojas nanofabricadas con una enorme capacidad para transportar oxíge-

no y que pueden permitir pasar varias horas bajo el agua sin respirar. Según los

cálculos de su creador, con una inyección de respirocitos podríamos vivir con

el corazón parado durante 4 horas o bucear durante 2,5 horas. Otros interesan-

tes desarrollos incluyen motores biomoleculares, interruptores moleculares o

nanoagujas que penetren en el nucleo de células vivas con un alto grado de

precisión para realizar cirugia celular.

116



CONCLUSIONES

La Nanobiotecnología es un área multidisciplinar que puede conllevar

grandes avances diagnósticos y terapéuticos proporcionando nuevos métodos

de diagnóstico más efectivos, mejores sistemas para la administración de fár-

macos y nanoherramientas para la monitorización in situ de parámetros bioló-

gicos y reparación celular. Las nanoterapias, bien mediante la destrucción se-

lectiva de células dañadas o infectadas o bien mediante la liberación controlada

de fármacos en el lugar indicado, se perfilan como uno de los grandes avances

a lograr para mejorar la calidad de vida de nuestra sociedad.

El futuro nos deparara microchips implantables que administrarán los fár-

macos en dosis preprogramadas, fármacos que habrán sido elegidos “a la carta”

según el perfil genético de cada individuo gracias al uso de micro/nanochips de

ADN y que trasmitirán sus datos al hospital para tener controlado al paciente

mientras éste hace su vida normal. Ya existen chips subcutáneos para medir de

forma continua parámetros cruciales como el pulso, la temperatura y la gluco-

sa, microsensores ópticos que se implantan en los tejidos subdérmicos para me-

dir la circulación en los tejidos después de una operación o sensores MEMS

que miden la presión, aceleración, velocidad y parámetros relacionados en pul-

mones paralizados y que ayudan en el diseño de pulmones artificiales. Ya se

están fabricando dispositivos “laboratorio-en-un-chip” y se están realizando en-

sayos clínicos para liberación de fármacos con productos nanotecnológicos. Sin

embargo, los largos procesos de aprobación en los sectores médicos y farma-

céuticos pueden significar que los beneficios para la salud solo podrán apre-

ciarse dentro de muchos años. Aunque quedan muchos problemas por superar,

no hay duda de que la Nanobiotecnología nos deparará grandes avances que re-

dundarán en una mejora de la calidad de vida de nuestra envejecida sociedad y

que ayudará a vencer a las principales enfermedades (cáncer, desórdenes neu-

rodegenerativos y enfermedades cardiovasculares) de nuestro entorno.

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cology and basis research through the directed application of nanotechnology NCI,

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Vectores de transferencia en terapia génica

INTRODUCCIÓN

El concepto de terapia génica, definida como la introducción de material

genético en una célula con el propósito de aliviar o eliminar un proceso patoló-

gico, surgió a nivel ideológico a mediados de los años 60, incluso antes del de-

sarrollo de la tecnología del DNA recombinante. Su apoyo experimental co-

menzó en los 80 con la aparición de los vectores retrovirales. Las primeras

demostraciones in vitro de la potencialidad de esta nueva tecnología generaron

un optimismo desmesurado en la comunidad científica que ha provocado, a lo

largo de poco más de una década, el establecimiento de más de un millar de

ensayos clínicos. Sin embargo, la euforia inicial se ha traducido en prudencia e,

incluso en cierto escepticismo en algunos sectores, al no cumplirse las expecta-

tivas temporales de evolución y consecución de resultados. El fallecimiento de

un joven paciente implicado en uno de estos programas, junto con la aparición

inesperada de varios casos de leucemia inducida tras la integración del trans-

gen, ha provocado una dura crítica al desarrollo que se está produciendo en es-

te campo. En contraposición, comienzan a obtenerse las primeras evidencias de

éxito terapeútico, además de acumularse datos experimentales prometedores.

Por otra parte, la baja toxicidad de los tratamientos y las grandes posibilidades

VECTORES DE TRANSFERENCIAEN TERAPIA GÉNICAJesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones Oncólogicas



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aún por desarrollar, siguen justificando, e incitando, un continuo avance en este

apasionante campo de la investigación biotecnológica.

El cuello de botella del desarrollo de la terapia génica se encuentra en la

obtención de sistemas eficaces de transferencia génica. Hasta el momento,

existe una gran variedad de vectores que presentan diversas ventajas e inconve-

nientes, pero ninguno de ellos alcanza el nivel de calidad requerido para que la

terapia génica obtenga la madurez que le permita ser una alternativa real y

competitiva frente a las terapias tradicionales. La potencialidad sigue siendo

desmesurada. El conocimiento de la totalidad de nuestro material genético, co-

mo resultado de la finalización del proyecto Genoma Humano, abre unas ex-

pectativas ilimitadas. Por ello, necesitamos que los vehículos de transporte del

material genético se desarrollen suficientemente, de modo que permitan la uti-

lización de los genes como nuevos agentes farmacológicos y se posibilite su

explotación terapeútica.

El objetivo de este trabajo es dar una idea general del estado en el que se

encuentra actualmente el campo del diseño y desarrollo de vectores de transfe-

rencia génica con aplicación terapeútica. Antes de comenzar conviene recordar

que estamos tratando con un concepto terapeútico global, ya que cualquier cé-

lula puede ser el objetivo del tratamiento. Además, la aplicación terapeútica de

material genético es potencialmente ilimitada, puesto que va más allá de la re-

paración, sustitución o compensación de una alteración genética, permitiendo

su utilización como agente farmacológico per se, incorporando nuevas activi-

dades en el organismo que permitirían tanto tratamientos de patologías sin da-

ño genético (enfermedades infecciosas, por ejemplo) como tratamientos pre-

ventivos (vacunas de DNA). Por lo tanto, la diversidad de situaciones en las

que se podría aplicar, justifica el desarrollo de una amplia diversidad de vecto-

res (el tratamiento de cada patología puede requerir el diseño de un vector es-

pecífico). La obtención de un vector universal con aplicación generalizada es

una quimera, ya que diferentes enfermedades pueden tener requerimientos

opuestos. Sin embargo, sí se pueden definir las características de un "vector

ideal" y adaptarlas posteriormente a situaciones concretas:

1. Que sea reproducible.

2. Que sea estable.

3. Que permita la inserción de material genético sin restricción de tamaño.

4. Que alcance concentraciones elevadas (>108 partículas/ml).

5. Que permita la transducción de células tanto en división como quiescentes.

6. Que posibilite la integración específica del gen terapeútico.

7. Que reconozca y actúe sobre células específicas.

8. Que la expresión del gen terapeútico pueda ser regulada.

9. Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.

10. Que pueda ser caracterizado completamente.

11. Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios.

12. Que sea fácil de producir y almacenar y a un coste razonable.

Los vectores son sólo una parte, aunque fundamental, del sistema terapéu-

tico. El sistema en sí consta de dos componentes, el "vector" (vehículo de

transporte) y el "cargo" (material transportado). Éste, a su vez, se puede subdi-

vidir en otros dos componentes: el "efector" (gen a introducir) y el "soporte"

(los elementos que condicionan su expresión).

El cargo suele ser una estructura de tipo plasmídico (ADN bicatenario y

circular) aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un sim-

ple oligonucleótido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar una

cantidad elevada de material genético con capacidad de perpetuación en el

tiempo.

El efector que se utilice dependerá del efecto que se persiga. Si se preten-

de compensar, sustituir o reparar un gen dañado, el efector ha de ser una copia

del gen intacto o un elemento que posibilite su reparación. Si se pretende indu-

cir un efecto biológico concreto (eliminar específicamente un tipo de células,

bloquear la expresión de un virus, inducir una respuesta inmune...), se pueden

introducir genes naturales que potencien dicho efecto o genes que originen

nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido. Es el caso, por ejemplo,

de los genes suicida, que expresan enzimas procesadoras de pro-drogas, capa-

ces de convertir un sustrato inocuo (pro-droga) en una potente droga citotóxica.

El sistema más utilizado es el del gen de la timidina quinasa del virus Herpes

Simplex (HSV), que transforma el glanciclovir en su derivado tóxico, glanci-

clovir trifosfato. El producto tóxico es capaz de afectar, además, a las células

adyacentes no transducidas, aumentando su eficacia por el denominado efecto

"bystander".

El soporte es la base para el control de la expresión del transgén e incluye

distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el pro-

motor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de trans-

cripción. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulación de la ex-

presión génica. Así, se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o

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promotores específicos, que sólo son activos en un tipo celular concre-

to. De la misma manera, se pueden emplear promotores inducibles, que

requieren la presencia de un elemento concreto para ejercer su función.

Éste puede ser un agente de adicción exógena (control externo) o un agente de-

terminado por características fisiológicas especiales (por ejemplo, los promoto-

res sensibles a situaciones de hipoxia). Existen otros elementos del soporte de

diversa importancia, dependiendo de la funcionalidad perseguida. Entre ellos se

encuentran potenciadores y represores de los promotores, secuencias de aisla-

miento ("insulators") que impiden las influencias de secuencias reguladoras

próximas, secuencias de integración (para permitir la inclusión del material

exógeno dentro del genoma de la célula hospedadora), secuencias de recombi-

nación homóloga (para permitir el intercambio de material genético con el ge-

noma hospedador en una región específica), secuencias de empaquetamiento

(para introducir el material genético en el interior de un vector viral), o secuen-

cias inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metila-

das, que sirven como coadjuvantes en las vacunas de ADN).

Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material ge-

nético transportado y de vencer todas las barreras biológicas hasta alcanzar su

destino final, el núcleo de la célula diana, donde tiene lugar la regulación géni-

ca. También de ellos va a depender la vía de administración a utilizar. En la Fi-

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Figura 1. Puntos clavepar regular la eficaciade un vectorde transferencia génica.

gura 1 se esquematizan las barreras más importantes que el vector ha

de solventar en su camino hacia su destino funcional. Entre ellas se in-

cluyen la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su eliminación y de-

gradación), el reconocimiento de la célula diana (generalmente mediante un re-

ceptor específico), su unión a la membrana, su internalización en la célula

(normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como la endocito-

sis), el escape de los sistemas de degradación intracelular (lisosomas) y su en-

trada final al núcleo, donde debe desmantelarse para permitir que el material

genético que transporta gane acceso a su ubicación final y a la maquinaria de

transcripción.

Existen dos grandes grupos de vectores: virales y no-virales (Figura 2).

Los primeros incluyen todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus,

tratando de eliminar sus características patológicas y de adaptarlos a su nueva

función como transportadores de material genético heterólogo. Pretenden apro-

vechar la ventaja que aportan los virus como vectores naturales, que han sufri-

do procesos de evolución complejos a lo largo de millones de años para opti-

mizar su función de introductores de material genético en las células que

invaden. Los vectores no-virales siguen una estrategia opuesta, de síntesis en

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Figura 2. Tipo de vectoresy proceso esquematizado

de obtención.

lugar de modificación. Parten de estructuras sencillas, conocidas, e intentan re-

construir desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el

transporte efectivo de genes en el interior de una célula. Como resulta obvio,

las opciones son muy diversas, aunque todas ellas tienen en consideración pun-

tos equivalentes, que han de resolver, en el intento de incorporar todos los ele-

mentos necesarios para la construcción de un sistema de transferencia efectivo.

Ambas estrategias tienen ventajas y desventajas que analizaremos a continua-

ción. Existen también algunos casos de vectores biológicos no virales (bacte-

rianos) como portadores de genes terapéuticos, alguno de ellos incluso en ensa-

yos clínicos (para más información, visitar la base de datos de ensayos clínicos

en terapia génica que facilita el portal de la revista Journal of Gene Medicine:

http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/), pero no van a ser analizados en este

documento.

VECTORES VIRALES

Los vectores de tipo viral son actualmente los más efectivos, fueron los

primeros en utilizarse en ensayos clínicos a comienzos de 1990 y continúan

siendo los más utilizados en dichos ensayos. Los virus son, de hecho, sistemas

naturales de transferencia genética. Para modificar un virus y transformarlo en

un vector con potencialidad terapéutica, el primer paso es bloquear su capaci-

dad de propagación eliminando los genes responsables de su replicación. Nor-

malmente, se suelen establecer líneas celulares que incorporan parte del geno-

ma vírico y que permiten completar el ciclo reproductivo del virus, cuando son

transfectadas con plásmidos que introducen el material genómico complemen-

tario. Estas líneas celulares se denominan "empaquetadoras" y son las herra-

mientas de producción de los vectores virales. El segundo paso en el proceso

de obtención de un vector viral es la eliminación de parte del genoma viral pa-

ra crear espacio donde introducir el material terapeútico (gen o genes, más los

elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales y, espe-

cialmente, aquellos que puedan resultar tóxicos o perjudiciales para la célula a

tratar.

En general, los vectores virales presentan como ventaja su gran eficacia de

transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgén en el

genoma de la célula huésped. Sin embargo, arrastran importantes limitaciones

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que incluyen su falta de especificidad celular en la mayoría de los casos, la li-

mitación del tamaño en el material genético a incorporar, debido a que han de

empaquetarlo en la cápsida, su elevada inmunogenicidad y, sobre todo, el ries-

go biológico que conllevan (reconstitución de partículas replicativas por re-

combinación genética y oncogenicidad inducida por integración inespecífica).

De hecho, esto es lo que ha ocurrido en un reciente ensayo clínico, por otra

parte exitoso, de terapia compensatoria en una inmunodeficiencia congénita

tratada con vectores retrovirales portadores de una copia "sana" del gen daña-

do. En este ensayo, la inserción del transgén en el genoma del paciente generó,

en un par de casos, el desarrollo de una leucemia producida por su integración

cerca del oncogén LMO2, provocando su activación.

La lista de vectores virales es cada día más amplia. Aquí solo se muestran

algunos de los más representativos, y que están siendo utilizados en ensayos

clínicos.

Vectores retrovirales

Los retrovirus son virus RNA con envuelta y fueron elegidos inicialmente

como prometedores vehículos de transferencia génica debido a su elevada efi-

cacia de transducción en un gran número de tipos celulares, a que son capaces

de integrarse de forma estable en el genoma de la célula que infectan, sin ex-

presar ninguna proteína viral inmunogénica, y a que son relativamente poco

patogénicos, con populares excepciones como el virus del SIDA (HIV, Human

Immunodeficiency Virus). La mayoría de ellos derivan del virus de la leucemia

murina (MuLV). El virus parental posee tres genes, gag, pol y env, que codifi-

can proteínas responsables de la replicación, encapsidación, transcripción re-

versa e infección. Estos tres genes pueden ser utilizados en trans (facilitados

por las células empaquetadoras), permitiendo la generación de vectores que li-

mitan el genoma retroviral a la señal de empaquetamiento y las secuencias ter-

minales necesarias para la integración (LTRs, Long Terminal Repeats). De esta

forma se minimiza el componente genómico viral y se maximiza la capacidad

de incorporación de material genético heterólogo, aunque el límite sigue siendo

discreto, unas 7-8 kilobases (kb).

Su mayor limitación reside en el hecho de que sólo son capaces de trans-

ducir eficazmente células en división, ya que el acceso al núcleo del complejo

de preintegración requiere la ruptura de la membrana nuclear. Ésto inicialmente

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ha sido utilizado como una ventaja para el tratamiento de patologías oncológi-

cas, generando un cierto grado de especificidad debido al elevado nivel de pro-

liferación de las células transformadas. Sin embargo, limita grandemente su

utilización en sistemas tan atractivos como las células progenitoras, normal-

mente en estado quiescente. La utilización de vectores derivados de otro tipo

de retrovirus, los lentivirus (HIV, SIV...), que sí son capaces de infectar e inte-

grarse en células quiescentes, abre nuevas posibilidades a estos vectores, aun-

que los riesgos inherentes al uso de los mismos han retrasado su utilización en

ensayos clínicos, habiéndose iniciado recientemente.

Un segundo tipo de inconvenientes reside en la poca estabilidad de las

partículas y su baja tasa relativa de producción. Esto ha sido parcialmente re-

suelto mediante la sustitución de la proteína de la envuelta por la glicoproteína

G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la obtención de títulos de

hasta 109 p.i./ml y estabiliza las partículas. Además, la utilización de células

empaquetadoras de origen humano produce vectores resistentes a la inactiva-

ción por complemento.

Finalmente, la carencia de especificidad celular inherente a estos virus

(poseen un rango de infectividad muy amplio) está tratando de resolverse me-

diante la utilización de vectores que poseen proteínas quiméricas en la envuel-

ta. Estas incorporan ligandos heterólogos o anticuerpos monocatenarios que ge-

neran nuevas especificidades y permiten transducir selectivamente una

población celular.

Vectores adenovirales

Los adenovirus son virus DNA sin envuelta con un genoma bicatenario de

hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtención de vec-

tores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar tumo-

res en animales. Pueden transducir un número bastante amplio de tipos celula-

res distintos, tanto células en división como post-mitóticas, con una eficacia

muy elevada. Sin embargo el genoma viral se mantiene episómico, lo que per-

mite solo una expresión genética transitoria.

La primera generación de vectores adenovirales se obtuvo mediante delec-

ción de la región E1, que bloqueaba su capacidad replicativa y la E3, aparente-

mente no esencial. Sin embargo, posteriormente se demostró que la presencia

de E3 incrementaba significativamente la expresión del transgen y disminuía la

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respuesta inmune, por lo que volvió a introducirse en la segunda generación de

vectores a expensas de otras regiones como la E4 o la E2A. En ambos casos, la

capacidad del vector para acomodar genes terapéuticos no sobrepasaba los 7-8

kb, muy por debajo de la capacidad teórica de las partículas originales. Recien-

temente, se ha conseguido eliminar la mayoría del genoma viral manteniendo

sólo las señales de empaquetamiento y las secuencias terminales (ITRs, Inver-

ted Terminal Repeats), rindiendo vectores con gran capacidad incorporadora

(hasta 35 kb) que se han denominado "vectores sin tripas" (gutless).

La eliminación de material genómico viral no sólo aumenta la capacidad

del vector, sino que disminuye también el riesgo de inducción de respuesta in-

mune. De hecho, éste es uno de los problemas más graves de estos vectores, y

ha sido la causa del fallecimiento accidental mencionado anteriormente. La

mayoría de la población humana ha sido infectada en algún momento con ade-

novirus y presenta una respuesta inmunitaria inicial. Existen estrategias inmu-

nosupresoras transitorias y se están tratando de desarrollar vectores adenovira-

les de origen animal (canino, bovino u ovino). Sin embargo, el problema se

mantiene sin resolver de una forma satisfactoria y el uso de vectores adenovi-

rales se reduce a aplicaciones unitarias.

Una de las mayores ventajas de estos vectores radica en su alta productivi-

dad, con títulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten

ser concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml. Esto,

junto con la posibilidad de transducir células quiescentes, les ha hecho muy

atractivos para la comunidad científica y son el segundo tipo de vectores en

frecuencia de utilización en ensayos clínicos.

Su falta de especificidad celular también ha sido compensada por el desa-

rrollo de estrategias de redireccionalidad: quimeras que introducen ligandos es-

pecíficos en proteínas de la cápsida y moléculas biespecíficas que reconocen

tanto la cápsida viral como el receptor seleccionado, para conferir un nuevo

tropismo celular.

Vectores basados en virus adenoasociados

Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patológicos. Son pe-

queños virus sin envuelta con un genoma de DNA monocatenario, capaces de

infectar un gran número de células de origen diverso, tanto en división como

en su estado quiescente. A diferencia de los adenovirus, pueden integrarse en la

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célula huésped en una ubicación específica (el brazo q del cromosoma 19) eli-

minando la posibilidad de mutagénesis insercional. Otra ventaja adicional es la

carencia de respuesta inmune observada in vivo.

Sus mayores limitaciones se centran en su reducida capacidad de transpor-

te (unos 4.5 kb) y en su tediosa producción, que requiere la presencia de virus

de apoyo (adenovirus o herpesvirus), dificiles de eliminar completamente. Una

complicación adicional surgió al comprobar que la eliminación de parte del ge-

noma viral para permitir la introducción del transgén se tradujo en la pérdida

de la capacidad de integración específica. Reciéntemente se ha descubierto que

la proteina Rep78, en presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integra-

ción específica en el genoma celular y podría ser la clave que solucionara este

problema.

Finalmente, como hemos visto en los vectores anteriores, la falta de espe-

cificidad celular ha sido también tratada empleando la estrategia de moléculas

biespecíficas.

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Tabla 1.V. Retrovirales V. Adenovirales V. Adenoasociados

Características

Soporte génico RNA lineal DNA lineal DNA lineal

bicatenario bicatenario monocatenario

Capacidad transportadora 7-8 kb Hasta 35 kb 4.5 kb

(gutless)

Inmunogenicidad Baja Elevada Baja

Eficacia de transfección Elevada Elevada Elevada

Dependencia del estado Sí No No

de división celular (excepto lentivirus)

Integración del transgén Sí, aleatoria No Sí, específica

Estabilidad Baja Elevada Elevada

Especificidad Baja Baja Baja

Otras Riesgo biológico Limitado Elaboración

(infect., mutag. a aplicaciones tediosa

insercional) reducidas

Vectores virales quiméricos

Una opción interesante, que cada día se está explotando con mas fre-

cuencia, es la combinación de varios vectores para compensar las limitacio-

nes que presentan cada uno por separado, a la vez que se aprovechan las ven-

tajas más destacables que aportan individualmente. Existen diversas

estrategias experimentales de estas quimeras, pero sólo voy a mencionar, a tí-

tulo de ejemplo, la quimera adenovirus-retrovirus. Consiste en la utilización

simultánea de dos tipos de vectores adenovirales: uno que incorpora la ma-

quinaria de empaquetamiento retroviral (gag, pol y env) y otro que introduce

el material genético equivalente a un vector retroviral (LTRs, señal de empa-

quetamiento y material terapéutico). Se aprovecha la elevada eficacia de

transducción de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos vec-

tores, transformando las células dianas en células productoras de vectores re-

trovirales. Los vectores así generados son capaces de infectar las células ve-

cinas e integrarse en su genoma.

VECTORES NO-VIRALES

El concepto general aplicado al desarrollo de este tipo de vectores se ase-

meja más al de los productos farmacéuticos tradicionales. Se pretende mimeti-

zar el proceso natural de introducción de material genético en una célula hués-

ped, utilizando material sintético y, por lo tanto, conocido y controlable. La

eficacia de estas nuevas "medicinas génicas" depende de dos niveles de actua-

ción, el sistema de introducción de los genes (el vector propiamente dicho) y el

sistema de regulación de su expresión (el soporte). Ambos son fundamentales y

complementarios, pero aquí sólo vamos a tratar el primero de ellos.

Los vectores no-virales presentan, en general, una eficacia inferior a la de

sus oponentes (no es fácil competir con sistemas desarrollados por la naturale-

za). Algunas características virales, como la capacidad de integración en el ge-

noma huésped, están en proceso de desarrollo. Actualmente se está trabajando

en el empleo de transposones como "Sleepy Beauty", capaz de insertar transge-

nes en cromosomas de mamíferos. La explotación de estrategias alternativas,

que no requieren la integración del transgén, para asegurar un efecto terapeúti-

co estable, también favorece el desarrollo de estos vectores. Es el caso de los

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métodos de inducción de reparación de DNA in situ, como la "quimeraplastia",

aunque su eficacia no está claramente establecida.

En cuanto a sus ventajas, destacan su facilidad de manipulación, mayor

estabilidad, bioseguridad, gran capacidad transportadora, menor inmunogenici-

dad y especificidad celular, en algunos casos. Los tipos de vectores son muy

variados, pero pueden agruparse en categorías, que veremos a continuación.

Métodos físicos

Se basan en la introducción de DNA en la célula mediante la aplicación de

un sistema mecánico o eléctrico. Alguno de ellos está siendo utilizado en ensayos

clínicos, aunque presentan claras limitaciones, principalmente por su aplicación

local y el número reducido de células que afectan. En esta categoría se encuen-

tran la microinyección (introducción de DNA en el núcleo celular mediante el

uso de una microaguja), bombardeo de partículas, popularmente conocido como

la "pistola génica" (proyección de micropartículas metálicas recubiertas de DNA

mediante un sistema balístico impulsado por gas), electroporación de bajo voltaje

(permeabilización transitoria de la membrana celular por aplicación de pulsos

eléctricos de alta frecuencia y bajo voltaje) e inyección intersticial de DNA des-

nudo. Este último método ha resultado especialmente efectivo en músculo.

Liposomas catiónicos (Lipoplexes)

Buscando la similitud con otras formulaciones farmacéuticas, y tratando de

aprovechar la experiencia acumulada en sistemas particulados de encapsulación de

pequeños fármacos en vesículas lipídicas, se trató de aplicar la tecnología de los lipo-

somas al transporte de ácidos nucleicos. Aunque inicialmente se intentó encapsular el

DNA en el interior de liposomas, el rendimiento fue pobre y la eficacia se incremen-

tó considerablemente al cambiar los liposomas tradicionales por otros basados en lí-

pidos catiónicos. A diferencia de aquéllos, el DNA interacciona con los grupos catió-

nicos de la superficie lamelar y no se incluyen en el interior vesicular. El éxito de

este tipo de estrategias ha sido claro desde el principio y actualmente da cuenta del

mayor número de protocolos en ensayo clínico dentro de los vectores no virales.

Existe un número bastante elevado de estos lípidos tanto en explotación co-

mo agentes de transfección como en desarrollo para su utilización como vectores

de transferencia en terapia génica. Entre los más populares se encuentran DOT-

130



MA (Lipofectin), DOTAP, DMRIE, DOGS (Transfectam), DOSPA (LipofectAMI-

NA) y DC-Colesterol. Presentan niveles de eficacia aceptablemente altos, una in-

munogenicidad casi nula, una capacidad de transporte de DNA sin restricción de

tamaño, gran estabilidad de almacenaje y sencillez de uso. Sin embargo, son difí-

ciles de caracterizar estructuralmente y no presentan especificidad celular, aunque

ambos puntos están en desarrollo.

Los lípidos catiónicos utilizados están formados por estructuras anfifílicas,

compuestas de un dominio hidrofóbico y una cabeza polar. La naturaleza de es-

ta última es la que marca la diferencia entre ellos. Los grupos catiónicos más

frecuentes son aminas cuaternarias y poliaminas (espermina, espermidina, polili-

sina...). Su eficacia de transfección depende, en la mayoría de los casos, de la

presencia de un lípido neutro adicional, DOPE, que actúa como "lípido de apo-

yo", posibilitando la fusogenicidad del liposoma y la entrada del DNA en el ci-

tosol. La compactación del DNA con policationes, especialmente protamina, an-

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Tabla 2.M. Físicos Lipoplexes Poliplexes Peptiplexes

Características

Soporte génico Cualquiera Cualquiera Cualquiera Cualquiera

Capacidad transportadora Ilimitada Ilimitada Ilimitada Ilimitada

Inmunogenicidad Muy baja Muy baja Baja (en Baja (en

algunos casos) algunos casos)

Eficacia de transfección Elevada, pero Media Media Media

muy localizada

Dependencia del estado Relativa Relativa Relativa Relativa

de división celular

Integración del transgén No No No No

Estabilidad Elevada Elevada Elevada Elevada

Especificidad Elevada Baja (con Elevada, en Elevada, en

(aplicación local) excepciones) algunos casos algunos casos

Otras Aplicación Experiencia Económicos, Versátiles,

bastante limitada farmacológica rel. controlables biodegradables

tes de la adicción del liposoma ha supuesto un incremento importante en la

efectividad del sistema. Otras modificaciones interesantes incluyen la utilización

adicional de lípidos aniónicos, que activan su capacidad fusogénica en el micro-

ambiente ácido del endosoma, la inclusión de ligandos o de anticuerpos para ge-

nerar especificidad celular y la optimización de formulaciones que eviten su op-

sonización, una de las principales limitaciones de su utilización in vivo.

Quimeras HVJ-liposomas (Virosomas)

Un concepto muy interesante, desarrollado por un grupo japonés, es la ob-

tención de liposomas quiméricos por fusión con el virus hemaglutinante del Ja-

pón (HVJ), también llamado virus Sendai. La estrategia consiste en la encapsu-

lación de complejos DNA-HMG1 en liposomas clásicos (fosfolípidos,

colesterol) y su fusión posterior con HVJ inactivado con luz ultravioleta. De

esta forma se combinan las ventajas del vector no viral con la capacidad de

unión celular y la fusogenicidad aportadas por las proteínas de la envuelta víri-

ca. A diferencia de los vectores virales, esta nueva quimera resulta muy poco

inmunogénica y permite administraciones repetidas.

Conjugados moleculares (Poliplexes)

Estos vectores se basan en moléculas bifuncionales obtenidas por unión co-

valente entre un policatión, (polilisina), que posibilita la unión y condensación

del DNA, y un ligando o anticuerpo monoclonal, que confiere especificidad celu-

lar. Estas moléculas forman complejos con DNA de estructura definida (toroidal)

que permite su fácil captura por la célula, siguiendo una ruta endocítica mediada

por receptor. La ventaja más clara del sistema es su especificidad. Sin embargo,

la mayor parte de los complejos que entran en los endosomas finalizan en los li-

sosomas, donde son degradados. Esta importante limitación ha tratado de solu-

cionarse mediante la adicción de reactivos que bloqueen la acidificación del en-

dosoma (cloroquina, monensina, bafilomicina A1...) o la incorporación de

actividades fusogénicas que se activen con la disminución del pH que tiene lugar

en el endosoma. Entre estos últimos se incluyen adenovirus inactivados con pso-

ralen y luz UV (generan eficacias de transfección muy altas) y péptidos fusogéni-

cos. Para su utilización in vivo se necesita la incorporaración de esta nueva acti-

vidad en los complejos, en lugar de su utilización in trans.

132



Policationes (Poliplexes)

De nuevo, el carácter catiónico es la directriz para el desarrollo de un vector

no viral. Este carácter permite, no sólo la interacción con el DNA (polianión), sino

también su condensación y la interacción de los complejos resultantes con las

membranas celulares, que poseen cargas negativas en su superficie. Para ello se

requiere que los complejos policatión-DNA sean electropositivos, lo que se consi-

gue con un exceso del policatión. Por tanto, la determinación de la estequiometría

óptima es fundamental para obtener un buen rendimiento de transferencia génica.

Los policationes más desarrollados y de mayor eficacia en la actualidad

son los basados en polímeros ramificados. Entre ellos destacan los dendrímeros

de poliamidoaminas (PAMAM) y la polietilénimina (PEI). Los primeros son

estructuras esféricas con una arquitectura muy definida y controlable. La pre-

sencia de grupos protonables con diferentes pKs le confiere un carácter tampo-

nador que bloquea la acidificación del endosoma, incrementando la eficacia de

escape al citosol. El fraccionamiento parcial del dendrímero, mediante la elimi-

nación de alguna de sus ramificaciones, ha permitido una mejora sustancial del

vector. El dendrímero fracturado actúa como una "esponja" en el interior del

endosoma, posibilitando una liberación más efectiva del DNA.

PEI es también una alternativa muy interesante. Comparte la funcionalidad

tamponadora de los dendrímeros y su coste de producción es muy bajo. Sin

embargo, es de naturaleza polidispersa y más difícil de caracterizar. Actual-

mente se ha conseguido introducir con éxito diversos tipos de ligandos, que le

confieren selectividad celular.

Vectores de naturaleza peptídica (Peptiplexes)

Existe un grupo heterogéneo de vectores que se basan en estructuras de

naturaleza peptídica. De ellos sólo voy a mencionar dos tipos. El primero utili-

za proteínas multidominio, basadas en el carácter modular de las toxinas bacte-

rianas. El concepto general es similar al de los conjugados moleculares, pero

con la ventaja de la utilización de técnicas de ingeniería genética. El sistema

incorpora, en una sola cadena peptídica, diferentes dominios estructurales, que

confieren actividades específicas necesarias para la eficiente introducción de

DNA en las células dianas. Las proteínas quiméricas obtenidas poseen un do-

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minio de reconocimiento y unión celular (ligando o anticuerpo monocatenario),

un dominio que posibilita el escape del endosoma (el dominio de translocación

de la toxina) y un dominio de unión a DNA (específico o inespecífico). Una de

las ventajas de este sistema es su versatilidad, que le permite la adaptación a

requerimientos específicos mediante la simple sustitución de un dominio. Sin

embargo, presenta limitaciones en cuanto a la expresión a gran escala de prote-

ínas tan complejas, así como su posible inmunogenicidad.

El segundo tipo está basado en la utilización de una estrategia similar me-

diante el uso de péptidos modulares: la aplicación de péptidos con funcionalida-

des específicas (unión a DNA, reconocimiento celular, fusogénesis, tropismo nu-

clear...) como sillares estructurales. De esta forma, se permite el establecimiento

de complejos de tamaño controlado (el mínimo posible) y de reducida inmunoge-

nicidad, que han permitido mejorar la eficacia de la transferencia génica.

Para finalizar, sólo quiero recordar que éste es un campo en continuo de-

sarrollo y evolución, y que aún quedan estrategias por explotar. Probablemente,

la solución no se encuentre en ninguno de los vectores como se conocen en la

actualidad. La combinación de varios de ellos se está empleando con éxito en

algunos sistemas. En cualquier caso, cuantas más alternativas se exploren, mas

cerca estaremos de la obtención de un buen vector de transferencia.

En paralelo al desarrollo de vectores, los avances en el diseño del soporte

(promotores inducibles y específicos de tejido, secuencias reguladoras, aislan-

tes génicos, sistemas de integración, replicación episómica en el huésped...)

compensan y complementan a aquéllos, permitiendo una evolución integral del

sistema que posibilitará una mayor eficacia y una disminución de sus limitacio-

nes. Mientras tanto, vamos conociendo con mayor detalle los mecanismos bio-

lógicos que permiten la introducción de material genético heterólogo en una

célula y eso repercutirá positivamente en el diseño de las nuevas generaciones

de vectores.

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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer

INTRODUCCIÓN

Los avances en el campo de la genética molecular están teniendo una im-

portante repercusión en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar, y tra-

tar una variedad

de enfermedades

congénitas y ad-

quiridas. Así, la

posibilidad de in-

troducir genes en

células eucario-

tas ha permitido

dar comienzo a nuevos protocolos de marcado y de terapia génica

humana (TG), que no resultaban abordables hace unos pocos

años, y que en esencia se fundamentan en dos estrategias que se

recogen en la Figura 1.

TERAPIA GÉNICA EN ENFERMEDADESMONOGÉNICAS Y CÁNCERJuan A. Bueren1 y Antonio Bernad2

1División de Hematopoyesis y Terapia Génica. CIEMAT2Departamento de Inmunología y OncologíaCentro Nacional de Biotecnología. CSIC

Figura 1. Modalidadesbásicas en las que se

fundamentan los protocolosde transferencia y terapia

génica.



138

En términos teóricos existen dos posibilidades técnicas para realizar TG.

En primer lugar, podríamos plantear una "terapia de sustitución" en la que el

gen afectado (mutado) fuese sustituido por una versión correcta. Esta aproxi-

mación sería perfecta, puesto que el gen introducido se encontraría en su entor-

no natural y bajo los sistemas de control/regulación de la expresión fisiológica.

Sin embargo, debido fundamentalmente al bajo índice de recombinación homó-

loga demostrada en las células eucarióticas (incluidas las de mamífero), ésta

aproximación no se plantea en términos prácticos, aunque muchos grupos de

investigación trabajan activamente en el desarrollo de procedimientos para au-

mentar dicho fenómeno (Li J. y Baker M.D., 2000), y se han comunicado algu-

nos intentos con éxito (Hatada et al. 2000). En segundo lugar nos encontramos

con la denominada "terapia de adición", que pretende introducir una construc-

ción de diseño que permita aportar la función génica afectada, generar un cir-

cuito secundario que incida sobre las vías afectadas o promueva una respuesta

fisiológica que elimine las células malignas o defectivas. La mayoría de los

protocolos en desarrollo actualmente utilizan esta alternativa, combinando un

sinfín de posibilidades técnicas que vienen principalmente determinadas por el

tipo de afección con la que se enfrenta el equipo de investigación. El resumen

de la experiencia acumulada hasta el momento indica que no existe una fórmu-

la universal de TG. Cada patología, y por ende cada tipo celular afectado e in-

cluso cada paciente, tiene más posibilidades de éxito con un determinado pro-

cedimiento que con otro, y esto es necesario probarlo en la arena clínica.

En esencia, el proceso de TG se puede realizarse tanto in vivo (inoculando el

vector de transferencia en el paciente), como in vitro. En este caso, la transferencia

génica se realiza sobre células extraídas del paciente, las cuales, una vez modifica-

das genéticamente, serán reinoculadas en él mismo. En general, los vectores de

transferencia actuales presentan una eficacia de transducción notablemente superior

cuando éstos se utilizan in vitro sobre las células diana a transducir, frente a cuando

éstos se inoculan in vivo. Por ello, una gran parte de los protocolos actuales de TG

tienen su fundamento en la obtención, transducción y reinfusión de las células

transducidas. A pesar de ello, los vectores adenovirales, y en menor medida los re-

trovirales, se han comenzado a utilizar in vivo en protocolos de terapia génica anti-

tumoral, mediante inoculaciones directas en la masa tumoral del paciente.

La revista Journal of Gene Medicine ha reportado que a finales del año

2005 estaban en marcha un total de 678 ensayos clínicos de terapia génica

en fase I; 219 en fases I/II, 147 en fase II y tan sólo 32 en fases II/II ó III.

Los vectores retrovirales y los adenovirales son los vectores de uso más fre-

cuente en estos ensayos, pues cada uno de estos vectores se está utilizando

en un 25% de los protocolos. Le siguen los ensayos en los que se utiliza

DNA desnudo (16%), lipofección (8%), y el resto está muy repartido entre

ensayos que utilizan vectores adenoasociados, virus vaccinia, y hasta 20 ti-

pos diferentes de vectores.

TERAPIA GÉNICA DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar

El éxito terapéutico de los tratamientos de TG depende fundamentalmente

de dos variables. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el trans-

gén en las células diana deseadas. Por otra parte, es también necesario que el

gen se exprese adecuadamente, produciendo niveles suficientes de la proteína

terapéutica. En el caso de enfermedades metabólicas asociadas a defectos gené-

ticos hereditarios, resulta evidente que la curación de la enfermedad sólo se ob-

tendrá cuando a las células de los tejidos afectados les llegue de manera estable

en el tiempo niveles umbrales de la proteína deficitaria. Una de las aproxima-

ciones más directas para lograr este objetivo es la de transducir la población ce-

lular afectada y/o sus células progenitoras con vectores que permitan la integra-

ción estable del transgén en el genoma celular. En los protocolos clínicos

diseñados al efecto, se han utilizado fundamentalmente vectores retrovirales, en

particular los derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV).

En un grupo significativo de aplicaciones clínicas -por ejemplo las relacionadas

con la terapia de la hemofilia- se ha comenzado a hacer uso de vectores adenoa-

sociados (AAV). Tal como ocurre con los vectores retrovirales, estos vectores

permiten la inserción estable del transgén, si bien en este caso suelen ser varias

las copias integradas, con lo que parece que se consiguen mayores niveles de

expresión del transgén en las células diana. Los vectores lentivirales constituyen

también una herramienta ya considerada para su uso en protocolos clínicos de

TG humana, ya que mediante estos vectores se facilita la integración del trans-

gén en células poco o nada proliferativas, con lo que se confía poder transducir

de manera muy eficaz las células madre de los diferentes tejidos.

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El esquema básico seguido

en estos ensayos clínicos es el

que se muestra en la Figura 2.

Las células de la médula ósea

del paciente se extraen de la

médula ósea, se purifican y se

translucen con los vectores te-

rapéuticos. Finalmente, la po-

blación conteniendo células

madre corregidas genéticamen-

te son infundidas en el pacien-

te, el cual en ocasiones puede

hacer recibido un tratamiento

submieloablativo para facilitar

el prendimiento del inóculo.

Principales enfermedades monogénicas que sonobjeto de terapia genética

Hasta que los laboratorios de genética molecular ofrezcan al-

ternativas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes,

el tratamiento genético de las enfermedades metabólicas se está centrando en la

terapia de mutaciones monogénicas recesivas, en las cuales la expresión de una

copia funcional del correspondiente transgén pueda ser suficiente para la cura-

ción de la enfermedad.

En aquellas patologías metabólicas en las que no resulta posible o no es

del todo eficaz la administración exógena de la proteína deficitaria, se han

planteado alternativas de terapia celular o génica sobre estos pacientes. En rela-

ción a los protocolos clínicos de terapia celular, del orden de treinta enferme-

dades metabólicas pueden ser tratadas mediante trasplante de progenitores he-

matopoyéticos procedentes de donantes histocompatibles sanos. No obstante,

debido a las limitaciones de donantes histocompatibles y a los riesgos asocia-

dos al trasplante alogénico, una larga serie de enfermedades metabólicas mono-

génicas han sido consideradas para su tratamiento mediante la transferencia del

gen deficitario en las células que manifiestan la patología.

De todos los protocolos de TG de enfermedades asociadas a defectos mo-

nogénicos, a continuación se muestra el fundamento de algunos de los han sido

140



Figura 2. Correción genéticade células madrehematopoyéticas depacientes conenfermedades hereditarias.

más relevantes, bien por su relevancia histórica, por su eficacia terapéutica o

por las expectativas generadas.

Inmunodeficiencias genéticasEntre las inmunodeficiencias consideradas para su tratamiento genético

son de destacar las inmunodeficiencias severas combinadas asociadas a muta-

ciones en los genes de la Adenosina Deaminasa (ADA) y la inmunodeficiencia

SCID-X1.

La ausencia de la ADA implica una acumulación del sustrato desoxiadeno-

sina trifosfato en las células, resultando particularmente tóxico para los linfoci-

tos T (Figura 3). Ésta fue una de las primeras patologías en ser tratadas me-

diante protocolos de TG con vectores retrovirales, primero en el NIH de

Estados Unidos (Blaese et al., 1995; Khon et al., 1998), y luego en el Hospital

S. Raffaelle de Milán (Bordignon et al., 1993; 1995; Ferrari et al., 1992; Aiuti

et al 2002). Las dos alternativas que se han considerado para el tratamiento ge-

nético de esta enfermedad estuvie-

ron basadas en la transferencia del

gen ADA en las células T de pa-

cientes y también en células madre

hematopoyéticas (CMH). En todos

los casos se comprobó la presencia

de células transducidas en los pa-

cientes y evidencias de mejora en

su inmunocompetencia. Muy re-

cientemente se ha comunicado que

pacientes con deficiencia de ADA,

que fueron acondicionados con protocolos poco agresivos y trasplan-

tados con células de médula ósea corregida genéticamente, han podi-

do hacerse independientes de la administración exógena del ADA

bovino y recuperado su función inmune (Aiuti et al 2002).

La inmunodeficiencia SCID-X1 representa aproximadamente la mitad de

todas las inmunodeficiencias severas y está asociada a un defecto en la cadena

γc, una proteína que forma parte de numerosos receptores de interleuquinas (Fi-

gura 4). La TG de estos pacientes se ha realizado mediante la transferencia de

la versión funcional del transgén a CMH, utilizando para ello técnicas optimi-

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Figura 3.Inmunodeficiencia

severa combinada ADA.

zadas de transferencia retroviral. Las

CMH se han trasplantado a once pa-

cientes no acondicionados, habiéndo-

se observado en diez de ellos la apa-

rición de células del sistema inmune

conteniendo el transgén y una eviden-

te mejoría clínica de los pacientes,

que les permitió abandonar las unida-

des de aislamiento a las pocas sema-

nas del tratamiento (Cavazzana-Calvo

et al., 2000).

Se considera que este protocolo, desarrollado en Francia por

el grupo de A. Fischer, es el primer protocolo de TG de una enfer-

medad metabólica que ha demostrado una eficacia terapéutica in-

cuestionable. Desgraciadamente, dos de los once pacientes actual-

mente tratados han desarrollado una leucemia linfocítica como

consecuencia de la activación del oncogén LMO2 en las células que habían in-

corporado el gen terapéutico. Esta observación supone, por tanto, también el

primer efecto patogénico asociado a una inserción retroviral en un paciente, y

pone de manifiesto la necesidad de evaluar el delicado equilibrio

beneficio/riesgo asociado a la práctica de la TG insercional (Hacein-Bey-Abina

et al 2003) en cada indicación clínica.

La granulomatosis crónica constituye otra inmunodeficiencia que ha

recibido atención particular para su tratamiento genético. Esta enfermedad

se caracteriza por un fallo por parte de las células fagocíticas para generar

el anión superóxido, por lo que se manifiesta mediante un síndrome recu-

rrente de infecciones y formación de granulomas (Figura 5). Estudios expe-

rimentales sugieren que la corrección genética de aproximadamente un 5%

de los granulocitos circulantes será suficiente para reportar un beneficio te-

rapéutico (Malech et al., 1999). Los estudios clínicos basados en el tras-

plante de células CD34+ transducidas sobre pacientes no acondicionados

no han mostrado beneficio terapéutico. No obstante, un ensayo clínico co-

menzado en Alemania con pacientes sometidos a un modelo de acondicio-

namiento modesto con busulfán ha evidenciado mejoría clínica en los dos

pacientes tratados.

142



Figura 4. Señalización porreceptores de citoquinasen la inmunodeficienciaX1-SCID.

Como conclusión

a los estudios realiza-

dos para tratar genéti-

camente pacientes con

enfermedades mono-

génicas, la Figura 6

muestra el número de

pacientes con inmu-

nodeficiencias seve-

ras, así como los que

han mostrado eviden-

cias de mejoría clíni-

ca. De estos estudios

se pone de manifiesto

que existe un número

de enfermedades mo-

nogénicas, para las

cuales la terapia génica co-

mienza a ser una realidad

terapéutica. En este mo-

mento, son las cuestiones

de seguridad las que limi-

tan el mayor desarrollo de

estos ensayos en la clínica

(Ver apartado 4).

Enfermedadesde acumulaciónde sustratos tóxicos

Un número relativa-

mente elevado de genes se

han asociado a este tipo de

enfermedades. De entre todas ellas, la enfermedad de Gaucher es la

más frecuente, por lo que ésta es la enfermedad de acumulación li-

sosomal que ha sido objeto de más estudios de TG. La enfermedad

de Gaucher está asociada a una deficiencia en glucocerebrosidasa

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Figura 5. Granulomatosiscrónica.

Figura 6. Beneficio clínicode pacientes con

inmunodeficienciastratados mediante

terapia génica.

(GC), por lo que se presentan importantes acumulaciones de glucocerebrósido

en macrófagos y en células derivadas de los mismos, produciéndose patologías

de la médula ósea, hígado, bazo y cerebro. Para que la TG de esta patología sea

eficaz se requerirá, por tanto, que las células corregidas alcancen órganos hema-

topoyéticos y no hematopoyéticos. En particular, para el tratamiento de la pato-

logía que afecta a la microglía del sistema nervioso central será necesario que

las células modificadas genéticamente migren al SNC y confieran allí el efecto

necesario sobre la manifestación neurológica. Hasta el momento se han realiza-

do pocos estudios piloto, aunque los mismos se encuentran todavía en fases

tempranas de estudio clínico. Otras enfermedades de acumulación de sustratos,

tales como la mucopolisacaridosis de tipo II (síndrome de Hunter) han recibido

atención para su tratamiento genético, aunque su desarrollo no se encuentra tan

avanzado como en el caso de la enfermedad de Gaucher.

HemofiliaTanto la hemofilia A, producida como consecuencia de un defecto en la pro-

ducción del factor VIII de coagulación, como la hemofília B, asociada al defecto

en el factor IX, han sido consideradas para su tratamiento por TG. Un estudio clí-

nico reciente (Kay et al., 2000) ha mostrado las primeras evidencias de eficacia clí-

nica asociada al tratamiento con vectores AAV que codifican el factor IX. En este

estudio, los vectores AAV se inocularon en el músculo de pacientes de hemofilia

B, obteniéndose resultados que sugieren que la hemofilia B podría transformarse

en una enfermedad más leve mediante la aproximación genética propuesta.

Enfermedades asociadas a defectos en la hemoglobinaLa talasemia-β y la anemia falciforme constituyen las dos patologías de

este grupo más estudiadas para su tratamiento mediante TG. Constituyen las

dos enfermedades monogénicas más frecuentes, y su patología molecular ha si-

do ampliamente investigada. El remplazamiento de la globina-β, defectiva o

ausente en pacientes con talasemia β puede ser curativa. Los altos niveles de

expresión del gen que codifica la globina-γ normal en las células eritroides de

pacientes con anemia falciforme, se confía que sean beneficiosos, debido al en-

samblaje preferente de los tetrámeros α y γ, y la relativa inestabilidad de las

cadenas βs. La TG de esta enfermedad requerirá, sin embargo, muy altos nive-

les de expresión del transgén, lo cual supone una taréa todavía pendiente.

144



Anemia de FanconiLa anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva poco

frecuente entre la población, pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen

desarrollar anomalías congénitas múltiples (en un 65% de los casos), fallo de

médula ósea y predisposición a cáncer. En promedio, la manifestación de la

aplasia se observa alrededor de los 8 años de edad, siendo la supervivencia me-

dia de estos pacientes de 16 años. Una de las características de esta enferme-

dad que la hacen particularmente apropiada para su tratamiento por TG radica

en la ventaja selectiva que parecen tener las células corregidas, respecto a las

células defectivas en los genes de Fanconi. La AF es consecuencia de mutacio-

nes o deleciones en cualquiera de los ocho genes que en la actualidad se sabe

están implicados en una función celular relacionada con la estabilidad del ge-

noma de estas células. Los resultados publicados sobre los ensayos realizados

en fase I no manifiestan beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999). No

obstante, nuevos ensayos con protocolos optimizados de transducción están ac-

tualmente en marcha.

Fibrosis quísticaEl gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y

posee un tamaño de 6,7 kB. En un 75% de los pacientes enfermos de FQ la

enfermedad se produce por un defecto en la posición 508. Como conse-

cuencia de las deficiencias de este gen se produce una alteración física y

química de las secreciones de las vías respiratorias y de las enzimas pan-

creáticas. Como consecuencia del defecto en el transporte del cloro entre

las células, las mucosidades se hacen muy densas, dificultando la expulsión

del moco bronquial y facilitando su infección con patógenos difíciles de

eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la inserción del

gen de la FQ en las células respiratorias. Hasta la actualidad se han desa-

rrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando vectores adenovira-

les, adenoasociados y liposomas (Alton et al., 1998). Los protocolos con

vectores adenovirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de trans-

ducción de las células diana; sin embargo, también han puesto de manifies-

to su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron

la eficacia de los vectores adenovirales. Es de esperar que los protocolos

actuales, con vectores menos inmunogénicos y más eficaces, faciliten la

mejoría clínica de estos pacientes.

145

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TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER (TGC)

En los años 60 y 70 se sucedieron las primeras propuestas teóricas para el

tratamiento de enfemedades humanas mediante la introducción de material ge-

nético en los órganos o células afectados. En 1968 se reportó el primer experi-

mento en el que se utilizó un virus oncogénico modificado como transportador

de material genético potencialmente terapeútico (Rogers S. y Pfuderer P. 1968).

Hubo que esperar al año 1979 hasta que apareciera el primer modelo animal

(Andreson W.F. y Fletcher J.C. 1979), lo que catapultó la investigación general

en el área. Sin embargo, la aplicación al campo de la terapia en cáncer se retra-

só hasta el año 1987, cuando se abordó el tratamiento de leucemias (Howell et

al. 1987; Merz, B. 1987; Bank et al. 1987).

Biología molecular del cáncerEl principal problema al que se en-

frenta la TGC es que, en sus formas

más habituales, no se trata de una en-

fermedad monogénica y las células can-

cerígenas presentan un gran número de

anomalías genéticas y cromosómicas.

Por tanto, las filosofías y formas de tra-

bajo habituales en el campo, más cen-

tradas en conseguir una mayor eficien-

cia de transducción en los órganos

diana, son sólo una parte del problema

en la TGC.

En base a esta premisa general, ha

sido necesario avanzar en el conoci-

miento molecular y fisiológico del

enemigo a batir, antes de contar con

herramientas suficientemente eficaces para afrontar el reto que

supone conceptualmente. Actualmente, y contando con que en ca-

da tipo de tumor humano los circuitos implicados principales

pueden ser distintos, conocemos varios principios de la fisiología

tumoral sobre los que poder incidir con garantías razonables de

éxito. Las principales vías afectadas (en solitario o en combina-

146



Figura 7. Basesmoleculares del cáncer(Adaptada de Hanahan2000).

ción) en los tumores humanos (Hanahan, D. y Weinberg, R.A., 2000), y en

las que se conocen genes importantes, son las siguientes (ver Figura 7):

1) Bloqueo de los programas de muerte celular programada.

2) Insensibilidad a señales antiproliferativas.

3) Generación de circuitos de supervivencia alternativos.

4) Proliferación descontrolada.

5) Invasividad y metástasis.

6) Inducción de angiogénesis asociada al desarrollo de tumores sólidos.

Todas estas vías pueden cooperar sin solución de continuidad y dependien-

do del tumor humano concreto, de forma casi aleatoria (al menos poco predeci-

ble), por lo que ha sido necesario acumular esta información antes de poder

realizar un diseño terapéutico racional. Esta situación se resume en varias si-

nergias bien caracterizadas en tumores humanos.

Este desarrollo ha llevado a un cambio conceptual del "tumor", asu-

miéndose actualmente que se trata de un nuevo "tejido", con necesidades fi-

siológicas específicas. Frente a la visión "reduccionista" del tumor, asu-

miendo que es un

conjunto de célu-

las, relacionadas

clonalmente pero

heterogéneas por

su inestabilidad gé-

nica intrínseca, la

nueva visión emer-

gente entiende el

tumor como un

"neotej ido" en

constante evolu-

ción, con unas ne-

cesidades cambian-

tes, tanto en términos metabólicos como protectores. El tumor

genera señales y sustancias que "manipulan" su entorno fisioló-

gico en su propio beneficio; se está jugando su propia supervi-

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Figura 8. El tumor comoun tejido complejo.

Adaptada de Hanahany Weinberg (2000).

vencia. Los tumores primarios crecen autónomamente hasta que sus necesi-

dades nutricionales les obligan a reclutar más recursos. Este es un momento

crítico (denominado angiogenic switch) en el que el tumor se estructura

atrayendo células de soporte, promueve la neovascularización de su entorno

(angiogénesis) y atrae células inmunes circulantes y las estimula para que

secreten metaloproteasas (p.e.) para favorecer su expansión y extravasación

(Figura 8).

En cada una de las vías anteriormente descritas se conocen algunos de los

mediadores o reguladores moleculares principales (master genes) sobre los que

se plantean las distintas aproximaciones terapéuticas. Dependiendo de cuál sea

la vía principal y cuál el mecanismo molecular afectado, los argumentos y es-

trategias terapéuticas son diferentes. A modo de ejemplo, ya que es imposible

ser exhaustivo en el marco de esta charla, comentaremos las principales estra-

tegias desarrolladas y los protocolos técnicos asociados.

Terapia génicadel cáncer

Lo primero a

tener en cuenta es

que los tratamientos

clínicos contra el

cáncer son tremen-

damente eficaces,

eliminando un altí-

simo porcentaje de

las células maligni-

zadas. Los proble-

mas fundamentales

derivan bien de la

agresividad de los

tratamientos, de la

aparición de quimioresistencias cruzadas, o bien de la existencia de

pequeños focos que no se eliminan y que pueden dar lugar a la rea-

parición de los procesos neoplásicos. En la actualidad, la mayoría

de los procedimientos desarrollados en base a la utilización de TGC

148



Figura 9. Definiciónde dianas en terapiagénica antitumoral.Adaptada de Hanahany Weinberg (2000).

distan mucho de ser capaces de sustituir a los tratamientos clínicos actuales,

aunque pueden aspirar a combinarse con ellos.

La Figura 9 presenta de forma muy esquemática las principales estrate-

gias, agrupadas de acuerdo con las distintas vías implicadas en la transforma-

ción tumoral.

En términos generales, si el principal proceso afectado es la eliminación de los

mecanismos de control negativo de la proliferación, se intentan introducir versiones

correctas de estos genes (p.e. los genes p53 o p16; Chen y col, 2000; Swisher S.G.

y Roth, J.A., 2000; Cowen et al., 2000; Kawacabe et al., 2000). Si el defecto con-

siste en la resistencia a los mecanismos naturales de inducción de muerte celular

programada, se intentan expresar genes que la pueden promover o hacerla más

efectiva (caspasas, FasL, etc). Un buen ejemplo es el tratamiento de gliomas me-

diante la expresión de caspasa-8 con vectores adenovirales (Shinoura et al., 2000)

Si el tumor es muy dependiente de la inducción de neovascularización o es muy

propenso a metastatizar, se introducen genes que puedan bloquear o disminuir di-

chos procesos (VEGF-R, análogos de angiostatina, moduladores de integrinas o

metaloproteasas, etc; Chen et al., 2000; Carmeliet, 2000; Abruzzese et al., 2000).

Los procedimientos empleados para realizar la transferencia génica son

muy variados y dependen fundamentalmente de la biología y fisiología del tu-

mor, pero esta etapa es crítica para el resultado final del tratamiento. Se emple-

an vectores virales (adenovirus, adeno-asociados, virus herpes, retrovirus, y

vectores derivados de lentivirus), vectores no-virales (liposomas, dendrímeros,

péptidos, bombardeo con micropartículas de oro que transportan las construc-

ciones génicas, etc), y el procedimiento puede ser in vivo o ex vivo.

Como es imposible en esta presentación hacer una revisión exhaustiva de

todo el panorama en desarrollo del área, nos restringiremos a aquellas aproxi-

maciones más específicas del campo o aquellas que más se han desarrollado.

Una rama especialmente desarrollada en la TGC es la introducción de genes

pro-citotóxicos en las células tumorales (fundamentalmente la timidina kinasa del vi-

rus herpes-HSV-TK-, y la proteína citidin-deaminasa -CDA-) lo que las susceptibiliza

a distintos compuestos (el más empleado es el ganciclovir, GCV) de forma diferen-

cial con respecto a las células sanas. La administración de estas sustancias al modelo

animal o al paciente elimina las células tumorales transducidas y aquéllas que se en-

cuentran en sus cercanías por un fenómeno conocido como "bystander", que está me-

diado por la transferencia de la droga metabolizada a las células circundantes.

149

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Dos son los modelos tumorales que más atención han recabado de las expec-

tativas de la TGC, y lógicamente, son los tumores que peor pronóstico presentan

con los tratamientos clínicos actuales: glioma maligno y melanoma avanzados. El

tratamiento de gliomas ha sido evaluado por numerosos autores (revisado por

Klatzman et al., 1998), obteniendo resultados variables. Sandmair y col. han com-

parado la eficiencia del tratamiento, bien utilizando vectores retrovirales, bien con

adenovirus (Sandmair y col. 2000). Sus resultados demuestran claramente que los

efectos secundarios del tratamiento son aceptables, y que los pacientes tratados

con vectores adenovirales han mostrado una duplicación del tiempo de supervi-

vencia (MRI), 15.0 meses, en comparación con los pacientes tratados con vectores

retrovirales, 7.4 meses, y el grupo control, 8.3 meses.

De 1998 a febrero de 2000 se han hecho públicos varios estudios clínicos

(Fase I/II) para el tratamiento de pacientes con melanoma cutáneo maligno y me-

tastásico, mediante la administración intra-lesión de vectores adeno expresando

HSV-TK en combinación con dosis escaladas de ganciclovir (Klantzman et al.,

1998; Morris et al. 2000). En estos estudios se pretende determinar la dosis máxi-

ma de GCV que puede ser administrada en combinación con la administración au-

torizada del vector, evaluar la tasa terapéutica objetiva del ensayo y determinar si

existe efecto "bystander" en otras localizaciones lejanas al punto de tratamiento.

Esta estrategia es bastante efectiva, aunque todavía presenta algunos in-

convenientes como los derivados de: 1) aparición de células tumorales resisten-

tes al tratamiento, 2) eficiencia del proceso de transferencia y 3) generación de

inmunogenicidad por la expresión de una proteína de origen bacteriano (TK).

De forma adicional existe una rama casi exclusiva de la TGC que lidia

con mejorar la respuesta inmune del organismo frente a los tumores (inmunote-

rapia bioquímica y/o celular). En esta aproximación se utilizan también distin-

tas aproximaciones que se pueden resumir en las siguientes:

1) Aislamiento, amplificación ex vivo, modificación génica (en algunos

casos) y retrasplante en el paciente de linfocitos autólogos del paciente (TILs,

LAKs, ALTs) que presentan afinidad por el tumor (Weijtens et al., 1998; Bol-

huis R.L. y Gratama J.W., 1998).

2) Inmunización con DNA de oncogenes tumor-específicos (p.e - neu en

el caso de cáncer de mama-; Reilly et al., 2000; Amici et al., 2000).

3) Generación de vacunas autólogas, utilizando células tumorales inacti-

vadas, primando células dendríticas (revisado por Kirk C. y Mule J., 2000), o

potenciando la inmunogenicidad de las células tumorales mediante la introduc-

150



ción de genes que favorecen el proceso (HGFs, ILs, moléculas accesorias, etc).

Ésta es una de las aproximaciones más evaluadas, con distintas filosofías. Mi-

ller y col. han demostrado que la administración intratumoral de células dendrí-

ticas modificadas con adenovirus que expresan IL-7, aumenta la respuesta in-

mune antitumoral (cáncer de pulmón) hasta conseguir su erradicación (Miller

et al., 2000). El tratamiento del melanoma también se ha intentado mediante

técnicas de vacunación. Osanto y col. han publicado el tratamiento con éxito

de 33 pacientes afectados por melanoma metastásico, mediante su vacunación

con una línea celular de melanoma alogénica, manipulada para producir IL-2

(Osanto et al., 2000). Otros autores han tratado cinco pacientes con células tu-

morales autólogas transducidas para que secreten GM-CSF (Chang et al.,

2000), demostrando una remisión total en uno de los pacientes.

Cualquiera de estas aproximaciones presenta la gran ventaja respecto a los

tratamientos más convencionales que, al menos teóricamente, sería capaz de al-

canzar los reservorios residuales del tumor (santuarios) que no son eliminables

por las terapias convencionales (cirugía, quimio y radioterapia), por lo que los

tratamientos más prometedores podrían ser utilizados en combinación con los

que actualmente se utilizan en clínica. Desde mi modesta opinión, estas aproxi-

maciones parecen las más realistas y prometedoras para aumentar el arsenal te-

rapéutico en la lucha contra el cáncer.

Finalmente se han introducidos nuevos vectores virales citotóxicos con una

particularidad esencial: se replican y amplifican preferentemente en las células tu-

morales (conditional replication-competent vectors). Actualmente existen varios

modelos preliminares (Alemany et al., 2000; Rancourt et al., 1999) que necesitarán

una posterior etapa de refinamiento y de bioseguridad, pero que son muy interesan-

tes. En este último estudio se ha desarrollado un modelo para controlar la produc-

ción de partículas infecciosas tras la infección con un vector adenoviral (Ad5dl312)

al que se le había delecionado la función E1A, y sustituido por una función de sín-

tesis activada por IL-6. La generación de partículas infecciosas depende de la pro-

ducción celular de IL-6, por lo que el modelo terapéutico tiene un gran interés en

tumores que poseen un ciclo autocrino de IL-6, como el cáncer de ovario.

Una variante de esta última aproximación, que todavía se encuentra en fa-

se de desarrollo, es la utilización de vectores retrovirales replicativos (RRV).

Solly y col. han publicado recientemente un primer estudio en el que comparan

la eficacia de transducción in vivo de los RRV (>85%) en comparación con los

151

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vectores convencionales (<1%), para modificar masas tumorales desarrolladas

en modelos animales inmunocompetentes; los autores proponen el uso de estos

modelos para el tratamiento de tumores cerebrales en los que han demostrado

una eficiencia 1.000 veces mayor que los adenovirus deficientes en replicación

(Solly et al., 2003). Si se consiguen derivar vectores RRV condicionales se ob-

tendrá una nueva y valiosa herramienta para la lucha contra el cáncer mediante

técnicas de manipulación genética.

LA SEGURIDAD EN TERAPIA GÉNICA

Problemas ocurridos en el tratamiento de la deficienciade la Ornitín Transcarbamilasa

Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima cla-

ve del metabolismo de aminoácidos -la Ornitín Transcarbamilasa (OTC)- lo

que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.

Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se consi-

dera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del

gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepá-

ticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de

estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también en animales de

experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento

de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó

efectos tóxicos severos. No obstante, en uno de los pacientes tratados con la

dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepática

y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en

coma del paciente. Lamentablemente el paciente falleció poco después, estando

todavía en investigación la causa primaria de su muerte. El fallecimiento de es-

te paciente como consecuencia de la inoculación del vector viral disparó las

alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la

inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actuali-

dad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor

parte del esqueleto viral implicado en la inmunogenicidad de los mismos, por

lo que se confía en que su uso prevenga de la generación de respuestas inmu-

nogénicas no previstas.

152



Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratadosmediante terapia génica

Desgraciadamente, tres de los diez pacientes X1-SCID que han sido trata-

dos en el Hospital Necker, mediante terapia génica, han desarrollado leucemias

asociadas a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de oncogenes

(Hacein-Bey-Abina et al. 2003). De particular significado ha sido la observa-

ción que en dos de estos pacientes la inserción se ha observado próxima al on-

cogén LMO2, implicado en leucemias linfocíticas. Como se recoge en la Figu-

ra 10, en ninguno de los otros protocolos en marcha, ni tampoco en los

pacientes X1-SCID tratados en Londres, se han observado efectos adversos se-

veros similares.

El conocimiento de las bases moleculares por las cuales se han producido

las leucemias en estos pacientes aún está por resolver. No obstante, estas evi-

dencias sugieren la conveniencia de proseguir los trabajos que tienen por obje-

to mejorar la seguridad de

los vectores dirigidos a

tratar pacientes por esta

nueva aproximación tera-

péutica.

Como también suce-

dió con la quimioterapia o

la radioterapia, los prime-

ros efectos severos adver-

sos asociados a la terapia

génica también han que-

dado ya de manifiesto. En

los próximos años los in-

vestigadores habrán de ser

capaces de demostrar que

la relación entre el beneficio clínico y el riesgo asociado a la tera-

pia génica es positiva para el paciente. Este hecho repercutirá en la

expansión de una nueva herramienta terapéutica para pacientes que

no tienen otra opción terapéutica eficaz.153

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Figura 10. Incidenciade efectos adversos

severos en pacientescon inmunodeficiencias

tratados conterapia génica.

BIBLIOGRAFÍA

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155

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Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología

FARMACOCINÉTICA

Toda sustancia con actividad farmacológica queda definida no solamente

por su configuración estructural sino también por sus propiedades físico-quími-

cas y biológicas, entre las que se incluye el perfil farmacocinético que cuantifi-

ca, mediante diversos parámetros, los procesos de absorción, distribución, me-

tabolismo y excreción1.

La farmacocinética se ha consolidado durante los últimos años como una

disciplina de gran interés sanitario. Su aplicación se dirige, principalmente, hacia

el desarrollo de nuevos medicamentos y a la optimización de los tratamientos

farmacológicos2. Otras aplicaciones menos conocidas son la detección diagnósti-

ca de respuestas anómalas, el análisis retrospectivo de errores terapéuticos o tra-

tamientos inadecuados y las actividades educativas encaminadas a asegurar el

uso seguro y eficaz de los medicamentos. Dentro de la investigación farmacoló-

gica, la farmacocinética puede dirigirse también a la resolución de aspectos clíni-

cos concretos como la detección de interacciones, problemas de biodisponibili-

dad o a la definición de parámetros útiles para el diseño de regímenes de

dosificación individualizados. La farmacocinética es hoy de gran utilidad para to-

dos aquellos profesionales implicados en el desarrollo, evaluación y uso de los

FARMACOCINÉTICA DE LOS MEDICAMENTOSOBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍAAlfonso Domínguez-Gil Hurlé. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de Salamanca



158

medicamentos. La far-

macodinamia expresa

la variación del efecto

con la concentración y

asociada a la farmaco-

cinética constituye la

base para la definición

de la respuesta en los

tratamientos farmaco-

lógicos.

La actividad intrínseca que presenta un fármaco es condición

necesaria, pero no suficiente, para asegurar la eficacia terapéutica. El

fármaco precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de acción, no

siempre bien definido, en ocasiones difícilmente accesible o cuya ac-

cesibilidad se modifica con la gravedad de la enfermedad. Para ello

se puede requerir, por ejemplo, una biodisponibilidad elevada, una

amplia distribución tisular o un lento aclaramiento plasmático. Unas propieda-

des farmacocinéticas desfavorables pueden llegar a condicionar el potencial te-

rapéutico de un nuevo fármaco y aconsejar la interrupción de los ensayos clíni-

cos programados en su desarrollo. La Figura 1 muestra esquemáticamente la

contribución de la farmacocinética y la farmacodinamia en la respuesta a un

tratamiento farmacológico3.

Es posible establecer distintos tipos de relaciones entre la farmacocinética

y la farmacodinamia de péptidos y proteínas de interés terapéutico. Así, los va-

lores del área bajo la curva de niveles séricos de algunos agentes trombolíticos

se correlacionan directamente con la permeabilidad en el infarto vascular. Un

modelo PK-PD ha sido utilizado para el diseño de las pautas de dosificación de

reteplasa, un agente trombolítico recombinante.

Con frecuencia no es posible establecer, para péptidos y proteínas, una re-

lación directa concentración-efecto debido a que la variable medida suele ser la

resultante a dos o más procesos cinéticos que ocurren después de la fijación a

receptores. La Figura 2 recoge el modelo PK-PD con respuesta indirecta esta-

blecido para la hormona de crecimiento utilizando diferentes vías de adminis-

tración4. En algunos casos, se requieren modelos PK-PD complejos para poder

definir una relación entre las concentraciones séricas y la respuesta, como se ha

demostrado con interleuquina-2, eritropoyetina, etc.

Figura 1. Relación de lafarmacocinética yfarmacodinamiacon la respuestaterapéutica.

Los resultados

obtenidos en los estu-

dios farmacocinéticos

junto a los procedentes

de los ensayos de efi-

cacia y seguridad con-

figuran el perfil farma-

cológico de un nuevo

medicamento, permi-

tiendo establecer los

principios básicos para

su correcta utilización en la práctica clínica.

La investigación de nuevos fármacos se orienta, con frecuencia,

a mejorar algunas características farmacocinéticas, especialmente la

absorción gastrointestinal, la distribución tisular y la velocidad de

eliminación. Ello se consigue mediante cambios en la estructura quí-

mica o en la formulación farmacéutica que puede modificar la cinética de libe-

ración, el acceso a los tejidos e incluso los procesos de metabolismo y excre-

ción5. Estos cambios permiten mejorar la efectividad de los tratamientos bien

por cambios en el perfil de la respuesta o facilitando la administración y mejo-

rando el cumplimiento de la prescripción.

La estructura química que presentan la mayoría de los productos biotecno-

lógicos condiciona algunas propiedades, que pueden dificultar su utilización te-

rapéutica y que se refleja en su perfil farmacocinético. Entre ellas destacan la

baja biodisponibilidad por vía oral, ciertas exigencias en la distribución tisular

y celular y un aclaramiento plasmático elevado.

MEDICAMENTOS BIOTECNOLÓGICOS

Los medicamentos obtenidos por Biotecnología constituyen una clase tera-

péutica emergente en la clínica que presenta unas características diferenciales

no solo por su origen, sino también por su estructura química y algunas propie-

dades farmacocinéticas y farmacológicas.

Aunque la biotecnología moderna nace en 1953 al conocerse la estructura

del ácido desoxirribonucleico (ADN), su incorporación a la terapéutica humana

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Figura 2. Modelofarmacocinético-farmacodinámico

establecido para lahormona de crecimiento.

no se produce hasta comienzos de los años 80 con la utilización de la insulina

y de la hormona de crecimiento recombinantes en terapia sustitutiva. Desde en-

tonces se han incorporado al arsenal terapéutico unos 100 medicamentos, aun-

que cerca de 700 moléculas, para el tratamiento de unas 250 enfermedades, se

encuentran en diferentes fases de investigación clínica. Diversos analistas clíni-

cos coinciden en afirmar que los medicamentos biotecnológicos llegarán a re-

presentar, en un futuro, el 20-25% de todos los recursos farmacológicos6.

Los medicamentos biotecnológicos incluyen proteínas obtenidas por inge-

niería genética, anticuerpos monoclonales producidos mediante la tecnología

del hibridoma, vectores para el transporte de material genético, fragmentos de

anticuerpos, oligonucleotidos antisentido, vacunas, etc. Estos productos presen-

tan algunas características que los diferencia de los medicamentos tradiciona-

les. Su estructura química, por ejemplo, es más compleja ya que se trata, con

frecuencia, de proteínas que contienen un número elevado de aminoácidos (fil-

gastrin 174, somatropina 191, alteplasa 527, etc.) con una determinada secuen-

cia, con especificidad en el número y localización de los puentes disulfuro e

incorporación de una o varias moléculas de carbohidratos que son necesarias

para la actividad biológica. La cadena proteica puede presentar, además, héli-

ces en distinto número, tamaño y configuración. Asimismo, algunas proteínas

activas requieren la asociación de varias subunidades proteicas para formar un

gran agregado activo, estructura cuaternaria, como ocurre, por ejemplo con el

interferon-α-1b formado por dos proteínas idénticas de 165 kDa unidas por

uniones no covalentes7.

BIODISPONIBILIDAD ORAL

Los péptidos y proteínas presentan una baja biodisponibilidad por vía oral,

generalmente inferior al 1%, por lo que en principio no son candidatos idóneos

para utilizar esta vía de administración. Ello es debido a su inestabilidad en el

medio fuertemente ácido del estómago, al efecto producido por las peptidasas

intestinales, y especialmente a su escasa permeabilidad como consecuencia del

tamaño molecular, la carga eléctrica y la elevada polaridad. La mayoría de las

proteínas recombinantes se incluyen dentro de la clase III del sistema de clasi-

ficación biofarmacéutica; solamente algunas pertenecen a la clase IV y es ex-

cepcional que algunas biomoléculas se incluyan en la clase I. Es decir, los pro-

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ductos obtenidos por Biotecnología suelen presentar una solubilidad en agua

alta o moderada y una permeabilidad intrínseca baja o muy baja8.

La capacidad de los fármacos para atravesar las barreras biológicas consti-

tuye un parámetro biofarmacéutico de gran interés del que depende no sólo la

absorción, sino también la distribución, metabolismo y excreción. Aunque las

diferentes membranas biológicas presentan unas características específicas, los

principales constituyentes siempre son: fosfolípidos, colesterol, esfingolípidos y

glicolípidos. Por tanto, para que un fármaco supere las diferentes membranas

biológicas y alcance su lugar de acción debe presentar un balance adecuado en-

tre hidrofilia y lipofilia, que se expresa habitualmente por el coeficiente de re-

parto octanol-agua (P) o más fácilmente por log P. Este parámetro es un buen

predictor de la permeabilidad de muchos fármacos y puede ser correlacionado

con diversos parámetros farmacocinéticos. Ello no es posible cuando se trata

de péptidos y proteínas, debido a que en su estructura están presentes numero-

sas funciones polares que forman puentes hidrógeno con los grupos hidroxilo

de la fase acuosa. Los péptidos presentan, en consecuencia, coeficientes de re-

parto más altos, que no se corresponden con la permeabilidad. No obstante,

pueden obtenerse buenas correlaciones cuando se determina el número de

puentes de hidrógeno potenciales que pueden establecerse con el agua. Los co-

eficientes de reparto heptano-etilenglicol o la diferencia entre los coeficientes

de reparto octanol-agua y ciclohexano-agua (ΔlogP) permiten estimar los puen-

tes hidrógeno o la desolvatación potencial de las moléculas peptídicas que son

buenos predictores de la permeabilidad. De esta forma es posible anticipar el

efecto de las modificaciones estructurales en la absorción oral de péptidos de

interés terapéutico, lo que es de gran utilidad en el desarrollo de nuevas molé-

culas. La desolvatación potencial que presentan diferentes péptidos ha podido

ser relacionada con parámetros farmacocinéticos que describen el proceso de

absorción como Cmax y AUC.

Factores fisiológicos como el tiempo de tránsito gastrointestinal, la dilu-

ción y las interacciones con componentes de los alimentos reducen la fracción

de dosis disponible para la absorción de péptidos y proteínas. Finalmente, el

efecto del "primer-paso" y las "bombas de eflujo" también son responsables de

la escasa biodisponibilidad oral que presentan los productos obtenidos por bio-

tecnología.

La Figura 3 muestra algunos de los factores más importantes que reducen

la biodisponibilidad oral de moléculas proteicas.

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Pese a esta situa-

ción, sabemos que al-

gunos medicamentos

con estructura peptídi-

ca como antibióticos

β-lactámicos, inhibi-

dores de la ECA o la

ciclosporina presentan

valores de biodisponi-

bilidad que permiten

su administración por

vía oral y tienen acreditado su valor terapéutico. Asimismo, peque-

ños péptidos procedentes de la digestión de las proteínas de la dieta

o incluso algunos antígenos naturales solubles se absorben intactos.

A diferencia de otros fármacos algunas proteínas recombinantes

presentan una actividad intrínseca muy elevada, hasta el punto de po-

der admitir que una biodisponibilidad del 10% podría ser suficiente

para alcanzar los objetivos terapéuticos cuando se administran por vía oral.

La Figura 4 recoge algunas de las alternativas en desarrollo para mejorar

la biodisponibilidad oral de péptidos y proteínas.

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Figura 3. Efecto delmetabolismo y delcontratransporte porgliclop-P en labiodisponibilidad oral deproteínas.

Figura 4. Proteínas por vía oral: ¿es posible?- Modificaciones estructurales:

• Emisphere Technologies y Nobex Corporation (insulina, hormona del

crecimiento y paratohormona).

• Generes Biotechnology Corp: Oral-lyn® (oral insulin spray*).

- Sistemas endógenos de transporte celular:·

• Inhibidores de la P-glicoproteína, G-CSF-transferrina.

- Partículas como sistemas de transporte:

• Liposomas recubiertos con mucoadhesivos, hidrogeles.

- Nanosistemas (<500 nm):

• Nanopartículas vectorizadas (β1 Integrinas, lectinas).·

• Vacunas orales.

*primera formulación oral de insulina comercializada

ADMINISTRACIÓN PARENTERAL

Debido a las limitaciones de la vía oral, los péptidos y proteínas se admi-

nistran habitualmente por vía parenteral, preferentemente endovenosa. La ma-

yoría de estas moléculas presentan un rápido aclaramiento, lo que conduce a

valores bajos en la semi-vida de eliminación

Los problemas que surgen con la administración parenteral de macromolé-

culas que presentan un rápido aclaramiento ha estimulado el desarrollo de dife-

rentes actuaciones dirigidas, en principio, a modificar el perfil farmacocinético

y, en consecuencia, facilitar su administración. Ello se ha conseguido mediante

cambios estructurales, por conjugación con diversos polímeros, por hiperglico-

silación de las proteínas y con el desarrollo de formulaciones parenterales de

liberación controlada9-11.

Entre las modificaciones estructurales pueden citarse las derivadas de la

insulina de acción ultralarga como el (Fmoc)2-insulina, un profármaco cuya

transformación en insulina presenta un t1/2 = 12 ± 1 días en ratas. No se han

publicado aún los resultados de los estudios en humanos.

La conjugación de péptidos y proteínas con diversos polímeros constituye

actualmente un área de gran interés especialmente en la terapéutica oncológica

a la que se han incorporado proteínas antitumorales, enzimas, citoquinas, etc.

La conjugación con polímeros produce cambios significativos en el perfil far-

macocinético de las macromoléculas, permitiendo superar algunas de las limi-

taciones que presentaban para su utilización clínica. El principal cambio es un

incremento en la semi-vida de eliminación con un aumento de la captación ce-

lular por endocitosis. Una vez en sangre se produce la liberación del conjugado

a los compartimentos endosómicos y lisosómicos de la célula con descenso del

pH (5,5-6,0). Una vez alcanzado el lisosoma se produce la degradación meta-

bólica por acción de las hidrolasas intracelulares, como se puede observar en la

Figura 5.

La pegilación de proteínas con una o varias cadenas de polietilenglicoles

(PEG) es, posiblemente, el mecanismo de conjugación más desarrollado. Los

PEG son polímeros lineales o ramificados constituidos por unidades de óxido

de etileno (-CH2-O-CH2-) que presentan dos grupos hidroxilo terminales, los

cuales pueden ser activados químicamente12. La reacción de pegilación más

frecuente implica al grupo ε-amino de la lisina o grupos amino terminales de

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las proteínas. Las bio-

moléculas conjugadas

presentan propiedades

físico-químicas dife-

rentes de las proteínas

originales, como cam-

bios conformacionales,

impedimento estérico,

capacidad de unión

electrostática, valores

de pK locales de la li-

sina, hidrofobicidad

punto isoeléctrico, etc.

Estos cambios pueden

quedar reflejados, en

principio, por cambios

en la actividad detectada mediante ensayos in vitro y en la eficacia,

establecida utilizando ensayos in vivo. La fijación a receptores se re-

duce progresivamente al aumentar la masa molecular del polímero,

lo que produce un descenso de la actividad cuando se utilizan ensa-

yos in vitro con tiempos de incubación cortos. Sin embargo, la eficacia de la

proteína se incrementa como consecuencia de los siguientes mecanismos:

a) Retraso en el aclaramiento renal de la proteína que produce un incre-

mento en la semi-vida de eliminación y en el valor del área bajo la curva de

niveles séricos. Este último parámetro refleja el "periodo de exposición" y se

relaciona, en ocasiones, con la eficacia en modelos pK-pD.

b) Mayor estabilidad frente a los enzimas responsables de la degradación

de peptidos y proteínas frecuentemente como consecuencia del impedimento

estérico.

c) Menores efectos adversos debido a que el PEG reduce significativa-

mente la inmunogenicidad y antigenicidad de las proteínas.

La pegilación de interferones también produce cambios significativos en el

perfil farmacocinético-farmacodinámico que pueden suponer un progreso en el

tratamiento de la hepatitis C y otras indicaciones. La Figura 6 muestra el efecto

provocado en las concentraciones séricas del interferón-α-2a como consecuen-

cia de su conjugación con el PEG. El efecto depende del tamaño del polímero

164



Figura 5. Captacióncelular de un polímeropor endocitosis.

y se ha considerado

que dos cadenas rami-

ficadas de 20 kDa pro-

porcionaban un perfil

farmacológico idóneo

para el desarrollo clí-

nico13.

Durante los pasa-

dos 20 años han sido

estudiados numerosos

conjugados de proteí-

nas con PEG (citotóxi-

cos, antioxidantes, enzimas, trombolíticos, citoquinas y factores de

crecimiento hematopoyético, etc.) aunque sólo algunos se encuentran

en fase de desarrollo clínico. La conjugación con PEG ha sido apli-

cada también a oligonucleótidos y lípidos para aumentar su solubili-

dad, estabilizar las moléculas, incrementar la permeabilidad o dismi-

nuir el aclaramiento14.

Los glicoconjugados son aquellos compuestos resultantes de la unión co-

valente de una fracción glucídica con otro compuesto que puede ser protídico o

lipídico. La eritropoyetina recombinante es una glicoporteína utilizada desde

hace más de 10 años en el tratamiento de la anemia renal. Su excreción renal

es mínima, pero es ampliamente metabolizada en el hígado vía receptores de la

galactosa. Los residuos de ácido sialico eliminados en el proceso de biotrans-

formación aseguran la estabilidad de la hormona y su actividad biológica. El

metabolito desprovisto de ácido sialico es rápidamente eliminado, siendo la se-

mi-vida de eliminación de la eritropoyetina de 4-8 horas.

Diversos estudios experimentales han demostrado que hay una relación

directa entre el contenido de ácido sialico y la semi-vida de eliminación de

las glicoproteínas, lo que ha sido un estímulo para la búsqueda de nuevas

moléculas.

La darbepoetina alfa es un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina que

presenta distintas propiedades físico-químicas y biológicas. La Figura 7 recoge

la estructura de ambas moléculas estimulantes de la eritropoyesis así como la

evolución de los niveles séricos obtenidos tras su administración por vía intra-

venosa. La principal consecuencia del cambio producido en el perfil farmacoci-

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Figura 6. Farmacocinéticade interferón y dosderivados pegilados.

nético será de modifi-

cación del intervalo

posológico, que pasará

de 3 a 4 días con la

eritropoyetina a 7-14

días con NESP15.

En los últimos

años se han desarrolla-

do numerosas matrices poliméricas biodegradables y biocompatibles

que se han incorporado a microcápsulas, microesferas, nanoesferas e

implantes para conseguir una liberación prolongada de pequeñas mo-

léculas. Actualmente, algunos de estos polímeros se utilizan en el di-

seño de formulaciones parenterales de medicamentos obtenidos por biotecnolo-

gía16. Entre ellos destacan los poli (α-hidroxiácidos) como el ac.poliláctico y el

ac.polihidroxibutírico y co-polímeros, especialmente el ac.láctico-ac.glicólico.

Estos productos no son inmunogénicos y permiten, por sus propiedades físico-

químicas controlar la velocidad de liberación de péptidos y proteínas. El diseño

y fabricación de estas formulaciones difiere de los habitualmente utilizados con

fármacos de bajo peso molecular que presentan, en general, una mayor estabili-

dad durante los procesos de separación de fases, evaporación de disolventes,

emulsión, atomización, etc. Estos procesos exigen temperaturas elevadas, con-

centraciones altas de tensoactivos, mezcla de disolventes, etc. que provocan, en

muchos casos, una degradación acelerada de proteínas. Para evitar la pérdida

de actividad asociada a la degradación química debe recurrirse a la liofilización

de las proteínas, homogeneización de la suspensión proteína-polímero, secado

por atomización en nitrógeno liquido, eliminación del disolvente del polímero

con etanol y filtración y secado bajo vacío17. Estas técnicas han sido utilizadas

en el desarrollo de microesferas de liberación controlada de proteínas recombi-

nantes, como la hormona de crecimiento interferón-α, interleuquina-2, calcito-

nina, hormona liberadora de tirotropina, etc.

La liberación de las proteinas microencapsuladas en el organismo es un

proceso complejo e incluye habitualmente la hidratación de las partículas, diso-

lución del fármaco con difusión a través de los poros de la matriz polimérica y

biodegradación del polímero. La duración del proceso de liberación está condi-

cionada por diversos factores como la composición del polímero, la presencia

de modificadores de la liberación, etc.

166



Figura 7. Estructura yfarmacocinética deeritropoyetina y NESP.

La posibilidad de modular el proceso de liberación ha permitido el diseño

de vacunas para administración en dosis únicas. Las micropartículas (1-200

mm) del copolímero láctico-glicólico están siendo utilizadas como portadores

de antígenos para la inmunización frente a bacterias, virus y parásitos. Sin em-

bargo, el progreso es lento debido a que no existe un consenso sobre la cinética

óptima de liberación y por las dificultades para mantener la estabilidad física y

química de los antígenos.

La mayor complejidad de estas formulaciones en relación con las de libe-

ración inmediata obliga a adoptar precauciones especiales en la optimización

de su producción industrial. Los principales puntos críticos son la integridad de

la proteína y el valor del Cmax en ratas, utilizado como parámetro farmacociné-

tico que refleja la eficacia del proceso de encapsulación.

DISTRIBUCIÓN TISULAR Y CELULAR

La incorporación de los fármacos a órganos y tejidos corporales es un pro-

ceso cinético complejo con una gran repercusión en la respuesta terapéutica. La

velocidad de distribución puede estar limitada por la perfusión sanguínea o por

la permeabilidad lo que condiciona el acceso y permanencia en su lugar de ac-

ción. La fracción de la dosis de un fármaco que alcanza finalmente los tejidos,

o incluso los espacios intracelulares, depende de numerosos factores, muchos

de ellos dependientes de sus propiedades físico-químicas. Por ello, las peque-

ñas moléculas con un óptimo coeficiente de reparto acceden con facilidad a los

compartimentos periféricos y presentan valores elevados del volumen aparente

de distribución, a diferencia de los péptidos y proteínas que presentan valores

relativamente pequeños. El elevado peso molecular que presentan algunas bio-

moléculas constituye un factor limitante de la distribución tisular. Sin embargo,

en algunos casos es posible alcanzar el lugar de acción en concentración sufi-

ciente para producir una respuesta terapéutica adecuada.

La especificidad en la localización del lugar de acción de muchos fárma-

cos obtenidos por Biotecnología obliga a mayores exigencias en su perfil de

distribución. El desarrollo de los factores de crecimiento y genes recombinates

para promover la angiogénesis en el infarto de miocardio es un buen ejemplo

de la importancia de esta característica farmacocinética18. La administración

endovenosa del factor de crecimiento de fibroblastos (FCF) no produce res-

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puesta angiogénica en modelos experimentales de isquemia miocárdica. Por

ello ha sido necesario recurrir a la administración directa en el miocardio, en el

saco pericárdico o en el espacio perivascular, para alcanzar la respuesta tera-

péutica deseada. La eficacia de estas alternativas fue confirmada y evaluada

por medida del flujo y función miocárdica, aunque se hace preciso aún aplicar

nuevas técnicas, como la tomografía de emisión de positrones o la resonancia

magnética, para establecer, de forma más precisa, la extensión de la respuesta

angiogénica.

Una situación más problemática se plantea cuando se precisa el acceso in-

tracelular de genes y oligonucleótidos antisentido, cuya diana está localizada en

el compartimento citosol/núcleo19. Se han propuestos diferentes mecanismos pa-

ra explicar la internalización de estas moléculas como la endocitosis en fase

fluida y la endocitosis mediada por receptores, ya que no hay evidencia de paso

por difusión pasiva, ni siquiera recurriendo a biomoléculas neutras. En el mo-

mento actual la escasa capacidad de internalización y la inadecuada comparti-

mentalización intracelular constituyen un problema básico en el progreso de la

terapéutica antisentido. Recientemente se han desarrollado diferentes métodos

físicos (microinyección, permeabilización, electroporización, etc.), que mejoran

la captación celular de los oligonucleótidos en relación a los métodos conven-

cionales de conjugación o aquéllos que recurren a transportadores (liposomas,

lipoplexes, policationes, etc.). También puede recurrirse a la administración de

estos medicamentos en el tejido diana, como el fomivirsen administrado por in-

yección intravítrea directa en el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus.

La selectividad en la distribución permite mejorar la relación beneficio-

riesgo de numerosos medicamentos, lo que puede incrementar su potencial te-

rapéutico. Esta última consideración ha vuelto a poner de actualidad el concep-

to de "bala mágica", idealización introducida por Paul Erlich hace casi un siglo

y que gracias a la Biotecnología puede convertirse en una realidad20.

Los sistemas de transporte coloidal como liposomas, nanopartículas, mi-

crosferas, etc. han sido utilizados para prolongar el tiempo de circulación de

numerosas moléculas, protegerlas de la degradación y dirigirlas a tejidos diana.

Estos sistemas tienen dificultades para acceder a los tejidos sanos, debido, en-

tre otros factores, a su tamaño, especialmente si supera 20 nm, considerado el

tamaño crítico para la mayoría de los tejidos.

Los liposomas son opsomizados por las proteínas plasmáticas en la circu-

lación sistémica y reconocidos por el sistema reticuloendotelial (SRE) acumu-

168



lándose preferentemente en el hígado. Los liposomas son vehículos adecuados

para el transporte de péptidos y proteínas inmoduladoras debido a su absorción

linfática y a la captación y metabolismo por los macrófagos. Ello ha impulsado

el desarrollo de liposomas conteniendo interleuquina-2, factores de crecimiento

eritropoyético e interferones. Además, los liposomas, como algunas macromo-

léculas, pueden acumularse también en los tumores debido a la falta de drenaje

linfático normal y a la lenta velocidad de difusión.

Para evitar o reducir la captación por el SRE, se ha optado preferentemen-

te por incrementar la hidrofilidad superficial mediante sialoconjugados sintéti-

cos y más recientemente con PEG. Estos liposomas de lento aclaramiento han

sido utilizados para la vectorización activa y pasiva de medios diagnósticos y

terapéuticos.

Las mayores dificultades se plantean para dirigir los liposomas a aquéllos

tejidos donde normalmente no se acumulan. Ello ha obligado al desarrollo de

diferentes tipos de vectores como oligosacáridos, oligonucleótidos, péptidos,

proteínas, vitaminas, anticuerpos monoclonales y receptores.

En principio sería posible dirigir los liposomas a todo tipo de células,

siempre que los vectores sean adecuados, aunque algunos problemas como el

acceso a los tejidos y el rápido aclaramiento pueden disminuir las posibilidades

terapéuticas.

El desarrollo de los anticuerpos monoclonales representa una de las técnicas

más poderosas para dirigir fármacos, tóxicos, isotopos y enzimas a su lugar de

acción. El gemtuzumab es un anticuerpo recombinante humanizado dirigido fren-

te al antígeno CD33 y unido a la calicheamicina, un potente antibiótico tumoral.

Se trata del primer fármaco vectorizado introducido en quimioterapia y ha sido

aprobado por la FDA a finales del año 2000 en el tratamiento de la leucemia

mieloide aguda en casos de recidivas. Gemtuzumab se une al antígeno CD33, ex-

presado en el 80-90% de los pacientes con leucemia mieloide aguda, penetrando

en la célula y liberando el agente citotóxico que provoca la muerte celular.

El potencial terapéutico de estos agentes se ha incrementado desde la in-

troducción de la tecnología del hibridoma en los años 70 y actualmente se dis-

pone de fármacos inhibidores de la reactividad aloninmune y autoinmune, anti-

tumorales, antiplaquetarios antivirales, etc. En España se han introducido

recientemente transtuzumab, infliximab y rituzimab, aunque otros muchos se

encuentran en diferentes fases de desarrollo, alcanzando casi un 25% de todos

los productos obtenidos por Biotecnología21.

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A pesar de las ventajas potenciales que presentan al fijarse selectivamente

a las células diana, su incorporación a la terapéutica presentó mayores dificul-

tades de las inicialmente previstas. Entre ellas figuran la capacidad limitada de

penetración tisular que depende, entre otros factores, de las dimensiones del

anticuerpo. Los anticuerpos convencionales son proteínas de elevado peso mo-

lecular que presentan una baja capacidad de acceso a tejidos, especialmente

aquéllos que tienen escasa vascularización. En terapéutica oncológica con anti-

cuerpos monoclonales, la relación de concentraciones entre el tumor y la circu-

lación sistémica se incrementa lentamente durante varios días debido a la eli-

minación del anticuerpo y, en menor grado, a la captación tumoral22.

METABOLISMO Y EXCRECIÓN

Los péptidos y proteínas se eliminan del organismo por metabolismo y ex-

creción renal. El metabolismo se produce principalmente por proteolisis en di-

ferentes localizaciones del organismo como consecuencia de la amplia disper-

sión que presentan los enzimas proteoliticos. La velocidad y extensión de la

degradación metabólica es muy variada y depende de la estructura química, vía

de administración etc.

El tracto gastrointestinal constituye el ambiente más hostil para las proteí-

nas debido a los numerosos enzimas proteolíticos que se encuentran, a elevadas

concentraciones, a lo largo del tubo digestivo. La encapsulación con materiales

entéricos no es suficiente para proteger su integridad química durante el perio-

do de tiempo que transcurre entre la liberación y la incorporación a la circula-

ción sistémica. En el pasado se trató de superar este inconveniente asociando a

las proteínas inhibidores enzimáticos (p.e. aprotinina), pero actualmente su uso

está desaconsejado. Sin embargo, se han obtenido resultados esperanzadores in-

corporando las proteínas en partículas biodegradables mucoadhesivas, que con-

tienen inhibidores metabólicos unidos de forma covalente con diferentes polí-

meros23.

Una de las principales limitaciones de los agentes antisentido es la degra-

dación enzimática por las nucleasas que se produce en sangre y en el interior

de las células. La semi-vida de degradación de los oligonucleótidos que contie-

nen uniones fosfodiester es próxima a 5 minutos lo que impide su utilización

en clínica.

170



Ello ha impulsado el desarrollo de nuevos oligonucleótidos más estables

frente a las nucleasas y que mantengan su capacidad para fijarse al lugar de ac-

ción. Para mejorar la estabilidad metabólica se han modificado las uniones fos-

fodiester, los azúcares y las bases heterocíclicas. Los derivados mejor conoci-

dos son los fosforotionatos en los que los átomos de oxígeno del fosfato han

sido sustituidos por azufre. Sin embargo, aún estos derivados son metaboliza-

dos en animales experimentales en mayor extensión que las previsiones apoya-

das en los resultados de estudios en cultivos celulares. Por ello, se hace preciso

introducir mejoras en el perfil farmacocinético de los agentes antisentido, in-

crementando su estabilidad metabólica24.

La excreción renal se produce por los mismos mecanismos que afectan a

los fármacos de bajo peso molecular. Las macromoléculas menores de 68

kDa podrían experimentar una filtración glomerular, aunque la capacidad de

filtración depende también de la carga y rigidez de la molécula. La influen-

cia de la carga se pone especialmente de manifiesto con moléculas cuyo ra-

dio es superior a 2 nm. Después de la filtración, los péptidos complejos y las

proteínas son reabsorbidos en los túbulos proximales por endocitosis e hidro-

lizados a fragmentos peptídicos o aminoácidos que retornan a la circulación

sistémica. En consecuencia, sólo cantidades mínimas de las proteínas intac-

tas son detectadas en la orina. Los péptidos y proteínas pueden también ex-

perimentar una secreción tubular desde los capilares postglomerulares, acom-

pañada también de una degradación metabólica. Esta vía de eliminación es

utilizada por diversas hormonas como calcitonina, insulina, vasopresina, an-

giotensina II, etc.

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Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana

DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Aproximadamente, durante las dos últimas décadas se han producido, en

el conjunto de las actividades ligadas a la investigación genética en plantas,

una serie de innovaciones y cambios tecnológicos que se han englobado bajo la

denominación de biotecnología vegetal, y que constituyen una verdadera revo-

lución, ya no sólo de la investigación y el desarrollo agrario, sino de toda una

concepción de la agricultura tradicional y de la utilización económica de las

plantas. Sin duda, la capacidad de generar plantas transgénicas constituye una

de estas nuevas tecnologías sobre las que pivota el cambio global que se está

produciendo. Hoy día, prácticamente ya no hay ninguna especie vegetal culti-

vada importante para la que no se disponga de la capacidad de transgénesis.

Transgénesis vegetal mediante Agrobacterium tumefaciens

La transgénesis vegetal no se realiza en la actualidad de un modo único.

Los primeros desarrollos, todavía ampliamente utilizados, se basaron en la ca-

APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍARECOMBINANTE VEGETAL A LA TERAPÉUTICAHUMANAFernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid



174

pacidad natural de la bacteria Agrobacterium tumefaciens y relacionados para

integrar de forma estable parte de su material genético en el genoma de sus

plantas huésped. La manipulación subsiguiente del genoma de Agrobacterium

permitió disponer, en breve plazo, de vectores desarmados (exentos de la capa-

cidad de inducir enfermedad que poseen los aislados naturales de la bacteria)

para llevar a cabo integraciones estables de genes foráneos. El clonaje de estos

genes en los vectores de Agrobacterium permite que la bacteria los integre en

el genoma de las futuras plantas transgénicas. En general, el proceso de trans-

formación se complementa con un conjunto de tecnologías de cultivo in vitro

de tejidos vegetales, que permiten regenerar plantas enteras fértiles a partir de

determinados tejidos transformados cultivados. Como queda dicho, esta tecno-

logía de generación de plantas transgénicas se utiliza todavía ampliamente. Sin

embargo, más recientemente se han desarrollado otras formas de transforma-

ción de plantas, lo cual a su vez ha permitido ampliar el abanico de especies

transformables.

Otros métodos de transformación de plantas

De entre todos los desarrollos habidos desde las primeras transformaciones

de discos de hojas de tabaco con Agrobacterium, merecen destacarse dos por la

simplicidad que han añadido al proceso. En primer lugar la biolística, que im-

plica el disparo de microproyectiles de oro, wolframio, etc., recubiertos del

ADN que se desea integrar en el genoma de la planta. Esta técnica permite evi-

tar el uso de la bacteria en el proceso de transformación y es especialmente in-

teresante en los casos de especies vegetales que no son huéspedes naturales de

la bacteria, como es el caso de los cereales (en general de las plantas monoco-

tiledóneas). El otro desarrollo reciente es el que permite en algunas especies,

sobre todo experimentales, llevar a cabo la transformación con la bacteria di-

rectamente sobre las flores, lo que posibilita la obtención directa de semillas de

plantas transgénicas sin necesidad de recurrir al cultivo in vitro.

Genómica y proteómica vegetales

Disponer de plantas transgénicas constituye un hito importante en el de-

sarrollo de la Biotecnología Vegetal, pero no es el único. En efecto, la capaci-

dad para el análisis pormenorizado de los genomas vegetales, tanto en su ver-

tiente estructural como funcional, se ha desarrollado en paralelo con la trans-

génesis y está empezando a permitir la racionalización de muchos de los pro-

cesos clásicos de la mejora genética y, también de la propia transgénesis. La

nuevas disciplinas de la genómica y la proteómica, cuyas aplicaciones al estu-

dio del genoma humano están provocando toda una nueva forma de buscar y

diseñar fármacos, están también teniendo un fuerte impacto en la Biotecnolo-

gía Vegetal. La conjunción de ambas tecnologías supone un potencial enorme

de incidencia en procesos de desarrollo controlado de las plantas, así como de

su utilización para otras áreas biotecnológicas, como por ejemplo la farmacia.

Como en tantas otras ocasiones anteriores, el desarrollo tecnológico ha permi-

tido poner de manifiesto conceptos de índole más fundamental, en un proceso

de alimentación mutuo muy característico de todas las actividades de I+D. Así

por ejemplo, fenómenos como la cosupresión y el silenciamiento génico me-

diado por ARN se han descubierto y estudiado por primera vez en plantas,

gracias al propio desarrollo tecnológico de la Biotecnología Vegetal. Tras su

descubrimiento en plantas, se ha demostrado en los últimos 2-3 años la exis-

tencia de fenómenos similares en animales, incluido el hombre, incluyendo to-

do un nuevo sistema de regulación de la expresión génica basado en micro-

ARNs. Las implicaciones de este descubrimiento en las aproximaciones

terapéuticas a enfermedades, tanto genéticas como infecciosas, se están reve-

lando en la actualidad como de una enorme importancia.

GENERACIONES DE PRODUCTOS VEGETALESBIOTECNOLÓGICOS

Primera generación de plantas y productos vegetalestransgénicos

Las primeras variedades transgénicas de algunas plantas de gran cultivo

mundial como, por ejemplo, el maíz, la soja, la colza o el algodón, ya han lle-

gado al mercado y tanto ellas como sus productos derivados están en estos mo-

mentos en el centro de una fuerte polémica social que se está desarrollando en

varios frentes a diferentes niveles. Los ejemplos citados forman parte de lo que

se ha dado en llamar la primera generación de plantas y productos transgéni-

cos. La principal característica de esta primera generación de productos vegeta-

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les transgénicos es que las modificaciones genéticas que se les han introducido

van dirigidas a mejorar características de las plantas que son de interés funda-

mentalmente para sus productores, o sea, para los agricultores. Así, plantas que

expresan constitutivamente un gen de una toxina para insectos procedente de

una bacteria, que sobreexpresan una enzima que inactiva la acción de un herbi-

cida o que son resistentes a una virosis gracias a la resistencia conferida por la

producción en planta de fragmentos del propio virus, son plantas de un interés

obvio e inmediato para el productor primario. La OCDE, que ha venido estu-

diando intensamente el fenómeno de la Biotecnología desde muchos ángulos

en los últimos años, ha definido esta primera generación de cultivos transgéni-

cos como que "se ha centrado en características agronómicas para conferir ma-

yores rendimientos en las cosechas mediante la reducción de pérdidas y espa-

ciamientos menores entre hileras, y para reducir costes de insumos mediante la

disminución del uso de plaguicidas y herbicidas". Otras dos características de

los productos de la primera generación son su irrelevancia para el consumidor

final, así como que no suponen un cambio de mercado. Se trata, en definitiva,

de plantas cuyos productos van dirigidos a los mismos mercados que sus pa-

rientes no transgénicas y que no suponen cambios sustanciales para el consu-

midor, excepto quizá su menor precio, consecuencia de unos menores costes de

producción.

Segunda generación de plantas y productos vegetalestransgénicos

Existen ya una segunda y una tercera generación de plantas transgénicas,

cuya llegada al mercado se está produciendo aún con timidez, pero de las que

se espera mucho mayor impacto comercial en los próximos años. De nuevo se-

gún la OCDE, la segunda generación de plantas transgénicas "se centra en una

serie de caracteres relacionados con la calidad, que mejorarán su uso en los sis-

temas de producción de alimentos, así como sus características de uso finales.

Cosechas con modificaciones en las grasas, aceites y almidones para mejorar el

procesamiento y la digestibilidad, tales como sojas de alto contenido en ácido

oleico, colzas de alto estearato o ácido láurico (cultivándose ya en los Estados

Unidos), maíz de bajo fitato o ácido fítico. Desde un punto de vista industrial

se pueden esperar, por ejemplo, plantas de algodón coloreado que eviten o dis-

minuyan la necesidad de tintes químicos (algunas ya disponibles)". Se aprecian

176



en esta segunda generación algunos cambios sustanciales en relación con la

primera. En primer lugar hay un cambio de mercado final. Las modificaciones

genéticas ya no se hacen pensando fundamentalmente en el productor, sino en

el consumidor del producto final al cual se le proporciona un producto de ma-

yor calidad. Por supuesto, es posible combinar características típicas de esta se-

gunda generación con otras de la primera, si se desea o el mercado lo deman-

da. Así por ejemplo, es posible producir patatas con unas características de

almidón más adecuadas para su congelación y fritura directa en freidora, que

además sean resistentes al escarabajo de la patata mediante la expresión de la

toxina bacteriana. La otra característica de algunos de los productos de la se-

gunda generación es que presentan un aspecto de interfase con cuestiones más

clásicamente relacionadas con problemas de salud humana que con considera-

ciones meramente agroalimentarias. Por ejemplo, la producción de aceite de

soja con un mayor contenido en ácido oleico se hará teniendo muy en cuenta

factores de salud relacionados con enfermedades cardiovasculares, además de

otros factores de producción agraria. O algunas de las modificaciones en los

metabolismos de hidratos de carbono de plantas, como la patata o algunos ce-

reales, considerarán el tamaño creciente de mercado que suponen los consumi-

dores diabéticos.

Tercera generación de plantas y productos vegetalestransgénicos

Si la segunda generación de productos biotecnológicos vegetales supone un

grado de sofisticación considerable en relación con los de la primera, será así

más aún con los productos de la tercera generación. La OCDE predice que estas

plantas "producirán más factores de calidad de cara a un producto final tales co-

mo productos de nutricéutica o 'alimentos funcionales', que son cosechas modi-

ficadas para producir medicinas o suplementos alimentarios en la planta. Estas

plantas podrían inducir inmunidad a enfermedades o mejorar características sa-

nitarias de los alimentos tradicionales, por ejemplo colza con β-carotenos o

arroz suplementado con vitamina A. También se prevén plantas que fijen nitró-

geno con mayor eficacia, disminuyendo por tanto la necesidad de abonos o

plantas resistentes a la sequía, las inundaciones y las temperaturas extremas, así

como plantas que se puedan utilizar en procesos de biorremediación de suelos y

aguas. También se ha sugerido la posibilidad de producir plantas de algodón in-

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combustible o que no se arrugue, o plantas de colza que produzcan plásticos

biodegradables (esto ya se ha conseguido)". Es, en estos productos de tercera

generación, donde se producirá el verdadero cambio que aporta la Biotecnología

a la producción vegetal. Los mercados a los que se dirigen estos productos pue-

den ser tradicionales del producto agrario, pero serán básicamente mercados

nuevos. La interfase entre la producción vegetal e industrias que son en estos

momentos ajenas a la agricultura, o utilizan productos agrarios de manera muy

minoritaria, se verá fuertemente incrementada cuando estos productos alcancen

masivamente el mercado. De entre todas estas industrias es quizá la industria

farmacéutica la que se prevé que se afecte antes en sus estructuras de produc-

ción de determinados productos por el impacto de la Biotecnología Vegetal. Se

prevén dos niveles de impacto entre productos biotecnológicos vegetales y la

producción de medicamentos. El primero es el de utilizar las plantas como bio-

factorías de producción de medicinas o productos de interés farmacéutico. Esta

actividad constituye el factor más importante de lo que se ha venido a llamar

"agricultura molecular" (molecular pharming) y se describe con algo más de de-

talle en el siguiente apartado. La otra constituye una verdadera síntesis entre la

agricultura, la alimentación y la farmacia y es la base de una nueva disciplina

científica emergente, la "nutricéutica", como parte de un concepto más general,

que es el del "alimento funcional". Conferir una funcionalidad sanitaria al hecho

de alimentarse supone profundizar en una tendencia creciente en las sociedades

avanzadas, como es la de la "comida sana", confiriendo al hecho de alimentarse

una vertiente curativa, o más bien, y en mayor medida, preventiva. Quedan

mencionadas anteriormente las posibilidades de plantas con suplementos vitamí-

nicos, pero quizá el paradigma de lo que puede ser esta nueva actividad farma-

céutica lo constituyan las llamadas "vacunas comestibles". Esta idea intenta ex-

plotar la inmunidad mucosal de las personas y los animales (también

aplicaciones veterinarias) mediante la presentación de antígenos con potencial

vacunal a través de alimentos procedentes de plantas transgénicas que expresen

dichos antígenos. Algunas de las primeras pruebas hechas en animales de expe-

rimentación han resultado muy prometedoras y las pruebas clínicas ya han em-

pezado en algún caso. Además de la posible implantación de este tipo de vacuna

alimenticia en las poblaciones infantiles de países desarrollados, lo cual resulta

algo cuestionable desde el punto de vista de la rentabilidad y ventajas económi-

cas y de gestión, esta aproximación presenta una vertiente social de indudable

valor, como es el poder alcanzar segmentos de población que en estos momen-

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tos no están sometidos a programas de vacunación, fundamentalmente por moti-

vos económicos, especialmente en países no desarrollados. Ello podría incluir

enfermedades infecciosas tropicales de baja incidencia en países desarrollados,

como el cólera, la malaria o la fiebre amarilla, para las que se podrían plantear

vacunaciones fundamentadas en vacunas comestibles basadas en productos de

alto consumo (yucas, bananas, etc.).

PRODUCCIÓN DE FÁRMACOS EN PLANTAS

Producción en plantas transgénicas

La agricultura molecular ha comenzado su andadura fundamentalmente

orientada a la producción de fármacos en plantas y, de entre ellas, los primeros

productos que han despertado el mayor interés entre los biotecnólogos vegeta-

les han sido las proteínas terapéuticas. Existen ya en la literatura científica nu-

merosos ejemplos de plantas transgénicas productoras de proteínas humanas

con valor terapéutico. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten ser

muy optimista con respecto a la evolución creciente de esta tecnología, pero al

tiempo ilustran con claridad la complejidad de situaciones que se pueden pro-

ducir al generar las plantas productoras. Algunos de los puntos que se están re-

velando claves para el éxito o el fracaso de esta aproximación global son tan

variados como, por ejemplo, las enormes diferencias de expresión del transgén

que se encuentran en los distintos casos, la problemática de extracción de las

proteínas producidas, el grado de similitud en el procesamiento post-traduccio-

nal de las proteínas, etc. Cada uno de estos puntos va a requerir un esfuerzo de

afinamiento de las condiciones de producción que necesitará soluciones par-

cialmente distintas para cada caso, por lo que es difícil, en estos momentos, ir

mucho más allá en las generalizaciones. En la actualidad no hay todavía ningu-

na proteína terapéutica humana producida en plantas que se encuentre en el

mercado, pero ya hay algunas en las fases de pruebas clínicas. Quizá la más

avanzada sea un anticuerpo producido en tabaco que se pretende utilizar, a tra-

vés de chicles de mascar, en el tratamiento y prevención de las caries y enfer-

medades infecciosas de las encías. Los costes menores de producción de gran-

des volúmenes de un anticuerpo de estas características en plantas de tabaco

posiblemente permitan lanzar al mercado ese tipo de producto sin disparar el

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precio para el consumidor final. Al margen de los problemas nuevos que se va-

yan poniendo de manifiesto en la producción de fármacos en plantas según se

vayan desarrollando los procesos, esta estrategia de producción presenta algu-

nas ventajas inherentes respecto de los métodos tradicionales de extracción de

tejidos humanos y animales o de procesos de fermentación. Queda ya mencio-

nado el probable menor coste, pero hay más. Por ejemplo, el de la seguridad

sanitaria del fármaco. La reciente crisis de las encefalopatías espongiformes

bovinas, y su probable relación con algunas enfermedades humanas del tejido

nervioso, ha puesto claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar, desde teji-

dos animales en los procesos de extracción, patógenos de difícil detección o

eliminación. Este riesgo se elimina totalmente en las plantas, ya que éstas no

permiten la multiplicación de estos patógenos (priones, virus del SIDA, virus

de las diferentes hepatitis, etc.). Además, las plantas pueden constituir el único

sistema capaz de producir eficientemente ciertas proteínas humanas, tales como

reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un im-

pacto negativo en los animales transgénicos o en las células animales cultiva-

das en las que se expresaran. Otra consideración es la de capacidad de produc-

ción del fármaco, la cual puede llegar a ser limitante en algunos casos. Un caso

citado con frecuencia de esta última situación es el del potencial tratamiento

del cáncer mediante inmunoterapia. Cálculos efectuados en los Estados Unidos

predicen que cada paciente puede llegar a necesitar 10-200 mg de anticuerpo

recombinante antitumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnóstico de nuevos ca-

sos al año (650.000 de cánceres de mama, pulmón y colon sólo en los Estados

Unidos), puede llegar a crear una demanda de unos 130 kg por año en ese país.

Prácticamente, sólo la producción en plantas puede asegurar ese nivel de pro-

ducción a un precio razonable.

Producción mediada por virus vegetales

El punto de la producción de grandes cantidades del fármaco que se de-

sea producir ha puesto de manifiesto un problema al que se enfrentan las plan-

tas transgénicas como vía de producción. Como se ha mencionado previamen-

te, con la tecnología disponible en la actualidad es prácticamente imposible

predecir los niveles de expresión del gen foráneo que se alcanzarán en una lí-

nea transgénica determinada y, de todas formas, parece razonable pensar que

la expresión a partir de un promotor tiene que presentar límites cuantitativos

180



difíciles de sobrepasar. Por otra parte, establecer un línea transgénica producti-

va y genéticamente estable puede llevar muchos meses, incluso años. Situa-

ciones como la de los anticuerpos antitumorales, mencionada anteriormente,

son claramente incompatibles con estas limitaciones, pues se trata de fármacos

personalizados de los que se necesitan grandes cantidades en períodos breves

de tiempo (semanas a unos pocos meses). Este tipo de consideraciones, junto

con algunas otras de carácter más cercano a la estrategia comercial, han hecho

que bastantes investigadores y empresas de Biotecnología se hayan fijado en

los virus vegetales como vehículos de expresión de los genes foráneos. Los

virus vegetales suelen ser agentes infecciosos muy simples genéticamente, por

lo que su manipulación genética no resulta excesivamente compleja. General-

mente se multiplican hasta alcanzar niveles de acumulación de viriones bas-

tante elevados, lo cual se encuentra también para algunos de sus productos gé-

nicos individuales y, por extrapolación, para proteínas producidas a partir de

genes foráneos introducidos en ellos. Además, desde el punto de vista de la

rapidez de producción, resulta mucho más rápido generar un virus transgénico

que una planta transgénica. Estas características hacen de los virus vehículos

de expresión muy interesantes y que se están desarrollando rápidamente en la

actualidad. Una consideración adicional para algunas aplicaciones es que es

factible combinar ambas estrategias (plantas transgénicas y vectores virales),

lo cual permitiría elegir lo mejor de ambas.

La estructura de la empresa biotecnológica farmacéuticavegetal

El rápido desarrollo de la Biotecnología Vegetal está contribuyendo tam-

bién, junto con otros desarrollos biotecnológicos, a la profunda transformación

que se está experimentando en la actualidad en la estructura empresarial de va-

rios sectores industriales ligados a las ciencias de la vida. Hay características

muy llamativas de la nueva situación. Por un lado, surgen constantemente (sobre

todo en los Estados Unidos) nuevas pequeñas empresas con un alto contenido

tecnológico que contribuyen de manera muy significativa al rápido desarrollo de

la Biotecnología. Muchas de estas empresas fracasan en su proyecto empresarial

o son finalmente absorbidas por otras empresas mayores. Por otro lado, este

proceso de absorción empresarial se da también entre grandes empresas multina-

cionales, lo cual está generando una situación de concentración empresarial sin

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precedentes. Otra característica nueva es la de la creación de un sector industrial

completamente nuevo, que se ha venido a denominar de empresas de ciencias

de la vida. Este tipo de empresas se diferencian de las clásicas empresas farma-

céuticas o de productos agrarios o alimentarios en que integran en su seno am-

bos mundos, reflejo de la interfase creciente entre ambas actividades, que se ha

comentado varias veces a lo largo de este artículo. En lo referente al futuro es

razonable pensar que ambas tendencias (nuevas pequeñas empresas tecnológicas

y grandes grupos empresariales) seguirán desarrollándose, creando una estructu-

ra de producción farmacéutica nueva. Sin embargo, el fenómeno es todavía muy

reciente y habrá que estar atento a su evolución.

BIBLIOGRAFÍA

El número de trabajos que abordan de manera pública los temas referidos a la produc-

ción de fármacos en plantas mediante Biotecnología es aún limitado, dada su relativa

novedad. Además, bastantes de estos trabajos se publican en revistas especializadas de

investigación en plantas de menor difusión en los ambientes médicos o farmacéuticos.

Sin embargo, en los últimos años se han publicado un número importante de buenos ar-

tículos de revisión sobre este tema, que proporcionan un visión general y un buen nivel

de información al lector interesado. Se presenta a continuación, como orientación, una

lista de algunas de estas revisiones.

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Innovación tecnológica y nuevas terapias

INTRODUCCIÓN

Las terapias dirigidas se han convertido en la punta de lanza de la in-

novación en nuevas tratamientos. Dentro de ellas, los anticuerpos son el

ejemplo más claro y quizás más revolucionario. Los anticuerpos monoclo-

nales están cada vez más instaurados en la farmacopea. Hoy en día, esta-

mos asistiendo a un nuevo paradigma en la producción y utilización clíni-

ca de estas terapias, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales

totalmente humanos. Esta tecnología presenta claras ventajas en su utiliza-

ción clínica sobre los anticuerpos monoclonales no totalmente humanos.

Entre ellos, el panitumumab representa el mejor ejemplo dentro del área

de la Oncología.

INNOVACIÓN TECNOLÓGICA YNUEVAS TERAPIAS. OBTENCIÓNDE ANTICUERPOS MONOCLONALESTOTALMENTE HUMANOS:PANITUMUMABJosé Luis Motellón. Amgen S.A.

La innovación en la producción de anticuerpos ha permitidola producción de anticuerpos totalmente humanizados. Unclaro ejemplo es el panitumumab. A lo largo de este capítulose presentan las aportaciones y diferencias de este tipo deanticuerpos sobre los tradicionales, y en concreto, lasventajas clínicas del panitumumab en su uso en Oncología.



186

DESARROLLO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES TOTALMENTEHUMANOS

Los anticuerpos son biomoléculas de naturaleza proteica que se caracteri-

zan por poseer la capacidad de reconocer y unirse específicamente a un antíge-

no. En el año 1975, Kholer y Milstein describieron que si se fusionaban células

plasmáticas productoras de anticuerpos con una célula de un tumor llamado

mieloma, se conseguían células, las llamadas hibridomas, que tenían las pro-

piedades de los dos tipos celulares iniciales, esto es: eran células productoras

de anticuerpos, como las células plasmáticas y que podían mantenerse de ma-

nera indefinida en cultivo (como las células mielomatosas). La posterior selec-

ción de la mejor de dichas células y su expansión, dando lugar a un clon, per-

mitía producir anticuerpos procedentes de un único clon y, por lo tanto,

homogéneos (anticuerpo monoclonales, AcM) en cantidades ilimitadas1. Ini-

cialmente, la inmunización con el antígeno para obtener las células plasmáticas

se hacía sobre roedores (habitualmente ratones), por lo que los AcM obtenidos

eran de ratón. Esto limitaba su utilización en la clínica, ya que su inyección en

humanos generaba una respuesta inmunológica frente al propio AcM, la deno-

minada HAMA (siglas en inglés de Human anti-murine antibody) que neutrali-

zaba la posterior utilización del anticuerpo y limitaba su uso, en muchos casos,

a una única administración2,3. Por consiguiente, la investigación en la utiliza-

ción terapéutica de los AcM ha ido, en buena medida, dirigida a disminuir di-

cha capacidad inmunogénica (3)

El primer intento ha consistido en producir AcM quiméricos en los que la

región variable del anticuerpo, que es la que se une al antígeno (aproximada-

mente un 34% de la proteína), sigue siendo de origen murino, mientras que el

resto del anticuerpo es de origen humano4-6. Entre los AcM quiméricos aproba-

dos para ser utilizados en la clínica están, por ejemplo, rituximab (Rituxan®),

cetuximab (Exbitux®) e infliximab (Remicade®). Si bien la utilización de es-

tos AcM quiméricos ha reducido significativamente la inmunigenicidad de los

AcM, el desarrollo de anticuerpos humanos frente a la quimera (o respuesta

HACA, human anti-chimeric antibody) sigue siendo un problema potencial-

mente importante, que requiere monitorización de los pacientes a los que se les

administra, así como, en algunos casos, el tratamiento concomitante con corti-

costeroides3.

Otro avance en la minimización de la inmunogenicidad producida por

los AcM lo constituye la producción de AcM 'humanizados', proceso inicial-

mente llamado reshaping con los que se consigue que los AcM contengan só-

lo un 5 a 10% de proteína murina4. Esta técnica consiste en utilizar tecnolo-

gía de DNA recombinante para insertar las regiones determinantes de la

complementariedad (CDRs- complementary determining regions) de origen

murino en un anticuerpo humano7. Con ello se esperaba poder eliminar prác-

ticamente la inmunogenicidad, aunque en realidad todavía se sigue observan-

do respuesta inmunogénica frente a dichos AcM humanizados, la llamada

HAHA (human anti-human antibody)3. Por otra parte, el proceso de humani-

zación no es simple, ya que en ocasiones se compromete la afinidad por el

antígeno3,7. Bevacizumab (Avastin®) y trastuzumab (Herceptin®) son anti-

cuerpos humanizados.

La generación de AcM totalmente humanos es un paso adelante en la con-

secución de AcM todavía más seguros y eficaces3. Entre las técnicas que se

han utilizado para producir AcM totalmente humanos, está la creación de rato-

nes transgénicos (XenoMouse®)4,8,9. La Figura 1 ilustra los pasos implicados

en la creación del XenoMouse®. En primer lugar, se toman células embriona-

rias de ratón, y mediante técnicas de deleción de genes diana, se

inactivan los loci de los genes que codifican para la inmunoglobuli-

nas (Ig) endógenas de ratón. La descendencia consiste en ratones ho-

mocigóticos incapaces de producir inmunoglobulinas murinas. A

continuación se toman grandes fragmentos de DNA correspondientes

a la cadena pesada y la cadena ligera de las Ig humanas se clonan y

se introducen también en

células embrionarias de

ratón. Finalmente, estas

dos cepas de ratones

(una incapaz de producir

Ig y otra que produce

tanto Ig humanas como

de ratón) se cruzan entre

sí, para producir el Xe-

noMouse®, que es capaz

de expresar Ig totalmen-

te humanas e incapaz de

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Fig. 1. Tecnología de laproducción deXenoMouse®

producir las Ig murinas. Estas cepas de ratón se pueden utilizar para producir

hibridomas, con la diferencia de que los AcM producidos serán humanos y no

murinos (4).

PANITUMUMAB

Panitumumab es el primero de estos AcM totalmente humanos producidos

por tecnología XenoMouse®10 en incorporarse al arsenal terapéutico, puesto

que el pasado 27 de septiembre de 2006, Amgen anunció la aprobación por

parte de la FDA de panitumumab (con el nombre comercial de Vectibix™) pa-

ra el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastásico11. Por lo que

respecta a Europa, el pasado 28 de abril de 2006 fue presentada la solicitud de

autorización de comercialización de panitumumab en la EMEA.

Panitumumab es un anticuerpo monoclonal IgG2 totalmente humano que se

une con alta afinidad al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr),

que se encuentra sobreexpresado en el 25-77% de los cánceres colorrectales12,13.

El bloqueo de la vía de señalización del EGFr en las células cancerosas por pani-

tumumab determina no sólo la inhibición de la tirosina quinasa del receptor y la

proliferación celular, sino también otros efectos que son críticos para la supervi-

vencia tumoral, crecimiento y metástasis10. A continuación se resumen los datos

de los ensayos clínicos de panitumumab en cáncer colorrectal.

Farmacocinética de panitumumab, bases para la dosificación

Un estudio de fase 1 llevado a cabo por Weiner et al. en pacientes con

cáncer colorrectal, de pulmón no microcítico, renal, de próstata, páncreas o

esófago, evaluó los datos farmacocinéticos de panitumumab administrado a do-

sis de 0,01 mg/kg a 5 mg/kg una vez por semana, 6 m/kg/cada dos semanas y

9mg/kg/cada tres semanas. La dosis de 2,5 mg/kg/semana fue escogida como

dosis óptima sobre la base de la incidencia de exantema, saturación del aclara-

miento no linear de panitumumab y consecución de los niveles séricos asocia-

dos con la regresión tumoral en modelos. El modelado farmacocinético utiliza-

do en este estudio predijo que la dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas y 9

mg/kg/cada tres semanas conseguirían concentraciones mínimas similares a 2,5

mg/kg/semana (aproximadamente 50 mcg/mL). Los resultados farmacocinéti-

188



cos de los pacientes de este estudio confirmaron esto, y en consecuencia la do-

sis de 6 mg/kg/cada dos semanas se escogió para los ensayos de fase 314.

Eficacia terapéutica en cáncer colorrectal (CCRm)

Estudio pivotal de fase 3

Peeters et al. llevaron a cabo un estudio multicéntrico, abierto, aleatorizado y

controlado de panitumumab administrado a dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas

junto con el mejor tratamiento de soporte frente al mejor tratamiento de soporte

solo en pacientes con CCRm con progresión documentada radiológicamente (du-

rante o en los seis meses tras la quimioterapia más reciente consistente en fluoro-

pirimidinas, irinotecan y oxaliplatino), los pacientes tenían un estado funcional

ECOG de 0-2 y al menos un 1% de la membrana de las células tumorales presen-

taban tinción de EGFr por técnica de inmunohistoquímica (evaluada centralmen-

te). A los pacientes en el brazo del tratamiento de soporte que progresaban se les

permitía que se cruzasen a recibir panitumumab en un protocolo aparte. Las res-

puestas tumorales por RECIST modificado se analizaron mediante un proceso cie-

go de valoración y revisión centralizada en las semanas 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48,

y cada 12 semanas a partir de entonces hasta progresión. La valoración principal

del estudio era determinar si panitumumab mejoraba la supervivencia libre de pro-

gresión frente al tratamiento de soporte. Otros objetivos eran seguridad, supervi-

vencia global, tasa de respuesta objetiva y duración de la respuesta. Un total de

463 pacientes fueron aleatorizados (231 en el brazo de panitumumab más trata-

miento de soporte y 232 en el brazo de tratamiento de soporte solo) con caracte-

rísticas basales bien equilibradas entre los dos grupos. Considerando todos los pa-

cientes, 67 (14%) tenían una puntuación ECOG de 2, 172 (37%) habían recibido

al menos 3 líneas previas de quimioterapia (el 100% había recibido al menos 2 lí-

neas), y la mediana de edad era de 63 años15.

Se observó una mejora significativa de la supervivencia libre de progre-

sión en el brazo panitumumab (p<0,0001) con una disminución en la tasa de

progresión relativa del 46% en los pacientes que recibieron panitumumab fren-

te a los que recibieron tratamiento de soporte (HR= 0,54, IC 95%: 0,44, 0,66).

Ya en la primera valoración programada para la semana 8, un mayor porcentaje

de pacientes estaban vivos sin progresión en el grupo panitumumab que en el

grupo control (49% vs 30%, respectivamente); con una diferencia que conti-

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nuaba hasta las semana 40 (Figura 2). Un análisis de subgrupos demostró un

efecto coherente de panitumumab en función del estatus del ECOG, regímenes

de quimioterapia previa, estatus del EGFr o la edad. Debido probablemente al

diseño cruzado, un análisis interino de la supervivencia global mostró que no

190



Tabla 1. Mejor respuesta objetiva de panitumumab más mejor tratamiento desoporte frente a tratamiento de soporte solo15

Panitumumab másAnálisis primario, tratamiento de soporte Tratamiento de soporteRevisión centralizadaa (n= 231) solo (n= 232)

Respuesta parcial- n (%) 19 (8) 0 (0)

Enfermedad estable -n (%) 64 (28) 24 (10)

Control de la enfermedad(RP más EE) - n (%) 83 (36) 24 (10)

Tiempo hasta respuesta-semanasMediana (min, máx) 8 (97, 15) n/a

Duración de la respuesta-semanasMediana (min, máx) 17 (4, 40) n/a

aPor RECIST modificado, las tasas de respuesta se confirmaron al menos 4 semanas tras laconsecución del primer criterio de respuesta.

aAnálisis primario, conjunto de todos los análisis aleatorizados, radiologíacentral.

Figura 2. Estimadode Kaplan-Meiera

de supervivencialibre de progresión

de panitumumabmás tratamiento de

soporte frente atratamiento desoporte solo15.

había diferencias entre los dos grupos con un hazard ratio de 0,93 (IC 95%:

0,73, 1,19). Las mejores respuestas objetivas vistas en este estudio y en el estu-

dio cruzado se resumen en las Tablas 1 y 215.

Más pacientes en el grupo de panitumumab con tratamiento de soporte

frente al tratamiento de soporte sólo presentaron toxicidades cutáneas (91% vs

15% con exantema grado 3 /4 en el 14% y 0% respectivamente). También se

observaron: fatiga (24% vs 15%), dolor abdominal (23% vs 17%), náusea

(22% vs 15%), y diarrea (21% vs 11%) respectivamente. Doce pacientes (5%)

presentaron potenciales reacciones a la infusión (ninguna fue de grado 3 /4); 1

paciente interrumpió panitumumab debido a una reacción de hipersensibilidad

de grado 215.

Estudio de fase 2

Este estudio llevado a cabo por Malik et al. era multicéntrico, abierto, de

un único brazo para evaluar la seguridad y la eficacia de panitumumab en mo-

noterapia en pacientes con CCRm que habían fracasado al tratamiento con 5-

Fu con o sin leucovorin e irinotecán u oxaliplatino o ambos. La cohorte A in-

cluyó pacientes con tinción de EGFr por inmunohistoquímica de 2+ ó 3+ en al

menos el 10% de las células tumorales y la cohorte B incluyó pacientes con

suma de las tinciones de EGFr de 1+, 2+ y 3+ en al menos el 10% de las célu-

las tumorales, pero con suma de 2+ y 3+ en menos del 10% de las células tu-

morales. Panitumumab se administró como infusión IV a 2,5 mg/kg/semana

durante 8 ciclos hasta progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o

muerte. Un total de 148 pacientes recibieron al menos una dosis de panitumu-

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Tabla 2. La mejor respuesta objetiva de panitumumab más tratamiento desoporte en el Estudio Cruzado15

Revisión local Pacientes

Pacientes que recibieronpanitumumab 174

Respuesta completa - n (%) 1 (1)

Respuesta parcial- n (%) 16 (9)

Enfermedad estable - n (%) 55 (32)

Control de la enfermedad(RP más EE) - n (%) 72 (42)

mab con una media de edad de 59 años (21-88 años), 111 (75%) con un estado

funcional ECOG de 1, y 65 (44%) habían recibido 3 agentes quimioterápicos

previos. Se observó control de la enfermedad en 43 (41%) de los pacientes en

la cohorte A y 13 (30%) de los pacientes en la cohorte B. La duración mediana

de la enfermedad estable fue 18,3 semanas (IC 95% 16,7-26,4) para los pacien-

tes en la cohorte A y 26,1 semanas (IC 95% 16,3 - 35,9) para los pacientes en

la cohorte B. Los resultados de eficacia se muestran en la Tabla 316.

Los cuatro acontecimientos adversos grado 3/ 4 relacionados con el trata-

miento notificados con mayor frecuencia fueron exantema 5 (3%), fatiga 4

(3%), vómitos 2 (1%) y náusea 1 (1%). Acontecimientos adversos relacionados

con toxicidad cutánea fueron notificados por 141 pacientes (95%) y 5% eran

grado 3 y ninguno grado 4. Una reacción relacionada con la infusión se obser-

vó en un paciente que no requirió modificaciones de la dosis. No se observaron

anticuerpos anti-humanos en ninguno de los 145 pacientes testados16.

192



Tabla 3. Resultados de Eficacia para el estudio de fase 2 en monoterapia depanitumumab en CCRm16

Parámetro de Cohorte A Cohorte B Totaleficacia (n= 105) (n= 43) (N= 148)

Respuesta global,n (%) 7 (7%) 6 (14%) 13 (9%)

Enfermedad estable,n (%) 36 (34%) 7 (16%) 43 (29%)

Enfermedadprogresiva, n (%) 35 (33%) 24 (56%) 59 (40%)

Medianaa (IC 95%)Duración de laenfermedad estable(Revisióncentralizada) 18,3 (16,7, 26,4) 26,1 (16,3, 35,9) 24,7 (17,0, 26,4)

Medianaa (IC 95%)Supervivencia sinprogresión, semanas 16,0 (9,6, 16,4) 8,3 (8,0, 16,3) 13,6 (8,3, 16,1)

Medianaa (IC 95%)Supervivenciaglobal, semanas 39,9 (23,3, 44,7) 37,5 (24,1, 47,7) 37,6 (25,6, 42,4)

aMediana de Kaplan-Meier

Estudios clínicos en primera línea en CCRm

En un estudio de fase 2, de dos partes, brazo único, llevado a cabo

en pacientes con CCRm, los pacientes fueron tratados con panitumumab

2,5 mg/kg/una vez por semana y IFL (parte 1) o FOLFIRI (parte 2; en-

mienda al protocolo debido a la toxicidad del esquema IFL). Los criterios

clave de eligibilidad incluyeron estatus ECOG de 0 ó 1, no tratamiento

previo con quimioterapia, expresión de EGFr en al menos el 10% de las

células tumorales. La valoración principal fue la incidencia de diarrea

grado 3 /4. Diecinueve pacientes se incluyeron en la parte 1 y 24 pa-

cientes en la parte 2, 14 (73%) y 19 (79%), respectivamente, de los pa-

cientes presentaron control de la enfermedad (incluye respuestas comple-

tas , respues tas parc ia les y enfermedad es table) . La mediana de

supervivencia sin progresión fue de 5,6 meses y 10,9 meses, y la supervi-

vencia mediana global fue de 16,8 meses y no estimable (23 de los 24

pacientes seguían vivos en el momento del análisis). La incidencia de

diarrea grado 3 /4 fue 11 (58%) y 6 (25%) para la parte 1 y la parte 2,

respectivamente. Todos los pacientes (de ambas partes) presentaron toxi-

cidad cutánea, de los cuales 3 (16%) y 4 (17%) eran de grado 3 /4 para

la parte 1 y parte 2, respectivamente. No se observaron reacciones a la

infusión graves o formación de anticuerpos anti-humanos inducidos por

panitumumab17.

CONCLUSIÓN

La innovación tecnológica en el desarrollo de AcM ha ido en la línea de

disminuir cada vez más el componente exógeno, generalmente murino, de los

mismos para minimizar su inmunogenicidad, lo que se espera que se asocie

con una mejora en su perfil de eficacia y seguridad. Panitumumab es el primer

AcM totalmente humano aprobado para ser utilizado en la clínica. En concreto,

la FDA lo ha aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal

metastásico con sobreexpresión de EGFr en progresión durante o después del

tratamiento con esquemas de quimioterapia que contengan fluoropirimidinas,

irinotecan y oxaliplatino18. Actualmente, panitumumab está en fase de registro

por la EMEA.

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Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA

ABREVIATURAS

BWP Biologics Working Party (previamente Biotechnology Working

Party)

CHMP Committee for Human Medicinal products (previamente CPMP)

COMP Committee for Orphan Medicinal Products

CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (actualmente

CHMP)

CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products

EM Estado(s) Miembro(s)

EMEA European Medicines Agency

HMCP Committee for Herbal Medicinal Products

EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOSBIOTECNOLÓGICOS EN LA AGENCIA EUROPEADE MEDICAMENTOS (EMEA)BWP (GRUPO DE BIOLÓGICOS) Y CHMP(COMITÉ DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO)Sol Ruiz y Gonzalo CalvoAgencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios



198

ICH International Conference for Harmonization of Technical Requi-

rements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

OMS Organización Mundial de la Salud

PhEur Farmacopea Europea

RMS Reference Member State

UE Unión Europea

INTRODUCCIÓN

Durante la década de los 80, los avances en ingeniería genética y en el

establecimiento y cultivo de líneas celulares han permitido la obtención de

multitud de proteínas terapéuticas (ej. eritropoyetina, hormona de crecimien-

to, interferón) que nunca hubiese sido posible obtener en cantidad suficiente

de sus fuentes naturales. Además, el desarrollo de las técnicas de ingeniería

de proteínas ha permitido disponer de proteínas modificadas respecto a sus

equivalentes naturales que presentan una mejor eficacia clínica, un mejor

perfil de seguridad o una nueva aplicación terapéutica. Así, se encuentran

disponibles análogos de insulina o eritropoyetina, (ej. insulina lispro, darbe-

poetin alfa), proteínas de fusión que combinan características de dos proteí-

nas diferentes (ej. etanercept), proteínas conjugadas a polietilénglicol (ej.

peginterferon, pegfilgrastim) o anticuerpos monoclonales "humanizados" (ej.

alemtuzumab).

Desde la creación de la agencia europea de medicamentos (EMEA) en

1995, la evaluación de estos medicamentos obtenidos mediante tecnología

del ADN recombinante se realiza, por requerimiento legal, mediante un pro-

cedimiento de tipo centralizado, es decir, efectuado en todos los países de la

Unión Europea a la vez y coordinado por la EMEA. Hasta la fecha se han

autorizado más de 70 productos biotecnológicos y se espera que este número

siga aumentando durante los próximos años. Además, la investigación en

nuevos sistemas de expresión permitirán obtener medicamentos biotecnológi-

cos de fuentes "menos convencionales" como por ej. animales transgénicos o

plantas. Así, la EMEA autorizó en junio de 2006 el primer medicamento bio-

tecnológico (antitrombina III humama recombinante) producido en la leche

de cabras transgénicas. Otros productos obtenidos en conejos transgénicos,

tales como C1 inhibidor, lactoferrina y fibrinógeno humanos, se encuentran

en fase de desarrollo clínico o preclínico. Otros medicamentos considerados

de alta tecnología incluyen las denominadas "terapias avanzadas" que inclu-

yen terapia génica, terapia celular somática e ingeniería de tejidos. Las solici-

tudes de comercialización para estos productos se evalúan también mediante

el procedimiento centralizado (solamente la autorización de ensayos clínicos

es responsabilidad nacional).

La legislación comunitaria actual permite la autorización de medica-

mentos biosimilares, es decir, medicamentos biotecnológicos equivalentes a

otros ya autorizados y cuya patente ha expirado. Su autorización es también

mediante el procedimiento centralizado coordinado por la EMEA. Hasta

ahora se han autorizado dos medicamentos (ambos son preparaciones de

hormona de crecimiento humana recombinante) siguiendo esta nueva vía de

autorización.

Marco legal y bases para la creación de una agencia europea deevaluación de medicamentos

Los fundamentos de la Unión Europea (UE) se recogen en el Tratado de

Roma, ratificado inicialmente por seis países en 1957. Aunque el tratado com-

prometía a sus signatarios a establecer un amplio rango de medidas de armoni-

zación, dejaba la organización de la sanidad y los sistemas de seguridad social

a la decisión de cada país. Cada estado miembro (EM), por tanto, desarrolló su

propia regulación farmacéutica.

Desde 1965 (fecha de adopción de la primera directiva de la UE), la legis-

lación farmacéutica comunitaria ha buscado dos objetivos fundamentales: la

protección de la salud pública y la creación de un mercado común que permita

la libre circulación de medicamentos.

La Comisión Europea (en adelante referida como Comisión) comenzó

en 1965 a promulgar Directivas (del inglés, Directives), es decir, leyes o

disposiciones comunitarias de carácter obligatorio, relacionadas con la re-

gulación farmacéutica. La Directiva 65/65/EEC del Consejo de 26 de ene-

ro de 1965 estableció el principio de concesión de autorizaciones de comer-

cialización de especialidades farmacéuticas en todos los EM sobre criterios

científicos de calidad, seguridad y eficacia, sin tener en cuenta considera-

ciones de tipo socioeconómico. Diez años más tarde, los EM consolidaron

la experiencia adquirida y se pusieron de acuerdo sobre principios comunes

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para la autorización y control de medicamentos de uso humano (Directivas

75/318/CEE y 75/319/CEE del Consejo de 20 de mayo de 1975). No obs-

tante, cada EM mantenía la responsabilidad de conceder o denegar la auto-

rización para comercializar cada medicamento en particular. Actualmente,

tanto las directivas citadas anteriormente como otras relacionadas con me-

dicamentos humanos han sido derogadas y sustituidas por la Directiva

2001/83/EC del 6 de noviembre, posteriormente modificada y ampliada por

la Directiva 2003/63/EC del 25 junio. Estas dos directivas constituyen ac-

tualmente la legislación básica que regula los medicamentos para uso hu-

mano. Otra directiva posterior, 2004/27/EC, y la Regulación (EC) No.

726/2004 modifican y delimitan también el ámbito de aplicación de la di-

rectiva 2001/83/EC.

En 1977, el denominado Comité de Especialidades Farmacéuticas o

CPMP (Committee for Proprietary Medicinal Products), formado por repre-

sentantes de todos los EM y de la Comisión, a solicitud de un EM o de la Co-

misión, podía emitir un dictamen consultivo sobre temas relacionados con la

autorización de medicamentos y sobre el control de reacciones adversas de los

mismos (farmacovigilancia).

En 1981, se adoptaron provisiones similares para medicamentos de uso

veterinario (Directivas 81/51/CEE y 81/52/CEE del Consejo de 28 de septiem-

bre de 1981), incluyendo la creación del Comité de Medicamentos Veterina-

rios o CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Products). Al igual que pa-

ra medicamentos humanos, estas directivas han sido sustituidas por otra más

reciente, la Directiva 2001/82/EC.

La creación de estos comités supuso también el inicio de un procedimien-

to coordinado de evaluación, con dictamen no vinculante, que marcó un paso

importante en la cooperación entre EM. Aparte de los procedimientos de regis-

tro nacionales, las compañías farmacéuticas podían utilizar dos tipos de proce-

dimiento de registro comunitario: el "procedimiento multi-estado" (amplia-

ción de la autorización existente en un EM a dos o más de los restantes EM) o

el "procedimiento de concertación" (evaluación coordinada de la solicitud de

autorización en todos los EM; ningún EM podía tomar una decisión individual

sobre una autorización de comercialización antes de su discusión previa y dic-

tamen por el CPMP). Este último procedimiento estaba reservado a los medica-

mentos obtenidos por procesos biotecnológicos y para otros medicamentos de

alta tecnología.

200



Con el objeto de colaborar con el CPMP en determinados aspectos de la

evaluación de medicamentos, se crearon grupos de trabajo sobre calidad, se-

guridad y eficacia con objeto de aproximar la forma en que cada EM ponía en

práctica las obligaciones derivadas de las directivas comunitarias. Estos gru-

pos de trabajo han tenido su continuación en grupos equivalentes en el seno

de la EMEA.

Primeros pasos en la creación del Grupo de Biotecnología

En 1985 se creó el denominado Ad Hoc Working Group on Biotechno-

logy/Pharmacy (precedente del grupo de Biotecnología de la EMEA) con dos

objetivos fundamentales: asesorar al CPMP sobre solicitudes de autorización de

productos biotecnológicos y establecer recomendaciones específicas sobre la

producción y control de calidad y seguridad de estos productos.

Esta segunda finalidad se llevó a cabo mediante la elaboración de di-

rectrices o "guidelines" (i.e. disposiciones de carácter no obligatorio basa-

das en los conocimientos científicos del momento sobre un aspecto concre-

to). Se ha preferido la uti l ización de directrices, que no obligan

jurídicamente, en vez de un instrumento jurídico formal, como una directiva,

con el fin de mantener la flexibilidad y no poner obstáculos legales al pro-

greso científico. Se admite que en algunos casos, como resultado de los

avances científicos, pueda ser adecuado otro enfoque. Sin embargo, cuando

un solicitante decida no seguir una determinada directriz debe explicar y

justificar dicha decisión en los informes que presente la compañía en apoyo

de su solicitud.

El Ad Hoc Working Group on Biotechnology/Pharmacy estaba formado

por expertos (alrededor de 20) procedentes de diferentes áreas relacionadas

con la Biomedicina, desde autoridades reguladoras, laboratorios nacionales

de control o investigadores, y un representante (observador) de la Farmaco-

pea Europea (PhEur). En esta etapa inicial se completaron y/o iniciaron va-

rias directrices sobre citoquinas, anticuerpos monoclonales y reducción del

riesgo de transmisión de encefalopatías espongiformes a través de medica-

mentos. Este grupo ha tenido continuación como el Biotechnology Working

Party (BWP) dentro de la estructura de la EMEA. Recientemente este grupo

ha pasado a denominarse Biologics Working Party (BWP), aunque sus funcio-

nes no han variado.

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LA AGENCIA EUROPEA DE MEDICAMENTOS. PROCEDIMIENTOSDE AUTORIZACIÓN

A finales de 1990 se publicaron varias propuestas relacionadas con la cre-

ación de la agencia y el nuevo sistema comunitario para autorización de medi-

camentos. En 1993 se decidió fijar la sede de la EMEA en Londres y comenzó

a funcionar como tal en febrero de 1995. La función principal de la EMEA es

coordinar y organizar el sistema de autorización de medicamentos en Europa.

Este sistema evalúa cualquier solicitud de comercialización bien mediante el

denominado "procedimiento centralizado" (autorización de comercialización

en todos los países de la UE a la vez; decisión unánime o por mayoría) o "des-

centralizado" (también conocido como "reconocimiento mutuo", equivalente

al anterior procedimiento "multi-estado" (extensión de la autorización existente

en un EM a otros). El procedimiento centralizado de autorización está regla-

mentado por la Regulación (EC) No. 726/2004. Este procedimiento es obliga-

torio para los medicamentos que se describen a continuación:

• medicamentos obtenidos a partir de tecnología del ADN recombinante, o

de la expresión controlada de genes que codifican proteínas biológica-

mente activas en procariotas o eucariotas, incluyendo las células de ma-

mífero transformadas, u obtenidos a partir de hibridomas o que emplean

anticuerpos monoclonales durante su producción

• medicamentos veterinarios empleados como potenciadores para aumen-

tar el crecimiento o rendimiento de los animales tratados

• medicamentos humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodefi-

ciencia adquirida, cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas.

A partir de 2008 también será aplicable a enfermedades autoinmunes u

otras alteraciones inmunitarias y para enfermedades virales.

• Medicamentos huérfanos (según la Regulación (EC) No 141/2000).

Existen actualmente cuatro comités científicos dentro de la EMEA:

CHMP (comité de medicamentos humanos; previamente CPMP), CVMP (co-

mité de medicamentos veterinarios), COMP (Committee for Orphan Medicinal

Products; encargado de la concesión este tipo de clasificación a un medica-

mento) y HMPC (Committee for Herbal Medicinal Products; encargado de

plantas medicinales). Cada uno de estos comités está formado por un represen-

tante de cada uno de los EM. La EMEA actúa como el eje central del sistema

202



europeo, organizando y coordinando el trabajo de evaluación que es llevado a

cabo por expertos nacionales de cada una de las agencias reguladoras.

EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO YVETERINARIO: EL CHMP Y CVMP

Desde la creación de la EMEA, ambos comités de medicamentos humanos y

veterinarios, CHMP y CVMP, respectivamente, continúan su labor mediante reu-

niones mensuales de varios días de duración. Una gran parte de la agenda consiste

en la discusión y emisión de dictámenes respecto a nuevas solicitudes de comer-

cialización, bien por el procedimiento centralizado o por el descentralizado. En el

procedimiento centralizado, dos miembros del comité (representantes de países

distintos) son designados como ponentes (rapporteur y co-rapporteur) para coor-

dinar la evaluación de cada solicitud. Tras la evaluación en el ámbito nacional, los

informes de cada uno de los ponentes son discutidos en las reuniones del comité

científico correspondiente (CHMP o CVMP), y se emite un informe final vincu-

lante sobre dicho producto. La decisión final se transmite a la Comisión, que con-

vertirá dicha opinión en una única autorización de comercialización para toda la

UE. Solamente quedan a decisión nacional los aspectos relacionados con el precio

del medicamento y su posible financiación por el sistema nacional de salud.

El procedimiento descentralizado está basado en el principio de reconoci-

miento mutuo de autorizaciones nacionales. Permite la extensión de una autori-

zación de comercialización dada por un EM (denominado EM de referencia o

RMS) a otro(s) EM identificados por el solicitante. Cuando no sea posible lle-

gar a un acuerdo porque algún EM no acepte la autorización nacional original

concedida por el RMS, los puntos de desacuerdo serán discutidos en el recien-

temente creado Grupo de Coordinación. Si el desacuerdo permanece, la deci-

sión del comité correspondiente (CHMP o CVMP) es siempre vinculante.

Independientemente del procedimiento seguido, la decisión final es toma-

da por la Comisión Europea o, en caso de desacuerdo importante entre EM,

por el Consejo de la UE.

Aquellos productos que vayan a comercializarse únicamente en un EM

pueden continuar utilizando la vía de autorización nacional (como se ha descri-

to anteriormente, los productos biotecnológicos nunca podrían utilizar esta vía

de autorización).

203

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Grupos de trabajo del CHMP

Con objeto de emitir una opinión sobre cualquier cuestión planteada a la

EMEA relacionada con medicamentos, el CHMP cuenta con el apoyo de gru-

pos de trabajo que le asesoran en aspectos específicos relacionados con la cali-

dad, eficacia y seguridad de medicamentos y que participan en las actividades

de armonización internacionales (ICH).

Actualmente existen diferentes grupos de trabajo del CHMP y uno conjun-

to del CHMP/CVMP:

• Grupo de Biológicos (Biologics Working Party o BWP - previamente

Biotechnology Working Party): asesora al CHMP y COMP sobre aspec-

tos relacionados con la producción y control de productos biológicos y

biotecnológicos.

• Grupo de Eficacia (Efficacy Working Party o EWP), responsable de

elaborar recomendaciones metodológicas en áreas terapéuticas estableci-

das y documentos de opinión sobre aspectos de eficacia de medicamen-

tos en áreas en desarrollo clínico.

• Grupo de Seguridad (Safety Working Party, SWP), discusión y reco-

mendaciones sobre aspectos de seguridad preclínicos.

• Grupo de Farmacovigilancia (Pharmacovigilance Working Party,

PhWP), grupo de discusión y evaluación de aspectos relacionados con la

seguridad o cambios en la relación riesgo/beneficio de medicamentos

autorizados.

• Grupo de Hemoderivados (Blood Products Working Group, BPWG),

encargado de aspectos de seguridad y evaluación clínica de productos

derivados de sangre o plasma humanos.

• Grupo de Vacunas (Vaccine Working Party, VWP), evaluación y discusión

de aspectos relacionados con la calidad, eficacia y seguridad de vacunas;

• Grupo de Terapia Génica (Gene Therapy Working Party, GTWP), gru-

po asesor en temas de terapia génica.

• Grupo de Terapia Celular e Ingeniería de Tejidos (Working Party on

Cell-based Products, CTWP); grupo asesor en temas de terapia celular e

ingeniería de tejidos.

• Grupo de Biosimilares (Similar Biological (Biosimilar) Medicinal Pro-

ducts, BMWP), grupo encargado de aspectos de seguridad y evaluación

204



205

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clínica de medicamentos biológicos o biotecnológicos que se presentan

como equivalentes a otro ya autorizado.

• Grupo de Farmacogenética (Pharmacogenetics Working Party, PgWP),

grupo asesor del CHMP en materias relacionadas con farmacogenética.

• Grupo de Calidad (Quality Working Party, QWP), grupo conjunto del

CHMP y CVMP para armonizar y asesorar sobre aspectos de calidad de

medicamentos humanos y veterinarios.

El grupo de Biológicos (BWP)

Desde 1995 hasta ahora el BWP viene celebrando unas 10-12 reuniones

anuales, de varios días de duración, en la sede de la EMEA. Este grupo está

formado por un representante de cada uno de los EM de la UE, un representan-

te de la Comisión, un representante de la Farmacopea Europea, personal técni-

co de la EMEA y, desde febrero de 2000, un representante de Noruega y otro

de Islandia se han incorporado como miembros de pleno derecho (presentes

desde 1999 en calidad de observadores).

El BWP es responsable de proporcionar asistencia técnica al CHMP sobre

aspectos relacionados con la fabricación y control de medicamentos biotecno-

lógicos y de origen biológico, incluyendo aquellos derivados de sangre o plas-

ma y productos inmunológicos. El BWP es también el grupo asesor del COMP

para productos de origen biológico o biotecnológico y de la OMS en aquellos

casos en que este organismo lo solicite.

Las actividades principales del BWP se describen a continuación:

• Elaboración de informes sobre los procesos de producción y control de

las solicitudes de comercialización de medicamentos humanos de origen

biológico y biotecnológico. Los aspectos relacionados con la calidad de

este grupo de medicamentos se discuten en la reunión correspondiente

del BWP y se emite un informe para su consideración por el CHMP

que, tras la discusión de los aspectos toxicológicos y clínicos del medi-

camento en cuestión, emitirá un dictamen final sobre la aprobación o re-

chazo de la solicitud correspondiente.

• Elaboración de directrices o recomendaciones europeas e internacio-

nales sobre temas específicos relacionados con productos biológicos

y biotecnológicos. Al igual que el resto de grupos de trabajo, una de

las tareas fundamentales del BWP es la elaboración de directrices o

recomendaciones, que serán después aprobadas por el CHMP, sobre

temas específicos relacionados con productos biológicos y biotecno-

lógicos. Con este fin, se suelen crear subgrupos dentro del BWP que

elaboran un documento inicial sobre un tema especifico que es discu-

tido posteriormente en las sesiones plenarias del BWP. En general,

las directrices elaboradas por el BWP son objeto de evaluación conti-

nua a medida que se producen avances científicos en temas específi-

cos. Expertos del BWP participan también en grupos de trabajo inter-

nacionales para armonizar criterios y recomendaciones entre la UE,

Norteamérica y Japón (actividades ICH) sobre este grupo particular

de medicamentos.

El BWP también proporciona asesoramiento al CHMP en forma de docu-

mentos de opinión o recomendaciones puntuales (Points to Consider) sobre as-

pectos concretos relacionados con un grupo particular de medicamentos (p. ej.

aspectos relacionados con la evaluación de posibles vacunas de gripe atenua-

das), introducción de nuevos requerimientos de control (p. ej. test de PCR para

la detección del virus de la hepatitis C en volúmenes de plasma para la obten-

ción de hemoderivados), etc.

• Asesoramiento científico. Las compañías farmacéuticas tienen la posibi-

lidad de solicitar asesoramiento científico en cualquier momento durante

el desarrollo de un medicamento previo a la presentación de una solici-

tud de autorización de comercialización o antes de introducir determina-

dos cambios en la fabricación de un medicamento ya autorizado. El ase-

soramiento en aspectos de producción y control de medicamentos

biotecnológicos lo realiza el BWP.

• Organización de "workshops" y reuniones sobre temas relacionados con

medicamentos biológicos y biotecnológicos. El BWP organiza reuniones

con expertos europeos e internacionales con objeto de discutir los últi-

mos avances científicos en determinadas áreas que permitan la elabora-

ción de recomendaciones especificas, p. ej. productos de terapia génica,

ensayos para la detección de marcadores de encefalopatías espongifor-

mes y su posible aplicación a medicamentos, etc. El BWP también lleva

a cabo reuniones con representantes de la industria farmacéutica impli-

cados en temas concretos con objeto de evaluar las implicaciones o con-

secuencias de la introducción de determinadas medidas de control o de

discutir la aplicación de las mismas de forma coordinada, p. ej. con re-

206



presentantes de fabricantes de gelatinas y derivados de grasas animales

empleados en la fabricación de medicamentos.

• Reuniones con otros grupos de trabajo de la EMEA y de la PhEur.

Miembros del BWP participan también en reuniones conjuntas con

miembros de otros grupos de trabajo con objeto de coordinar y facilitar

la adopción de recomendaciones concretas, p. ej. la discusión sobre as-

pectos de seguridad del tiomersal (empleado en la fabricación de deter-

minadas vacunas) se llevó a cabo junto con los Grupos de Seguridad

(SWP) y el de Farmacovigilancia (PhWP). Miembros del BWP también

forman parte de grupos de trabajo de la PhEur para coordinar activida-

des y recomendaciones en temas relacionados con el control de calidad

de productos biológicos y biotecnológicos en general.

WEBLIOGRAFÍA

www.emea.europa.eu Información adicional sobre el BWP y actividades de la EMEA

en general (incluyendo los documentos elaborados por los gru-

pos de trabajo)

pharmacos.eudra.org Regulación relacionada con la autorización de medicamentos

en la Unión Europea

207

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Impact of pharmacogenetics on drug use

INTRODUCTION

When looking at the demographic evolution one can observe that there

has been an impressive increase in life expectancy of the population in the

developed world during the last century. Currently, it is not expected that, on

IMPACT OF PHARMACOGENETICS ON DRUG USE ININDIVIDUALLY OPTIMISED PHARMACOTHERAPYArnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital Pharmacy.Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands

Traditional pharmacotherapy is rather inefficient; onaverage only 40% of patients will benefit from a particulardrug as compared with placebo. Interindividual variability indrug disposition and effect can be partly explained bygenetic variants. In the science of pharmacogenetics theinfluences of genetic differences on patients' drug responseare studied. The major causes of inefficient drug treatment(like lack of effectiveness or the occurrence of side effectsor toxicity) are heterogeneity of the disease, variations indrug disposition (pharmacokinetics) and drug response(pharmacodynamics).Genetic variants can be detected by amplification of DNAusing the Polymerase Chain Reaction (PCR) followed bysequence analysis. Other techniques, like micro-arrays,enable us to screen the whole genome.The influence of pharmacogenetics becomes more and moreimportant in clinical practice and on drug development. Inthis review we will discuss the principles ofpharmacogenetics and the practical implications, illustratedwith examples taken from clinical practice.Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!



210

average, we can add many more years to the general population. The formi-

dable increase in life expectancy was caused by a general increase in stan-

dard of living, including better hygiene standards such as the availability of

clean (and thus safe) drinking water and a reliable sewage system in crowded

areas. Although difficult to quantify, improved medical care may have contri-

buted as well. With a traditional medical approach, we are able to cure infec-

tious diseases and postpone deleterious effects of systemic diseases like dia-

betes, hypertension, COPD, etc. However, we may have reached a plateau

with this rather crude and population-based approach. When treating risk fac-

tors (e.g. hypertension) medically, we are grossly overtreating the general po-

pulation; only a minority will actually benefit from these treatments. A good

measure to evaluate treatment effect is the Numbers Needed to Treat (NNT):

the total number of people that are exposed to treatment to prevent one inci-

dent. For example >1000 patients younger than 60 years with hypertension

should be treated to prevent one death. From this perspective, traditional

drug treatment is rather inefficient and causes a serious morbidity problem

(due to inherent side effects).

The reason for this inefficiency is that we cannot point out beforehand

which patients will benefit from the treatment. For many drugs, the exact dose-

response relationship is uncertain. So, on top of inefficiency, there is also a cer-

tain degree of inaccuracy. Patients do not only show a considerable variation in

disease-development but also in drug disposition (pharmacokinetics) and drug

effects (pharmacodynamics) (Evans et al; 2003). As a result, some experts state

that only some 40% or less of all used drugs benefit individual patients (i.e.

60% or more of all drugs do not clearly benefit our patients).

The mapping of the human genome is slowly changing this scene. Based

on genetic analysis drugs can be produced tailor-made for specific patients,

based on their genetic constitution. Many applications can be envisaged. Ge-

netic predisposition can be spelled out: which patients carry a serious disease

risk and should be treated with priority? Which patients will benefit most

from certain types of drugs? It may become possible to repair genetically de-

termined risk factors, or to repair genetic defects (gene therapy). Gene therapy

can also be employed to change the biochemical repertoire of a cell in such a

way that the body is producing its own drugs. But also in the use of traditio-

nal drugs, the scene will change. Factors like absorption and metabolism are

genetically determined by the structure of so-called P-glycoprotein pumps in

the cell membrane and polymorphism of the cytochrome P450 family of drug

metabolising enzymes in the liver. In addition, it may become feasible to as-

sess the sensitivity of target-tissues or even become possible to change it in a

desirable fashion.

GENETIC VARIATION

The whole DNA sequence is called the human genome. The arsenal of

proteins is the proteome. 99.9% of the genome of two unrelated persons is

identical, but still there is genetic variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs

(on average one variant per 1000 bases).

The most common type of variant is a single nucleotide polymorphism

(SNP), a single-base difference in the DNA sequence that can be observed be-

tween individuals in the population. A polymorphism has been defined as the

minor allele occurring in more than 1% of the population, whereas mutations

are rare. Many mutations have been discovered in coding sequences of genes

causing rare inherited diseases.

The specific set of alleles observed on a single chromosome is called a ha-

plotype. Haplotypes are formed by recombination when the paternal and mater-

nal chromosomes exchange corresponding segments of DNA. The coinheritan-

ce of SNPs on these haplotypes leads to associations between these alleles

(linkage disequilibrium). Not a single SNP but the haplotype is associated with

the disease. This advantage leads to optimal genotyping: carefully chosen SNPs

in a specific region will provide enough information to predict much of the in-

formation about the remaining SNPs in that region. These SNPs are called

'tagSNPs' and are used to screen the whole genome (Burton et al; 2005).

The human genome is diploid (one paternal and one maternal allele). A

SNP can be present on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no polymorphism

on both alleles, this individual is called homozygous wildtype. One speaks of

homozygous mutant if both alleles are affected. An individual with one wildtype

and one variant allele is heterozygous. A SNP could lead to no functional enzy-

me activity or decreased enzyme activity. To simplify different combinations

the term semiquantitative gene dose (SGD) is introduced. Functional alleles ha-

ve a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0 (e.g. CYP2D6*4) and 0,5

for variant alleles with decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).

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SOURCES OF VARIATION

The major causes of ineffi-

cient drug treatment are heteroge-

neity in disease, variations in drug

disposition (pharmacokinetics)

and drug response (pharmacody-

namics). The figure shows the re-

lationships in relation with the

drugs response / therapy outcome

and the targets we can use to opti-

mise pharmacotherapy. In the fo-

llowing sections we will present

some illustrative examples of ge-

netic variability with practical

consequences for the quality of

pharmacotherapy.

Heterogeneity in disease

One of the interesting examples of diseases showing the importance of ge-

netic heterogeneity is Alzheimer-disease. Currently, we know that at least 3 ge-

ne-mutations are involved. In addition, there are polymorphisms in susceptibi-

lity genes. Such genes may not cause the disease themselves but may make an

individual more sensitive to acquire the disease if conditions make this permi-

ssive.

The E4 variant of APOE (apolipoprotein E) is associated with an increa-

sed risk of Alzheimer disease. Homozygosity of the E4 allele increases the risk

of Alzheimer by a factor 33 in Japaneses, 15 in Caucausians and 6 in African

Americans. Although this increased risk is known for 12 years, its identifica-

tion did not help to develop effective medicines or prevention strategies.

Alzheimer is also an illustrative example to show heterogeneity in drug

response. When the cholinesterase-inhibiting drug tacrine was investigated in

clinical trials, the overall efficacy was disappointing: only about 1/3 of the pa-

tients benefited from the drug, in 1/3 there was no apparent effect and the drug

had to be discontinued in another 1/3 due to side effects. Only later (when the

212



Figure 1. Variability indrug response scheme.

drug was already dead) is was found that patients with a ApoE 2/3 genotype

showed a 80% response while the ApoE 4 genotype predisposed for no effect /

worsening of the disease and suffering from side effects. This example shows

the potential promise of genome technology. Some drugs are very efficacious

in some patients, but not in others. But how can we learn this beforehand? That

means that we have to study the origins of variability in drug response in more

detail, and these may have to do with disease state, pharmacokinetics and phar-

macodynamics.

On the other hand success stories are also know. The drug trastuzumab has

a high affinity for the HER2 transmembrane protein. HER2 (human epidermal

growth factor) is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) fa-

mily of tyrosine kinases and is involved in regulation of cell proliferation. In pa-

tients with overexpression of HER2 or an amplification of the gene, breastcan-

cer is more aggressive: enhanced growth and proliferation, increased invasive

and metastatic capability and stimulation of angiogenesis. In these patients treat-

ment with trastuzumab leads to a response rate of 34%. In combination with cy-

totoxic agents the response rate is further increased (Hortobagyi et al; 2005).

Heterogeneity in Pharmacokinetics

Absorption / P-glycoprotein and Multi-Drug Resistance (MDR) Genes

The P-glycoprotein efflux pump, which is encoded for by the MDR1 gene,

plays an important role in the export of substances from the inside of cells and

from membranes to the outside. PGP (P-glycoprotein) protects cells from toxic

substances and many drugs by permitting or inhibiting transportation through

the intestine and other epithelial barriers. To date at least 105 variants of the

MDR1 gene have been discovered. Not all these SNPs lead to an effect on

PGP; most of them are intronic or non-coding. Of the 15 most common variants

the C3435T mutation at exon 26 is well known. This silent mutation leads to an

alteration in the effect of PGP. The TT genotype (homozygous variant allele) is

associated with a twofold lower MDR-1 expression level in the duodenum

compared with the CC genotype (wildtype) and resulted for instance in a hig-

her digoxine plasma concentration (Kerb; 2006).

HIV-protease inhibitors are known substrates of PGP resulting in a low

bioavailability and a limited penetration in targets. Patients who were ho-

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mozygous for the 3435TT genotype had low plasma concentrations of nelfi-

navir and efavirenz, but for not fully understood reasons, they had a better

antiviral response and CD4+ immune recovery than patients with the CC- or

CT genotype (Fellay et al; 2002). This can be explained by low PGP levels

in the membrane of (infected) cells and therefore enhanced concentration

build-up of anti-retroviral drugs in these cells. The frequency of the TT ge-

notype is very low in Africans comparing to Caucasians (25%), which ex-

plains the difference in response between Caucasians and black Africans to

these drugs.

Metabolism / polymorphism in drug metabolising enzymes

Many drugs are metabolised by the oxidative cytochrome P450-enzyme

complex. One member of this family, CYP2D6, is extremely polymorphic,

with more than 75 allelic variants. CYP2D6*4 is the most common variant

(21% allele frequency in Caucasians), which leads to a non-functional allele.

Subjects homozygous for a non-functional variant allele lack enzyme activity

and are defined as 'poor metabolisers' (PMs). The CYP2D6 PM phe-

notype results in an increased plasma concentration of drugs predo-

minantly metabolised by CYP2D6 e.g. tricyclic antidepressants, co-

deine, tramadol. In case of a narrow therapeutic window this will

lead to toxicity.

CYP2D6 gene duplication/multiplication occurs relatively infrequent

among northern Europeans (1-2% of the Swedish population), but increa-

ses in southern direction: 7-

10% of Spaniards and Sout-

hern Italians, and as high as

29% of Ethiopians. Such

subjects can have an inade-

quate response to standard

doses of drugs metabolised

by CYP2D6 and are called

'ultrarapid metabolisers'

(UMs) (Dahl et al; 2002).

These polymorphisms

are illustrated in Figure 2.

214



Figure 2. Schematicpresentation of therelationship between thedebrisoquine metabolicratio and CYP2D6 genotypein caucasians (Dahl et al;2002).

The following case is a nice example showing the influence of CYP2D6

polymorphisms in daily practice (Gasch et al; 2004).

A 62-year-old man with a history of chronic lymphocytic leukaemia had com-

plaints of fever, fatigue, dyspnea and a cough. Therapy with ceftriaxone, clari-

thromycine and voriconazol was initiated for pneumonia infected by yeast. The

patient received a modest dose of codeine (25 mg 3 times daily) to relieve the

cough. After 4 days, the patient's level of consciousness deteriorated. His neurolo-

gical status (a score of 6 on the Glasgow Coma Scale) was poor. After the admi-

nistration of naloxone, the patient recovered rapidly. Extremly high plasma levels

of codeine and morphine were found despite of the modest dose of codeine. After

analysis of the patients CYP2D6 genotype, the patient seemed to be an ultrarapid

metaboliser. Along with the CYP2D6 gene duplication, a drug interaction may ha-

ve contributed to the observed toxic effects. Voriconazole and clarithromycine both

inhibit CYP3A4, thereby decreasing the amount of the metabolite norcodeine (and

increasing codeine concentration). At last due to renal failure the excretion of the

morphine metabolites was reduced, leading to the observed respiratory problems.

A similar example demonstrating the impact of the CYP2D6 genotype on

codeine toxicity was published in the Lancet (Koren et al; 2006). A full term

baby boy died due to an increased morphine concentration (70 mg/ml instead

of 0-2,2 ng/ml). The mother, who was breast-feeding her child, was prescribed

codeine in a standard dose. After genotyping for CYP2D6, the mother seemed

to be an ultrarapid metaboliser (gene duplication). This genotype leads to in-

creased formation of morphine from codeine, which she passed on to her boy.

Genetic variations do not only determine drug response and toxicity but

also side effects. A polymorphism (C677T) in 5,10-methylenetetrahydrofolate

(MTHFR) polymorphism for example, can determine MTX toxicity. MTHFR

is a folate-metabolizing enzyme that is inhibited by MTX metabolites. The ac-

tivity of the enzyme is reduced in the TT and CT genotypes to 30% and 60%

respectively. Patients with these genotypes often experience MTX toxicity as a

result of low folate levels. As the prevalence of MTHFR variant allele is very

high, (TT 10-12% and CT 40%) genotyping with subsequent adaptation in the-

rapy will reduce the risk of MTX toxicity (Ulrich et al; 2001).

Unless proven evidence that genotyping contributes to better drug respon-

se, genotyping is hardly performed in clinical practice to predict drug response.

It is mostly carried out afterwards to explain clinical symptoms as seen in the

cases mentioned above.

215

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Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) genotyping comprises an excep-

tion: it is clinically used to prevent life-threatening myelosuppression in pa-

tients with acute lymphoblastic leukemia, treated with mercaptopurine (Puri-

Nethol®) or azathioprine (Imuran®).

The immunosuppressant thiopurine drugs mercaptopurine and azathioprine

are metabolised by thiopurine S-methyltransferase (TMPT) and xanthine oxidase

(XO). Variation in TPMT is of much greater impact than XO. Three important

SNPs are found in the TPMT gene: TPMT*3A, *3B and *3C. The presence of

one of these mutations leads to reduced enzyme activity. Subjects homozygous

for the variant allele TPMT*3A (0,3% of the Caucasians) are of increased risk of

myelosuppression, a known side effect of thiopurine drugs. *3C is the most co-

mmon variant allele in Asian subjects, while *3B is very rare (Wang et al; 2006).

Phenotypic assays for TPMT, performed on red blood cells, have also

been developed. However, the phenotypic assay is labor-intensive, requires

qualified knowledge and expensive instruments.

Some authors have doubts about the benefit of genotyping, since TPMT

polymorphism fails to explain all cases of myelosuppression. However, cer-

tainty is rare in clinical medicine. TPMT genotyping predicts myelosuppression

and is proven to be cost-effective (van den Akker et al; 2006).

Heterogeneity in Pharmacodynamics

Pharmacodynamics of a drug is regulated by the whole genome. We know

for example that drug response depends on the presence of sufficient numbers and

sensitivity of receptors. Receptors are proteins that are encoded for by genes. This

means that the gene expression level determines the amount of receptors and is

thus closely associated with drug response. Gene expression itself however, is de-

termined by several transcriptional, translational and post-translational regulatory

effects of other genes. In this way the whole genome is involved in drug response.

Small genetic variations, such as variability in receptors, can have a large

impact on the pharmacodynamics of a drug. It is no surprise that the list of

drugs that are subject to such an effect is increasing almost daily.

In some cases a SNP or a point mutation can modify drug response. Gene-

tic variability in receptors is either inherited or acquired. Resistence to imatinib

is for example associated with mutations in the kinase domain of BCR-ABL

that interfere with drug binding. Acquired mutation in a theronine residue of

216



the ABL kinase is the cause of resistance to imatinib in about 67% of the cases

(Gorre et al;2001). Increased expression of BCR-ABL from genomic amplifi-

cation could also be a mechanism for resistance.

One of the first well documented examples that in literature relates to the

efficacy of cholesterolsynthesis-inhibitors of the statin-type. Carriers of so ca-

lled B1-alleles on the receptor benefit more from statin-therapy than indivi-

duals that have just one allele (Kuivenhoven et al;1998).

Another example relates to the tachyphylaxis of beta-2-agonists, a well

known effect from drugs like salbutamol. The 2-receptor has three main poly-

morphisms and two of them (Arg16Gly and Gln27Glu) are found in the gene-

ral population. The two SNPs are in strong linkage disequillibrium and can be

considered together in haplotypes. It is demonstrated that homozygous carriers

of Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16 carriers. Arg16Gly and

Gln27Glu are associated with a decreased effect of 2-agonists.

Patients with variant alleles of the promoter gene of ALOX5 (5-lipoxyge-

nase) have a diminished gene transcription, and therefore a decreased receptor

activity, which leads to a decreased response to treatment with leukotriene an-

tagonists (like montelukast) (Drazen et al;1999).

DETECTING GENETIC VARIATION

One of the most frequently used techniques in identifying genetic variability

is the Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR is a simple method by which a

part of DNA or a transcript (RT-PCR) is amplified. Subsequent sequence analysis

on the PCR product will reveal the presence of mutations or polymorphism. PCR

is not only used to detect sequential variability but also variability in gene ex-

pression. By applying real-time PCR, we are able to measure gene expression

precisely. In this way single nucleotide polymorphism can be detected in genes

encoding drug metabolising enzymes, transporters and receptors.

Micro-arrays have been developed to detect many SNPs in a short time

period. The Amplichip CYP450 GeneChip® is an oligonucleotide microarray

hybridization method for genotyping CYP2D6 and CYP2C19. This test distin-

guishes 29 polymorphisms in the CYP2D6 gene including gene deletion (*5)

and gene duplication. In this way the phenotype of a patient (PM, IM, EM or

UM) can be predicted. For CYP2C19 the test discriminates between PM and

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EM by determining 2 common polymorphisms in CYP2C19 (*2 and *3). The

main disadvantage of the test is its price (600 euro per patient). It is expected

that these costs will decrease due to a higher demand and mass production.

For detecting disease related genes 'whole genome screening' can be used.

Commercially available kits based on hybridisation technology (Illumina®, Affy-

metrix®) contain more than 550 000 tagSNP's evenly distributed across the geno-

me (1 tagSNP every 5.5 Kb). None of these arrays covers all variation in the hu-

man genome, but come close by using haplotype tagging SNP's.

A different technique to detect chromosomal aberrations is spectral karyoty-

ping (SKY). SKY is based on the hybridisation of certain molecules (probe) to

chromosomes, creating colour in exposure to light. As a result, each chromosome

has a specific and distinguished colour. Parts of chromosome can be translocated,

or swapped between one chromosome and another. Other chromosomes can be

deleted or duplicated either in whole or in part.

SKY is routinely used to identify birth defects and genetic abnormalities behind

certain cancers, like leukaemia. Based on chromosomal aberrations in leukaemia di-

fferent therapeutic approaches are undertaken. For example, patients with a transloca-

tion between chromosome 15 and 17 t(15;17), are successfully treated with all-trans

retinoic acid (ATRA). Targeted therapy in these patients leads to an enhanced event-

free survival (80-90% at 3 years). Without such targeted therapy the overall survival

is relatively poor, ranging from 6-20%. Recently, many clinical studies are going on

with Imatinib, a signal transduction inhibitor with effect against tyrosine kinase acti-

vity. Imatinib is developed especially for leukemic patients with a translocation be-

tween chromosome 9 and 22. The so-called t(9;22) or Philadelphia positive leukae-

mia generates high amounts of an abnormal tyrosine kinase protein and is associated

with a very poor prognosis. It seems however that Imatinib is changing the prospects

of Philadelphia positive leukemic patients. Ongoing trials indicate that after some

time resistance occurs frequently (see before). Research is aimed at new kinase

inhibitors or combination of compounds to overcome this resistance (Tallman; 2002).

INFLUENCE ON DRUG DISCOVERY

Pharmacogenomics can enhance drug discovery in two ways:

• Identification of new drug targets.

• Subpopulation-specific drug development.

218



Pharmaceutical companies are interested in carrying out smaller, less ex-

pensive trials using pharmacogenetics. Identification of a genetic variant asso-

ciated with drug response can lead to smaller phase III studies involving only

those individuals who are more likely to respond that lead to improved effi-

cacy, decreased toxicity and less side effects.

Many genetic variants vary in frequency among ethnic populations. If a

marker for drug response has a low prevalence in a certain population, that po-

pulation might be excluded from research or treatment.

An example is the drug BiDil, a combination of isosorbide dinitrate and

hydralazine. This drug was not sufficiently effective in treating heart failure in

two large ethnically mixed clinical trials. But in a subpopulation of African

Americans BiDil decreased the risk of death by 43%. The FDA approved this

drug for a single racial group (Service; 2005).

CONCLUSION

Pharmacogenetics constitutes a rapidly evolving research field. Thousands

of studies are published annually with great promise. However, incorporation

of these discoveries in medical practice has been slower than expected.

Promising prospects are complicated by several factors. Diagnostics have

to be changed in such a way that genotyping of relevant PK/PD systems is in-

cluded. Who will translate this kind of sophisticated information to a prescri-

bing physician? By now, proper dosing and avoiding drug interactions is alrea-

dy a formidable task. The number of disease-targets will become almost

incomprehensible for the average physician. That means that an incredible in-

formation dissemination barrier has to be solved. As a result, a new speciality

will develop: genetic information specialist. Not aimed at diagnosing inherited

diseases but at inherited risk factors and drug-treatment success-factors. And

last but not least: the costs of these developments -both for diagnosis and for

more individualised drug preparations- will be impressive. There will be no

way to deny patients the results of these new developments because they may

prove highly efficacious and possibly also cost-effective (although very costly

on an individual basis).

Hospital pharmacists and other healthcare professionals should be aware

of the upcoming developments and should prepare both for a proper informa-

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tion structure and sufficient expertise to advise doctors in the rapidly approa-

ching era of genetically based medicine (pharmacogenetics). And of course of

the formidable resources needed to pay for this.

Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!

ACKNOWLEDGEMENT

We wish to thank Dr. A. Vermes, hospital pharmacist, for critically reading

the manuscript.

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Notas

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CURSO DE CURSO DE

DR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓNDIRECCIÓN DEL CURSODR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓNDIRECCIÓN DEL CURSO

7ª Edición7ª Edición

Madrid, 13-16 de febrero de 2007Madrid, 13-16 de febrero de 2007

Este curso es posible gracias a una aportación educacional deEste curso es posible gracias a una aportación educacional de7º

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